金乌骨通胶囊中原儿茶酸和原儿茶醛的含量测定.doc

金乌骨通胶囊中原儿茶酸和原儿茶醛的含量测定.doc 金乌骨通胶囊中原儿茶酸和原儿茶醛的含量测定 【摘 要】 目的:建立测定金乌骨通胶囊中原儿茶酸和原儿茶醛含量的方法。方法:采用高效液相色谱法;色谱条件:安捷伦 C18柱(250mm× 4.6mm，5μm)，甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液为流动相(梯度洗脱)，流速:1.0ml/min;柱温:35?;检测波长:256nm。结果:原儿茶酸在0.0793,0.4758μg范围内、原儿茶醛在0.00526,0.3153μg范围内呈良好的线性关系;原儿茶酸平均回收率为97.01%，RSD 为1.41%(n=6);原儿茶醛平均回收率为98.19%，RSD为1.82%(n=6)。结论:原儿茶酸峰与原儿茶醛峰及其他杂质峰能够有效分离，其方法简便，准确度、灵敏度高，重现性和稳定性好，能够满足本品有效成分质量控制的要求。 【关键词】 金乌骨通胶囊;高效液相色谱法;原儿茶酸，原儿茶醛;含量测定 【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2016)04-0029-02 金乌骨通胶囊由金毛狗脊、乌梢蛇、葛根、淫羊藿、姜黄、补骨脂、木瓜、土牛膝、土党参、威灵仙等十味药组成，具有滋补肝肾、祛风除湿、活血通络的功效，临床用于肝肾不足、风寒湿痹、骨质疏松、骨质增生引起的腰腿酸痛、肢体麻木等症状[1]。其中，金毛狗脊、木瓜的活性成分主要是原儿茶酸和原儿茶醛[2-3]。现代药理实验表明，原儿茶酸和原儿茶醛具有增加冠脉流量、抗炎等活性，体外具有抑血小板聚集、抗菌等生 理活性[4-5]。有文献采用薄层色谱法鉴别金乌骨通胶囊中的原儿茶酸和原儿茶醛[6];研究采取高效液相色谱法测定其原儿茶酸和原儿茶醛含量，有助于更好的控制该药品质量。 1 仪器与试药 1.1 仪器 安捷伦1260 高效液相色谱仪;梅特勒AG135电子天平;岛津UV-2401紫外分光光度计。 1 .2 材料 原儿茶酸(批号:810-200205)、原儿茶醛(批号:110810-200205)对照品均购自中国药品生物制品检定所;金乌骨通胶囊由贵州盛世龙方制药有限公司提供;甲醇、乙腈均为色谱纯;水为娃哈哈纯净水，其它试剂均为分析纯。 2 方法与结果 5μm); 2.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18柱(250mm×4. 6mm，流动相:甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液，按表1梯度洗脱;流速:1.0ml/min，柱温:35?;检测波长:256nm。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 取原儿茶酸、原儿茶醛对照品适量，精密称定，置于同一容量瓶中，加甲醇制成分别含原儿茶酸15.86μg/ml和原儿茶醛 10.51μg/ml的溶液，作为对照品溶液。 2.2.2 供试品溶液的制备 取样品5g，精密称定，精密加50ml乙酸乙酯，称重，水浴回流30min，放冷，用乙酸乙酯补足重量，滤过，取续滤液25ml蒸干，加甲醇2ml使溶解并转移置5ml量瓶中，加1%的冰醋酸至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。 2.3 系统适用性实验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各20μl注入液相色谱仪，色谱图，供试品溶液色谱图中分别呈现与对照品溶液色谱图中保留时间相一致的两色谱峰，原儿茶酸与原儿茶醛两成分峰的分离度较好，与相邻杂质峰完全分离，阴性无干扰。见图1。 2.4 线性关系试验 取“2.2.1”的对照品溶液，分别精密吸取5、10、15、20、25、30μl注入色谱仪，记录色谱图，以进样质量数(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得原儿茶酸的回归方程Y =4748.43767X -8.12860，r= 0.99999;原儿茶醛的回归方程Y = 2003.05491X -4.81000，r= 0.99995。结果表明，原儿茶酸在0.0793,0.4758μg、原儿茶醛在0.00526,0.3153μg范围内质量数与峰面积呈良好的线性关系。 2.5 精密度实验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液20μl，连续进样6次，记录色谱图，测定原儿茶酸、原儿茶醛的峰面积，计算原儿茶酸、原儿茶醛的RSD分别为0.22%、0.21%。实验表明仪器的精密度良好。 2.6 稳定性试验 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液20μl，分别在0、6、10、16、22、25h各进样一次，测定原儿茶酸、原儿茶醛的峰面积，原儿茶酸、原儿茶醛的RSD分别为0.22%、0.21%。表明供试品溶液在25h内稳定。 2.7 重复性试验 取同一批号(130717)供试品，按“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，测得原儿茶酸、原儿茶醛的平均含量分别为0.0211mg/g、0.0029mg/g，RSD分别为 0.73%和1.23%(n=6)，表明此方法重复性良好。 2.8 回收率试验 分别取原儿茶醛和原儿茶醛对照品29.31mg和11.45mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5.00ml置500ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取同一批号(130717)的供试品5g，精密称定，精密加对照品储备液50ml，按“2.2.2”项下的方法，制备供试品溶液，精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，测定原儿茶酸、原儿茶醛的含量，计算回收率，结果见表1、2。测得原儿茶酸平均回收率97.01%，RSD=1.41%，原儿茶醛平均加样回收率98.19%，RSD=1.82%。符合分析要求。 2.9 样品含量测定 取5批样品，按照供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件测定计算，结果见表4。 3 讨论 3.1 测定指标选择 由金乌骨通胶囊的处方组成可知，要控制好该药品质量，必须控制好处方中主药质量，该药品质量标准的研究中也以葛根、淫羊藿、姜黄、补骨脂等的活性成分测定，即葛根素、淫羊藿苷、姜黄素、补骨脂素和异补骨脂素等的含量测定来控制质量[7]。金毛狗脊、木瓜中含有原儿茶酸和原儿茶醛也是该药品功效活性成分，有必要开展原儿茶酸和原儿茶醛含量测定指标，比文献中采用薄层鉴别更好的控制该药品质量。 3.2 检测波长的选择[8] 取原儿茶酸、原儿茶醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成含原儿茶酸、原儿茶醛分别为10μg/mL的溶液，摇匀，照紫外分光光度法(2010年版中国药典一部附录VA)，在190,500nm 处扫描，溶液在256、280、320nm的波长处均吸收波长处有最大吸收，考虑到该样品成分复杂性;结合从DAD检测器收集的图谱信息可知，原儿茶酸最大吸收波长为(256?2)nm，原儿茶醛最大吸收波长为(280?2)nm。当选择280nm波长处测定，取样量不变，则原儿茶酸几乎检测不到;而在256nm波长测定二者可兼顾，也不用增加取样量，这样减少对分析柱的污染，故选用256nm为检测波长。 3.3 流动相的选择[9-11] 采用甲醇-冰醋酸(90?10)和乙腈-冰醋酸(95?5)，试验结果表明两者均能达到分离效果，但由于该品种成分复杂，用单一的洗脱方式可以把原儿茶酸原儿茶醛分离，但对第二次进样干扰严重，为了消除相互干扰，采用梯度洗脱增加有机相洗脱残留成分，所以本方法采用甲醇-乙腈-1%冰醋酸按表1梯度洗脱达到消除进样之间的相互干扰。 3.4 提取方法的考察 精密称取样品5g，加50ml乙酸乙酯提取，精密称重，比较回流提15、30、60min的三个提取时间段，均用相应溶剂补足重量，滤过，取滤液25ml蒸干，加甲醇2ml使溶解并转移置5ml量瓶中，用1%的冰醋酸定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，结果表明，提取15min含量偏低，30、60min含量无明显变化，为了省时采取回流30min。提取溶剂的选择，比较甲醇乙醇提取溶剂，甲醇提取液颜色深，成分复杂，影响结果并易损坏色谱柱，乙醇提取含量偏低，故采用乙酸乙酯提取成分相对单一，便于分离检测。 经方法学验证，该检测方法可以测定本品中原儿茶酸、原儿茶醛含量，具操作简便、灵敏度高、能够更好的克服其它物质的干扰、重复性和稳定 性好等优点，可以有效的控制金乌骨通胶囊中金毛狗脊和木瓜药材的质量。 参考文献 [1]WS-10140(ZD-0140)-2002.国家药品标准(试行)颁布件[S].国家食品药品监督管理局. [2]杨慧洁，吴琦，杨世海，等.金毛狗脊化学成分与药理活性研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2010，15(6) : 12-14. [3]吴虹，魏伟，吴成义.木瓜化学成分及药理活性的研究[J].安徽中医学院学报，2004，24(2):62-64. [4]徐宗佩.中药单体原儿茶醛对瘀血证患者单核细胞趋化游走能力 1):49. 的影响[J].天津中医，2002，19( [5]赵秀艳，张艳霞，张桂艳.炎立消胶囊的临床应用[J].人参研究，2001，13(4) : 43-46. [6]段萍，徐作刚，万红才，等.TLC法鉴别金乌骨通胶囊中的原儿茶酸和原儿茶醛[J].中国药师，2013，(增刊):17-18. [7]段萍，徐作刚，矛向军，等. 金乌骨通胶囊质量标准研究[J].中成药，2013，35(12):2672-2677. [8]王治平，杨柯. RP-HPLC法测定滇桂艾纳香中原儿茶酸与原儿茶醛的含量[J].中药材，2005，5(5):25-26. [9]靳贵生.炎立消胶囊中原儿茶醛的高效液相色谱测定[J].山西医药杂志，2006，14(6) : 12-14. [10]张淑蓉，裴妙荣，裴香萍.反相高效液相色谱法测定炎立消胶囊 中茶酸、原儿茶醛和酪醇的含量[J].中国实验方剂学杂志，2008，14(6) : 12-14. [11]陈明，段萍，徐作刚，等.高效液相法测定乌蕨中原儿茶酸及原儿茶醛含量[J].中国民族民间医药杂志，2014，23(9):11-12. (收稿日期:2015.12.27)