基因工程重组人干扰素

基因工程重组人干扰素 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素: IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω 来源:白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 :抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱) 其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素:干扰素γ(IFN,) 来源:活化的T细胞和NK细胞产生 功能:免疫调节 , 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 , 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 , 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 , 趋化作用 , 抗病毒和抗肿瘤作用(次要) 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素(HuIFN)，小鼠干扰素(MuIFN)。 免疫调节作用现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。 , 对巨噬细胞的作用:IFNγ可使巨噬细胞表面MHC?类分子的表达 增加，增强其抗原递呈能力;此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc 受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤 细胞。 , 对淋巴细胞的作用:干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂 量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用 大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制 作用;而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免 疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的 分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活 性，增强细胞免疫功能;但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此 抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑 制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。 , 对其它细胞的作用:IFNγ对其他细胞也有广泛影响:?刺激中性 粒细胞，增强其吞噬能力;?活化NK细胞，增强其细胞毒作用; ?使某些正常不表达MHC?类分子的细胞(如血管内皮细胞、某 些上皮细胞和结缔组织细胞)表达MHC?类分子，发挥抗原递呈 作用;?使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分 化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。 二 重组干扰素的临床应用 , 广谱抗病毒活性(rhuIFNα) 慢性乙型、丙型、丁型肝炎;疱疹、病毒性角膜炎。 , 直接抗肿瘤活性(rhuIFNα) 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 , 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤(rhuIFNγ) , 多发性硬化症 rhuIFNβ 对已知基因序列的干扰素 , 基因文库的调用可以用其序列 3' 端和 5' 端部分事先用同位素 标记过的序列作为探针 , 通过杂交的方法进行调用。由于干扰素基因 ,| 可以用人的干扰素基因为同源探针 , 从鼠的种属特异性不是很大 基因文库中调出相应的干扰素基因 , 其方法将在下文 1 中提到。 | 对于扰素基因的取用 , 不仅可以使用构建基因文库的方法 , 对已了解其氨基酸或核昔酸割 成的干扰素也可以用化学合成的方法先合成其编码的 DNA 序列 , 再对其进行表达。化学合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法两大类。与利用基因文库的方法相比 , 化学合成法比较 | 复杂 , 由于每加入一个核昔酸就会有一定比例的错误掺入、基因重叠、基因缺失等情况 , 并且在 l 整个合成过程中这种错误不断积累 , 因此该方法适合比较短的基因 , 而对长的基因则有目的产 | 物含量低、产物纯化困难的缺点。但它也有优点 , 如可根据研究的需要对一些氨基酸进行定点 | 突变 , 或根据宿主菌的特性 , 在不改变其氨基酸组成的情况下使用宿主的偏爱密码子 , 以提高 | 产物的产量。 | 对于不同亚型的干扰素 , 由于同源性较高 , 可以用相同的引物从诱 导的小鼠细胞系中提取 mRNA 混合物进行反转录和扩增 , 然后用亚型特异性探针对 CDNA 混 Southern 印迹 , 这样便可将序列上相差较小的同种、不同合物进行 亚型的干扰素基因进行分离 , 为生产高纯度的单一干扰素提供了方法 O 三、表达方法 随着对干扰素研究的深入 , 人们了解到鼠干扰素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的 10~40 位、 78~107 位、 123~166 位的 A 、 B 、 C 区 , 尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸对抗病毒 | 活性十分重要。而人 IFNt1 的 121~136 位对抗病毒活性作用较大 , 人 IFN 子的 N 端 10 个集 | 基酸也是保持其活性所必需的。对干扰素结构的了解为更好地构建基因表达奠定了基础。干 | 扰素最初是用其外源序列进行表达的 , 但近年来的研究表明嵌合表达的干扰素往往优于单一 干扰素 , 因此出现了较多的嵌合表达形式 , 并取得了较好的效果。 1.IFN- α的表达家蚕作为一种用于表达外源基因的宿主有易于养殖、生产周期短、夕阳基因表达量高的优点 , 同时由于家蚕为真核生物 , 能对表达产物自行进行糖基化修饰 , 产生有生物活性的蛋白 , 并且在产物提取的过程中只要将家蚕进行匀浆 , 再进行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程领域内被广泛应用。下面便以人 IFN, α的生产为例介绍家蚕表达体系在干扰素生产中的应用。 用家蚕核型多角病毒 BIIINPV 体外感染的家蚕传代细胞株 BM-N 通过 噬菌斑法纯化得到 BmNPV 的τ 3 亚型。利用从感染脂肪体 mRNA 制得的 CDNA 为探针 , 对其多角蛋白序列进行检验 , 其中 10.5kb 的 3.9 灿的 HindE 片段可与探针杂交 , 将 10.5 灿的 EcoR I 片段及 EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 产生质粒 pBmE360 对其用 HindE , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 图 123 切 中为黑色框架 ), 将该片段插入 pUC9 的 HindE 位点 , 产生质 | 粒 p9H18 。将 p9H18 用 EcoR I 切后于 50U BAL31 外切核酸酶缓冲液中 23 ?水浴 10min, 更 | 掐锺油油菲如 n 入 07 倍他烈的。气 mnlAd p9H18 片段用 Hind E i切 , 并通过琼脂糖EDTA 终止反应。将截短的 凝胶电泳分离 2.7kb 的 Hind 皿平头末端片段 , 将其插入 pUC9 即 p9B310 的 Hind HI-Sma I 位点 O 另外 , 将 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片段连接到 pUC8 上 , 得到质粒 p8H225, 用 EcoR I 及 Aat E 切 , 得含有多角蛋白基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段 , 将其连接到 p9H18 的 4.7kb 的 EcoR IAat E 片段上 , 产生杂交质粒 p89B310, 它在启动子下游含有多聚接头 (EcoR I 、 BamH ISma I 、 Sal I 、 Pst I 位点 ) 。将从基因文库中用 183bp 探针调出的在 ATG 后含有 Sma I 位点 ( 即有序列 CCCGGGATG) 的 IFNm α J 基因片段连接到 p89B310 上 , 便构建成质粒 pIFN2B310 。将 pIFN2B310 与病毒基因组 DNA 便可共转染 BM- N 细胞系或家蚕幼体 , 其具体操作如下 : 向 2.5mL 含有 0.25molACaCl2 、 10 μ g BmNPV DNA 及 65 μ g pIFN2B310 的溶液中加含 0.28II1014NaCl 、 0.7mmoi/L Na2C03 、 0.7IIIII1014 Na2HP04 、 50mmol/L EfEPE (pH 7.1) 的缓冲液 , 进行沉淀。取 0.45ml 沉淀加至 4.5mi 含 3 × 106 个细胞的培养液中 ,12h 后换液一次 , 4d, 即可得到重组病毒 BmIFN2B310 。用 再培养 两个噬菌斑单位的病毒感染 3 × 106 个 BM-N 细胞或用 50 μ L3 × 培养 24h 后收集培养105 个噬菌斑单位的病毒溶液注人家蚕幼体 , 液便可得到干扰素。 2.IFN- 目的表达将人 IFN-R 基因 HimdE 片段插人载体 pSV2-dhfr 中 SV40 晚期启动子 PL 下游的 Pvu E 位点。用此重组质粒与带有黄 (XGPRT) 基因的质粒 pSU--gpt 共转染次黄瞟岭瞟岭磷酸核糖转移酶 磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 基因缺陷小鼠的骨髓瘤 (sp24) 细胞 O 经过霉盼酸及氨基喋岭培养基筛选 , 便可得到表达人 IFN-R 。具体操作步骤如下 : 将含有人 IFN- p 基因的重组质粒 pBV-92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分别作为探针及插入片段 , 同时用 PvuII 切载体 pSVZdhfr 质粒 , 使其线性化后将外源基因插入。将次黄瞟岭磷酸核糖转移酶基因缺陷的 sp2/0 细胞在含有 10% 小牛血清、 10% 青链霉素的 DLfEM 培养基中传 3~4 代后在小空斑瓶中培养 24h, 成半悬浮状 ,400r/ 勺 1in 离心 5min 将细胞沉积加入新鲜培养基 , 再培养 2~4h 。转染液中含目的基因 pSVHIF 和标记基因 pSVZgpt( 比值为 10:1), 其中 DNA 浓度为 20 μ g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 阵、 10mmolATris-HCl (pH 7.1)428 μ L 中缓缓加入 2 × HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、 Na2HP040.75mmolA 、 0.75IIlII1014 Na2HP04,pH 7.1) 约 500 μ L, 加入 sp2/0 细胞培养物中 , 轻轻摇匀 37 ?孵育 8h 。再更换为含有黄瞟岭 250 μ g/mL 、次黄瞟岭 15 μ g/mL 、胸昔 10 μ g/mL 、 25 问 /mL 的 DhEM 培养基 ,37 ? 氨基蝶岭。 -2 μ g/mL 、霉盼酸 cq 孵箱中选择性培养。一周后更换为含 250 μ g/mL 黄瞟岭的 D; 旧 周以上 , 检查 IFN-P 活性。 M 培养基 , 继续培养 2 3.IFN- γ的表达以鼠干扰素 MuIFN- γ为例 ( 图 12-3) 。用含人 IFN- γ编码区基因的探针与噬菌体γ MG9 构建的鼠 M600 基因组 DNA 文库在 20% 甲酷胶中进行低严格性的杂交 , 膜用 0.3molANaCl 、 0.1%NaEbS04 在室温洗涤两次。将结合的噬 0.03II1014 拧棱酸纳及 菌体用噬菌斑法纯化 , 提取 DNA 后 , 用多种限制性内切酶切 , 以 1% 葡聚糖凝胶电泳纯化后与人 CDNA 探针杂交 , 将γ MG9 中与探针可以杂交的 10.5kb 的 BamH I 片段亚克隆到 pBR322 的 BaIIIH I 位点 , 产生质粒 pMG10.5 。通过电泳分出插入片段大于 6000 坤 , 即含有完整 MuIFN-Y 的质粒 , 用 PvuII 酶切 , 六个切点中有一个位于 5' 端非编码区 , 取从此切点到第一内元中 Cla I 的 348bp 的片段以及用 Cla I 及 Bgl H 酶切得的 MuIFNm γ 3F 端片段 O 将载体质粒 p342E 用 EcoR I 及 BamH I 酶切 , 并用聚合酶 I 将 EcoR I 切点补成平头末端 , 与以上制得的两个片段混合 , 一同转化大肠杆菌 294, 选出 AIIIP 抗性菌株 , 从中提取质粒即为含有干扰素编码基因的 pSVEII111 γ。用表面活性剂右旋糖所活化 COEL1 细胞 , 将质粒转入并培养 48h 后离心 , 上清液中便含有干扰素。 4. 嵌合干扰素的表达嵌合干扰素大致可以分为两种类型 : 一种是两 种不同类型或同类型而不同亚型的干扰素间进行嵌合 , 另一种是干扰素或其部分序列与其他活性物质 , 如抗体、白介素等进行嵌合 , 以便得到新的生物活性产物。下面就这两种情况分别举例介绍。 将从基因文库中调出的编码淋巴细胞干扰素 B 和 D 的 CDNA 连接到 ATG 后大肠杆菌色氨酸启动子、操纵子、核糖体结合位点及起始密码子 面 , 分别构成表达载体 pLYEN-B 和 PLy- IFN-D 。为构建嵌合干扰素 , 可先将亲代干扰素的编码序列在相同位点 S1(Sa113A I ) 、 Pv(PVU E) 、 S2(Sa113A I ) 切断 , 产生含有氨基端 1~60 、 1~92 、 61~92 、 93~166 、 151~166 位氨基酸的片段 , 用 6% 的聚丙烯酿93~150 、 胶凝胶电泳分离 ( 图 124) 。将合适的片段连接 , 得到嵌合 DNA, 将含有嵌合 DNA 的质粒用 HindE 和 Pst I 切后将酶切片段连接到 pBR322 的 HindEm pst I 位点上 , 将得到的表达载体转入大肠杆菌中 , 同时对 DNA 序列进行测定。含有转入质粒的大肠杆菌 HT-2 在 M9 培养基中培养到 OD650 为 5~8 时 , 离心得到细胞 , 并用含 100mmoIA Tris-HC1 、 0.5molANaCl 、 5mmolAEDTA 及 0.1IIIEnol/L PMSF 的 pH 为 8.0 的缓冲液重新溶解之。在 0 ?加入 1mg/ml 溶菌酶 , 细胞在溶菌液中裂解。离心后将上清用单克隆抗体亲和层析柱纯化两次 , 将纯化后的活性干扰素溶于 PBS 后利用超滤膜 YM10 浓缩至 1~3 时 , 再将浓度调整到 0.1/ IIIgmlo 利用 SDS 聚丙烯酷胶电泳对于扰素的纯度进行测定。 IFN- γ及 TNF-R 基因已经分别被克隆 , 并用工程菌加以表达。对其 序列的研究表明 , IFN-R 在竣基端的 13 个氨基酸以及 TNF- 下在氨基端的 23 个氨基酸均对它们的生物活性没有影响 , 因此在构建 γ与 TNER 嵌合物时可以将其去除 , 利用色氨酸启动子构建的IFN- 含有 IFNE γ氨基端 134 个氨基酸及 TNF-P 竣基端 148 个氨基酸的 12-50 表达质粒结构见图 此外 , 基因工程在抗体技术上的应用使干扰素与抗体能够有机地结合 , 通过抗体的靶向作 用 , 增强干扰素的定向能力 , 提高干扰素体内作用的效率。 , 必须在一定的诱5. 提高干扰素产量的方法干扰素是一种诱生物质 生剂如病毒、细菌等作用不才能生成 , 所以在基因工程中 , 常常用一些强启动子如色氨酸启动子 , 将干扰素的表达从条件型变为组成型 , 以提高产量。 酵母是一种较为常用的表达宿主 , 但其外源基因的大量表达必须在缺少元机磷的条件下才能进行。通过对其酸性磷酸酶酶的阻遏基因及温度敏感型负调控基因进行改造 , 就可以使酵母菌在 35 ?的高温下生长 , 在 25 ?下诱导表达 , 并且其表达与无机磷的含量无关。实验表明未诱导时产量为 6 × 104UA, 而诱导后产量可达到 1 × 107UA 。 由于 IFN- α、自、γ性质各异 , 在进行表达时 ,IFN 干的产量往往远不及 IFN- α、 IFN- 日 , 因此就必须进行表达体系的改进。如利用含噬菌体 T5 早期启动子及强核糖体结合位点的高效转录二表达体系 , 可以使 IFN- γ的表达也达到 4 × 109U/L 的水平。其方法为用人工合成的 T5P25 强启动手 { 其中含有启动于及核糖体结合位点 ): 取代质粒 pJP1 在 EcoRV 与 HindE 之间的 Tef 启动子 , 形成质粒 pJR1R3, 将其用 HindE 线性化后插入 IFNEY 的编码序列 , 便可以得 IFN γ -IFNY 。将 IFN 基因置于 Tetr 基因的上到高效的表达质粒 游 , 有利于转化质粒的筛选和保持 ( 图 12-6)O : 其中合成的启动区序列为 E?R I35 区-10 区 GAAITCAAAAATrrA τTTGCTT τ? AGGAAAAATTTTI ?IGTATAAT E 丑 nd 皿 ATAAATTTGAAGCTAGGAGGTTTAAGCTT AGAI τ? 启动子核糖体结合位点 四、提取、纯化及鉴定对干扰素的提纯可分为粗提和进一步纯化 , 以 IFN- α为例 , 粗提时将菌液 5000r/min 离心取细胞 , 加入 1/100 体积的 7mol/L 盐酸肌冰浴 2h 裂解细胞后 17000r/min 离心 5min, 取上清液。用 5~10 倍体积的 0.15mol/L 棚酸盐缓冲液稀释后在 1OIIIII1014 的 NH4Ci 中透析 20h, 再 15000r/min 离心 10rIlino 将上清液用 80%(NH4)2S04 沉淀 , 用水溶解后再透析去除 (NH4)2S04, 再用离子交换的方式分离各种蛋白 O 如果要进一步纯化 , 可用单克隆抗体进行亲和层析。将 Sepharose4B 与纯化的抗 IFN- α单克隆抗体混合振摇 , 室温放置 4h 后低速离心 , 并用 0.1Enol/L= N 注 fC03(pH8.5) 的缓冲液洗去未结合的抗体 , 加入等体、积的乙醇胶并振荡 4h 以上 , 将残存的活性基团加以封闭 O : 用 pH 4.0 的醋酸盐缓冲液及 pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液交 i 替洗涤 3 次 , 并用 pH 7.5 的 0.1molATriSEHCi 加以平衡 1 后装 pH 7.2 的 0.01molJL PBS 洗柱至洗脱液‘ OIh80 到基线 , 将柱。用 含有 IFN 的混合液上样 , 如一次吸附不完 A 全可用流出液再上柱一 PBS 反复洗柱 , 至流出液的 1 吸收回到基线。用 pH 2.5 的 次。用 0.1molA Gly-HCl 洗脱并分 4 段收集 , 并对各部分浓度进行测定。最后用 pH 2.5 的 0.1molA Gly-HCl 再生 , 用含 0.01% 间的 PBS 冲洗净 ,4 ?保存。同时 , 利用亲和层析技术还可以对只占总蛋白 0.1%~1% 的干扰素进行分离和浓缩。 五、活性检测 1. 对 (3 二 5')oligo(A) 合成酶活性的诱导在含 1% 小牛血清 的 RPMI1640 培养基中培养 2 × 105 个 /ml Daudi 细胞 , 并分别加入 1U/m1 、 10U/ml 、 100U/ml 、 1000U/ml IFN 。 24h 后 9000r/ min 离心 2min, 并将沉淀分散于 500 μ L 冷的含 20mmoiAEfEP- ES 、 5mmol/L MgCl2 、 I20mmol 只 L KCl 、 7mm014 二硫苏糖醇、 10% 甘氨酸、 05%NP40(pH7.5) 的裂解液中 , 冰浴 2min 后 9OOOr/min 离心 8IIlino 取上清与 50 μ L poly(rI):poly(rC) 琼脂在 30 ?共浴 15min, 离心去除未吸附部分 , 而将结合物与 2.5mmolA[ α -32p]-ATP 及磷酸激酶在 30 ?水浴 20h 。将混合物上 30 μ L 酸性矶土柱 , 用 3mllmolA 盐酸肌洗脱 , 将洗脱液与未用 IFN 诱导的对照组进行比较便可测出 IFN 的活性。 2. 抗增生活性在含 15% 小牛血清的 RPMI1640 培养基中培养 5 × 104 个 /ml Dauda 细胞 ,48h 后加入 IFN, 再培养 72h, 用 2BI 型库尔特计数器对细胞进行计数 , 即可以得到 IFN 的抗增生活性。 10% 小牛血清的 DMEM 培养液中培养的 3. 细胞病变抑制作用将在含 WISH 细胞用 0.03%EDTA 、 0.25% 的膜蛋白酶 1mi 在室温下消化 , 倒出消化液 , 用 Eagle 液分散细胞 , 然后用含 10% 2~3min 后 小牛血清的 DMEM 液配成 5 × 105 个 /ml 的细胞悬液 , 用微量板在 37 ?含 5%C 马的培养箱内培养过夜。用不同稀释度的 0.1ml IFN 溶液加入各孔后再培养 7 h 。每孔加入 0.1ml 含 100~1000TcID50 滤过 (VSV) 进行病毒攻击。将病毒对照组与细胞对照组进行性口腔炎病毒 比较便可以测得其抗病毒活性。 六、新型干扰素 1. 活性增加的干扰素通过定点突变或干扰素的嵌合可提高干扰素的活性 , 如将重组干 扰素自 17 位的 Cys 改为 Ser, 可提高抗病毒活性 10 倍。新型杂合的 IFN- α D 对 NK 细胞的调节能力比亲本提高了 10~400 倍 , 如将 IFN- α 4 与 IFNtl 进行嵌合 , 得到的 IFN 活性分别是亲代的 4 倍及 20 倍。而用鼠 IFNt1 的 A 段与 IFN- 饨的 B 段进行杂交 , 活性可提高 10~100 倍。此外 , 如上面介绍的将 IFN 与 TNF 结合 , 可以产生不同的活性。 2. 稳定性增加的干扰素仍以上面提到的重组 IFN R 为例 , 亲代干扰素在一 70 ? 75d 后 大多数丧失抗病毒活性 , 而突变后在同样条件下保存 150d 仍不失 活。 3. 改变抗原性的干扰素如将 IFN 仇的 141 位上 Cys 用 Tyr 代替 , , 不与体内自然存在的 IFN 在 1 争夺受体 , 则其抗原性发生改变 虽然这种抗原性改变的机率很小 , 但仍不失为一种研究方向。 α D 在牛细胞株中活性最高 ,IFN- 4. 改变种属特异性的干扰素IFN- α A 在人细胞系中活 性最高 , 而其嵌合体与两个亲本都不相同 , 在鼠细胞中的活性最高。 第三节 应用一、临床治疗方面 干扰素作为较早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物质 , 虽然在基因的调取、构建、表达方面仍有较多的工作在进行中 , 但研究的热点已经转移到了临床应用及临床前的动物实验方面 , 并且在较多疾病的治疗方面取得了进展。 1. 抗病毒目前的研究主要集中于抗各类肝炎病毒方面 , 在抗 HIV 、抗 HSV 等方面也有 较多的研究。 2. 提高免疫系统机能在小鼠实验中重组 IFN- γ对 NK 细胞的活性、吞噬细胞的溶解性、丝裂原诱导的母细胞化均有促进作用 , 同时减少外周血及骨髓量。在牛体内的实验表明 , IFN- γ可以增强免疫抑制动物的免疫系统活性。 3. 抗肿瘤通过与糖基化的淋巴细胞毒素嵌合 ,IFN- γ可以提高小鼠对 HT-1080 纤维肉 瘤、 G,361 恶性黑色素瘤、 ZR-75-1 乳腺瘤等肿瘤的抗性。在临床前研究方面 , 重组 IFNek 缸用于扩散性间皮瘤已进入 E 期临床阶段。 IFN- γ与重组 TNF- α联合用于肿瘤治疗也已完成 I 期临床工重组 作。 通过调节单核细胞内腺昔酸环化酶的活性 , 重组 IFN-y 可以对特应性皮炎病人的症状起到一定的缓解作用。通过重组 IFN 吨 C 的抑制增生作用可以防止骨髓异常增生引起的血小板过量溶解。此外 , 抗寄生虫方面的研究表明 ,IFN γ作用于宿主细胞 , 可以增强其对寄生虫的 O 抵抗力 二、基础研究方面 利用 PCR 方法可以在干扰素或嵌合干扰素 , 如 IFN- α A 心的氨基端加上一段核昔酸序 列 :AGA AGG GCA AGT GTT, 其编码的氨基酸序列为 Arg Arg Ma Ser Val, 可以用于 c 灿 fP 的蛋白激酶识别。在 [ γ ,32p]-ATP 存在的情况下 , 干扰素被 32p 标记且不影响其活性。用这种带有放射性的干扰素可以对干扰素的识别位点及其药物动力学进行研究。 狗的 IFN- γ与细胞因子和细胞嵌合后可以被抗干扰素的单克隆抗体所识别 , 并且有如下应用 : ?水泡性口炎病毒噬菌斑抑制实验 ; ?在狗肾实质细胞中两类主要组织相容性复合物抗原基因上游进行调控 ; ?在试管中组织相关性淋巴细胞增生的放大中发挥作用 , 利用这个性质可以研究器官移植中细胞因子的活动情况 , 并可用于诊断和治疗。 对用基因工程方法生产干扰素已经进行了 40 多年的研究 , 并且取得 了较为喜人的成就。 IFN 成为第一个上市的基因工程药物 , 也是一种人们可以用得起的生物活性药物 , 标志了基因工程从实验室研究进入 , 因此是生命科学发展历程中的一个里程碑。但这并不医药临床实践 表示基因工程方法在干扰素方面的应用已经没有未开发的领域 , 相 , 这些成就的取得为新的研究方向的确立以及新的应用提供了思路反 及条件 , 并为其他生物活性物质的基因工程方法合成提供了一种有益的借鉴 , 在此过程中也促进了其自身的发展。相信在不久的将来 , 基因工程方法生产的干扰素会在疾病的诊断及治疗方面发挥更大的作用 , 同时也成为生命科学研究中的一种有效的工具。