土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述

土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述 大车神 [摘要]　 腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中，根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶) 殖酸、富里酸广泛存在于土壤、水体以及沉积物中，对有金属离子、机污染物、及水处理过程中消毒副产物的形成有重要的影响。本文通过查阅文献，总结目前学者对于腐殖酸的提取、分离与纯化的相关技术进行阐述。 【关键词】腐殖酸、富里酸、胡敏酸、胡敏素、分离提纯 一、概述 土壤是人类赖以生存的物质基础,是人类不可缺少、不可再生的自然资源[1,2]。土壤有机质是土壤的重要组成部分,在土壤肥力、环境保护、农业可持续发展等方面都具有重要作用。其主要成分包括有机质及其他有机物，其中腐殖质类物质占有机质总量的85%～95%。腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中[3]。根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶)[4,5]，其中可提取腐殖质(HA+ FA)组成复杂，存在氨基、羟基、醌基、羰基和甲氧基等多种基团，能够对水体中各种机污染物和重金属的迁移转化进行影响和控制[6-8]。 富里酸( Fulvicacid，简称 FA)属于腐植酸的一种，别名为黄腐殖酸，是土壤腐植质的组成成分之一。颜色较浅，多呈黄色。主要由碳、氢、氧和氮等元素构成，碳氢比值较低，分子式为C14H12O8[9,10]。溶解能力强，移动性大，对某些土壤的淋溶和沉积起很大作用，可以改善土壤环境。特性为低分子量和高生物活性。由于低分子量的特性，它能很好的粘贴及融合矿物质和元素到它的分子结构中，拥有很好的溶解性和流动性。 胡敏酸（Humic Acid，HA），由芳香核和脂肪族侧链组成，含有羧基、羟基、酮基、醌基等活性官能团，具有较大的吸附面积 ，是存在于土壤环境中的一类重要的非均质有机物。HA容易与有机污染物发生相互作用，影响环境中有机污染物的毒性、生物降解、迁移转化。提取土壤中的HA，对分析HA理化性质 和明确HA环境作用，具有重要的意义。 研究表明，腐殖质的主要元素有碳、氢、氧、氮、硫和磷。对于赋存于同一介质中的腐殖酸，胡敏酸碳含量略高于富里酸，氧含量略低于富里酸，但元素组成没有太大差别[11]。进一步研究揭示腐殖质的分子结构与元素组成，是人类认识世界的一部分。土壤的形成与有机质腐殖化过程密切相关，岩石经过物理化学风化后，风化残积物中的Fe、Al元素的溶解迁移与沉淀固定受腐殖质的控制。腐殖质在土壤中可呈游离的酸和盐类状态存在，但大部分呈凝胶状与矿质粘粒紧密 结合，成为重要的矿物——胶体物质，从而增加土壤团粒的水稳性和持水性。腐殖质还可通过增加植物根部细胞膜的渗透性、激活土壤呼吸、促进ATP的合成与三羧酸循环以及光和作用等途径来增加作物的生产。腐殖质能够提高化肥的利用效率，同时减轻化肥对土壤理化性状产生的不良影响[12]。因此，腐殖质的研究对农业生产和土地利用非常重要。腐殖质与疏水有机污染物（HOC）的相互作用，能够增加土壤中该类物质的溶解性与迁移率，从而增加地下水被污染的风险。分配系数(KOC)被用来定量描述有机污染物在液相与固相时的分配行为。特定体系下某一污染物的分配系数大小与其正辛醇－水分配系数（KOW）和体系固相有机质含量相关。虽然分配模型已经成功的解释了一系列有机污染物在水—土相的分配行为，但是很多污染物在不同来源的土壤样品中分配系数存在显著差异。这种差异可能是土壤有机质不同和外在因素不同所致。Rutherford等[13]的研究发现对于官能团含量不同的腐殖质组分与有机污染物分配系数之间关系，值得做进一步的研究。 二、腐殖酸的提取与纯化 1. 2. 1、腐殖酸的提取： 由于缺少标准方法，在以往的研究中，土壤腐殖质的提取方法各有不同，提取剂、提取液剂量、提取次数的选择各有特点，使得研究的数据可比性较低。为了使腐殖质的研究数据更具可比性，国际腐殖质协会提出了一个参考方法，其提取土壤胡敏酸、富里酸和胡敏素，具体操作可分为三步： 前处理过程 称取100g土样于2L烧杯中，加入配置好的1L 0.05mol/L的HCl，在25℃条件下间歇搅拌18-24h，然后离心过滤(转速:5000rpm，10min)，除去上清液，将沉淀物用去离子水清洗，反复离心至中性或呈弱酸性。此步骤是为了去处土壤中易溶于酸的杂质和Fe元素等，以减少对以后步骤的干扰。 碱溶过程 向土壤样品中加入1L0.1mol/L 的NaOH溶液，在25℃条件下持续搅拌24h。然后离心过滤(转速:15000rpm,15-20min)，这一过程至少进行两次，以保证沉淀物与上浮物完全分离。此时HA和FA均溶于碱液中。残渣主要为不溶于碱的腐黑物等。 酸析过程 弃去残渣，将所有的上清液收集到一个洁净的玻璃烧杯中。向烧杯中加入6mol/L 的HCl直至pH为1-2，此时HA由于不溶于酸，成絮状沉淀。FA溶解于酸液中。静置几小时后离心(5000甲m,10min)分离,即可得到黑色的固态HA和亮橙色的FA酸溶液。 这个方法被广大研究学者普遍采用，通常称为“稀碱法” 3. 2、关于“稀碱”的选用研究： 4. 关于提碱性取剂NAOH的选用，有学者做过不同提取剂的提取效果的研究。碱性提取剂有NaON和KOH，络合剂有碱性Na2P2O7和EDTA，有机提取剂有丙酮、二甲亚砜（DMAO）等。其中利用NaOH溶液提取土壤腐殖质是最古老、常用而有效的方法。Na+能够取代腐殖质的负电点位上的多价离子（如Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+）,以及高pH值促使腐殖质的很多酸性官能团解离,从而大大改变腐殖质的溶解状态,同时多价金属阳离子与OH-结合生成不溶氢氧化物沉淀而被除去[14]。Eloff等[15]比较了NaOH、丙酮、二氧杂环己烷等六种试剂提取效率表明，NaOH溶液从四种非洲细沙土中提取的腐殖质含量是丙酮等有机试剂提取量的几十倍， 是EDTA与硼酸混合液提取量的两倍多.通过凝胶色谱研究表明，NaOH溶液提取的腐殖质分子量最大，Na4P2O7提取物次之，偶极非质子溶剂（DMSO、DMF、acetone）提取的腐殖质分子量最小，而且腐殖化程度较低。有研究还对比了NaOH与KOH的提取效率[16]，采用KOH溶液提取腐殖质也能获得较高的效率，可是KOH来源少，成本高，且离子半径大，但其渗透能力较之低，因此在研究中运用很少见。 3、提取剂用量： 在国际腐殖质协会推出参考方法之前，采用NaOH溶液浸提腐殖质，其浓度没有统一。2000年，Rosa等[17]的研究指出，不同碱液提取的腐殖质量的大小顺序为：0.1mol/L NaOH＞0.5mol/L NaOH＞1.0mol/L NaOH，且经过240min后，腐殖质提取量已经达到最大值。马连刚、肖保华[18]使用同样的方法进行验证，得到不同的结果，其模拟实验结果为：等量碱液一次提取的有机质量的大小顺序为：0.1 mol/L NaOH，0.5 mol/L NaOH≈1.0 mol/L NaOH，且 0.1 mol/L NaOH溶液与土壤作用240min后，泥水混溶，无分层现象，经过24h静置，才出现薄层上清液。这可能与土壤性质有关，Rosa等所用泥炭土的有机质含量高，而后者所用的黄壤是一种高度脱硅富铝土，其有机质含量较低（约4％～5％），而铁铝含量高，在碱性条件下。能够产生大量胶体分散于泥水混合体系中，有机无机胶体混合在一起难以分离。因此，从不同的土壤或沉积物中提取腐殖质，NaOH的浓度还是一个必须考虑的因素。正如腐殖质协会在申明中说的那样，0.1mol/L NaOH溶液并不适合所有研究对象。 4、提取方法的优化： 尽管稀碱法被学者广泛使用，但是这种方法仍存在HA、FA提取率低、提取费时等缺点。因此，有学者对于提取方法进行了一些优化。Vanessa[19]提出了微波辅助提取HA的方法，但微波提取的温度为105 ℃会使HA某些性质发生改变。Mauro[20]用超声辅助提取HA，指出超声辅助提取的HA与IHSS推荐方法提取的HA理化性质接近，但是Mauro没有对提取的条件进行优化。王冕[21]等在提取土壤中HA时也是采用IHSS推荐方法，并发现HA提取量与土壤pH之间没有线性关系，而与土壤的有机质呈正比关系。谯华等[22]，对土壤中提取胡敏酸的方法进行了优化，引入超声作为胡敏酸提取的辅助条件，采用批次试验优化了土壤中胡敏酸的提取方法。结果表明，基于胡敏酸提取回收率和精密度，在室温下获得的优化提取方法为：液土比为8:1、提取次数为3次、NaOH溶液浓度为0.05 mol/L、超声功率为120 W、超声时间为30 min；在此优化条件下，胡敏酸的回收率为94.73%±1.50%，显著大于IHSS推荐方法的回收率64.76%±0.28% 5、腐殖质的纯化： 首先先介绍HISS提供的方法：向HA的沉淀物中加入0.5L HF-HCI混合溶液(0.1M HCI+0.3M HF，HF-HCI混酸体系被认为能显著降低腐殖酸中硅杂质)，然后在25℃下振荡24h。然后在5000rpm下离心10min去除上清液。换液离心三次，从而使HA含有较少灰分残留。将渗析袋装入阳离子交换树脂，在HA溶液中振荡24h，达到去除HA中杂质阳离子的目的。然后离心，撇去上清液，得到纯化后的HA样品，经真空冷冻干燥后得到粉状产物，在-5—7℃下低温保存备用。 将含有FA的亮橙色溶液流经填有XAD-8树脂的吸附柱，使FA被吸附在树脂上。柱内径1cm，下端填入少量脱脂棉,树脂填充长度以10-15cm为宜，设置流速为1.5-2ml/min，为达到完全吸附，可串联多根吸附柱，待流出的清液呈淡黄色即可。然后用去离子水洗涤树脂柱至流出液呈中性或弱酸性。再用0.IM NaOH溶液从树脂中对FA进行洗提，洗脱出的暗褐色物质即为富里酸。然后将渗析袋装入阳离子交换树脂在FA碱溶液中振荡24h。在经过阳离子交换之后，再将FA在45℃下进行旋转蒸发浓缩。最后使用真空冷冻干燥，得到纯化后的FA粉末，在-5—7℃下低温保存备用。 在腐殖酸提取过程中，粘土矿物可能以胶体形式混入，从而增加灰分含量，为了降低灰分含量，透析之前，常用混合酸（HCL/HF）进行处理，经过两次混合酸处理后，灰分含量可达到可接受水平[23]。由于干扰物质的复杂性，至今还没有一个可普遍接受的分析过程来纯化腐殖酸。 三、腐殖质分组 腐殖质分组是在三种腐殖酸的提取基础上，进一步进行细分，但是目前国内研究学者对这一方面的研究还很少。纯化去除了大量的杂质，但是所获得物质本身的性质差异还很大。就分子量而论，腐殖质组分本身的差异是非常巨大的，水体富里酸的平均分子量范围在600～2000，胡敏酸分子量稍大（1500～5000）[24]，源于土壤、沉积物的腐殖质平均分子量较大，不均匀分布在几百到几十万之间。据腐殖质分子量大小差异将腐殖质做进一步的划分也非常有意义，分子量大小不同，其很多性质，诸如溶解度、吸附特性及络合能力等可能也不相同。因此，为了获得比较均质的腐殖质组分，在排除无机离子与非腐殖质类有机质的干扰之外，还需要对腐殖质进行更细致的分组。 目前， 腐殖质的分组分离并不意味着要得到纯粹同质的化合物， 而是要获得某些物理化学属性取值比较狭窄的混合物[25]。腐殖质进一步分组的技术有沉淀、电泳、排阻色谱和超滤。但是一个独特的、通用的分组方法仍然在探寻中，由于其对于现在国内普遍研究现状没有太大的实用意义，就不再做单独介绍了。 四、总结 两百多年来，经过研究者的不懈努力，对腐殖质有一定的了解，由于其本身的复杂性，研究仍然存在有很多问题：腐殖质是高分子混合物 还是超分子体系，研究者至今还没有统一的看法；腐殖质的分子结构，尽管研究者提出各种各样的理论模型，但如今仍然是一个谜；腐殖质的提取方法难以统一，不同提取方法所获得的物质或多或少存在差异，使得研究数据可比性较低，据此得出的结论争议性较大。要充分揭示腐殖质的分子结构和化学属性，关键在于如何对不同来源的腐殖质进行有效提取、纯化与分组，使得研究对象尽量简单而均一。现有的土壤腐殖质分离提纯方法，基于腐殖质溶解特性的不同，只能将腐殖质分为胡敏酸、 富里酸及胡敏素三类。然而，这三类物质本身并不是均质的高分子化合物，而是成分复杂的有机混合物。尽管这一分类方法简化了腐殖质的研究，但研究结果仍然是一个非常概括性的描述。要获取更加精确的信息，需对三类物质进行再分组，特别是按照分子量对HA、FA进行再分组，获得分子量分布范围比较狭窄的亚组。 目前，排阻色谱和超滤技术作为腐殖质化学与物理分离的两种代表性新技术，色谱分离测定精度高，而超滤具有操作简便、分离量大和对分离物质无破坏等优点，在腐殖质研究中，两者的结合将有助于深化理解土壤腐殖质的化学性质和分子结构。随着膜技术的不断发展，可将分子进一步的分离，最终将会获得成分均一的腐殖质 。 参考文献： [1]张晋京,窦森,李翠兰.土壤腐殖质分组研究[J].土 壤 通 报 ,2004,12(6):706～7 0 9 . 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