肿瘤组织移植入动物体内的方法

肿瘤组织移植入动物体内的方法 肿瘤组织移植入动物体内的方法 1(肿瘤组织块移植方法 (1)肿瘤组织块移植方法:无菌条件下，将人体肿瘤手术切除的标本立即置于RPMI1640培养液中，在超净工作台内选择生长良好，无 22坏死，呈淡黄色、鱼肉状瘤组织剪成直径为1mm-2mm的肿瘤组织块。肿瘤组织块移植可用套管针完成。 (2)肿瘤组织块移植:肿瘤组织块移植时，可用套管针接种到裸鼠的腋部、腹股沟部、背部皮下或者其他需要的接种部位。也可在裸鼠外侧皮肤剪一个长约5mm的小口，用无钩眼科镊夹着组织块，送入切口皮下。整个过程尽量在肿瘤切除后1小时内完成。 2.肿瘤组织悬液移植方法 (1)肿瘤组织悬液制备:选取生长良好、有光泽、淡红色的瘤组织 3块，剪成1mm的小块，在加有PBS的玻璃培养皿中剪碎，再在玻璃匀浆器内研磨制成悬液后，经80-100目网筛过滤成单细胞悬液。 (2)肿瘤组织悬液移植:肿瘤组织悬液移植时，按每只0.2ml，细胞 67数为1×10,1×10个。为使注入的悬液不外溢，注射完毕后用小镊夹住针孔片刻。本法适于成活率高的移植瘤的常规接种或大批量的动物接种，优点是一次可以移植大批动物，所用瘤细胞数可定量，缺点是不易按需要定位。 3.肿瘤细胞培养液移植方法 肿瘤细胞培养液移植一般采用先分离培养原代瘤组织，再作瘤细胞培养。 (1)仪器准备 CO培养箱、显微镜、离心机 2 (2)物品清洗准备 玻璃器皿的清洗、塑料或橡胶器皿的清洗、无菌操作环境准备 (3)MEM培养液配制 (4)取材与消化分离 1)取材:无菌取色泽肉红、未烂的新鲜肿瘤块、立即进行原代培养。若因故不能立即进行培养时，应在无菌条件下，把组织块切成 31cm大小置于培养液中37?保存。存放时间不宜超过24小时。如放置时间过长，组织块过大或贮存温度过低，均将影响培养细胞存活率。 2)剪切组织:先将所取得的组织，用Hanks液清洗，以去除面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯 3头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 3)消化分离:消化分离的目的是将细小组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养。癌组织的消化常用胶原酶。胶原酶对胶原有强的消化作用，能消化细胞间质，使细胞分散。但其 2+2+活性不受Ca和Mg或小牛血清的影响。 消化时，首先将3,5倍胶原酶溶液加入已剪碎的组织块中，一般数小时后或10余小时后，可见组织块逐步变小至几乎看不见。当原来澄清的消化液转变成混悬液时，可以终止消化。如组织块较大、细胞量较多时，可在消化期间换一次消化液。当消化结束后，将消化液 经低速离心5分钟后，去上清液，加入20%小牛血清培养液，轻轻吹打细胞团，制成细胞悬液。 (4)细胞悬液培养:细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将 55细胞数调整为2×10/ml,5×10/ml，或实验所需浓度。分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO培养2箱内，37?静置培养。一般3天,5天，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1/2的新培养液，继续培养2天,3天后换液，一般7天,14天可以长满瓶壁，进行传代。 (5)肿瘤细胞培养液制备:当培养细胞处于生长旺盛期时进行移植，首先将培养瓶中培养液倾出，于培养瓶中加入0.25%蛋白酶消化1分钟,15分钟倾出培养液，加小牛血清终止消化。再加入培养液后，吹打细胞，制成悬液，以1000rpm离心5分钟，除去上清液，另加入适量Hanks液或细胞培养液，即为肿瘤细胞培养液。 (7)肿瘤细胞培养液移植:对肿瘤细胞培养液经台盼兰染色和血细 67胞计数板计数，当活细胞比率大于90%、细胞浓度为1×10,1×10个细胞/ml时，即可按每只裸鼠0.2ml接种与皮下或其他所需部位。