生物标记物在DNA氧化损伤及辐射损伤检测中的应用（可编辑）

生物标记物在DNA氧化损伤及辐射损伤检测中的应用（可编辑） 生物标记物在DNA氧化损伤及辐射损伤检测中的应用 维普资讯 ////0>. 动物医学进展。 , : ?生物标记物在氧化损伤及辐射损伤检测中的应用 邱志芳 ,章孝荣 ,李 淼 ,陶 勇 ,吴李君 .安徽农业大学畜牧水产学院,安徽合肥 ;.中国科学院等离子体物理研究所,安徽合肥 中图分类号:. ;/ . 文献标识码: 文章编号: ?? ? 摘 要:生物标记物是近年来提出的一群与 是突变的重要原因,而严重的突变则可造成细胞癌 细胞生长增殖有关的标记物。随着分子生物 变、死亡。单细胞生物必须修复的损伤,或产 生一定程度对损伤的耐受,才能保证生物个体的生 学理论和技术的迅速发展,生物标记物的研 存;多细胞生物体内单个细胞的死亡虽不影响生物 究作为一个崭新的领域逐渐引起了国内外环 个体的生存,损伤诱发的细胞凋亡对生物个体 境医学界的共同关注。关于自由基攻击 也没有太大的影响,但 损伤可导致某些遗传 所引起氧化损伤,以及电离辐射造成的 病及肿瘤的发生,因此,损伤修复系统对多细 辐射损伤所诱发的一些生物学 后果,存 胞生物同样具有重要意义 。 在着由于结构微小,直接检测过于复杂 多年的研究明,至少人类的两大问题??癌 和困难的问题,而利用生物标记物进行 症和衰老与损伤密切相关。因此,的损 损伤修复检测是最灵敏可行的,也是危 伤及测定越来越引起人们的重视。损伤主 险性评价的重要方法。因此,文章就氧 要有 种类型,一是氧化损伤,二是辐射损伤。 化损伤、辐射损伤以及生物标记物在氧 损伤造成的细胞反应也有 种,一种 是损伤严 化损伤与辐射损伤检测中的具体应用进行了 重而修复无望,细胞遂走向程序性死亡,这种损伤不 全面而系统的阐述。 至于造成突变;二是当损伤有望修复时,细胞通过一 关键词:生物标记物;氧化损伤; 系列调节机制,抑制细胞周期的进行等途径来进行 辐射损伤 修复,而损伤的修复涉及人体生长、发育、衰 脱氧核糖核酸 是生命活动中最重要的 老、疾病等许多方面。 遗传物质,是生命信息的载体,是细胞中最重要的生 由于结构微小,直接检测过于复杂和困 物大分子之一,易受各种因素的作用而出现损伤,导 难,利用间接的生物标记物进行损伤修复检 致完整性的改变,引起细胞及机体损害。因 测是灵敏可行的方法,也是危险性评价的重要方法。 此,保持其分子结构的完整性以及对损伤进 生物标记物是指包括生物系统内直接 行修复,对于细胞至关重要,更是机体抵御各种损害 或间接与环境暴露相关的,可测定的生化、生理、细 的基础。然而,复制时,可能由于聚合 胞、免疫或分子的变化,以及可测量的体液内或房室 酶引发出偶然的错误或环境因素 如电离辐射、紫外 中的代谢物水平。生物标记物显示了分子水平的暴 线照射及化学诱变物等 引起序列错误,另 露一效应关系。在机体中,各种损伤和修复机 外,分子本身也可能出现一些自发性损伤。据 制均有各自特异性的因子和基因组,构成了各自的 统计,每个细胞的在 内约出现 万次损 生物标记物。定量测定生物标记物,进行生物监测 伤 。 是流行病学研究中较为理想的手段。以前,国际上 由于结构特点及半保留复制特性, 复制易出现损伤,引起细胞及机体损坏。损伤 对生物标记物的研究主要集中于致癌物。目前,生 会直接影响复制、转录和蛋白质合成,进而影响细胞 物标记物在损伤与修复检测上的应用正成为 遗传、发育、生长和代谢等生命活动。损伤还 新的研究热点。 收稿日期: ?? 作者简介:邱志芳 一 ,女,安徽天长人,硕士,主要从事动物胚胎移植与分子检测研究。 通讯作者维普资讯 ////. 邱志芳等:生物标记物在氧化损伤及辐射损伤检测中的应用为主。利用原子力显微镜 能够直接观察到 氧化损伤 交联的生成。脂质过氧化过程中会产生多种 电离辐射、超声波及某些化学因素均能引起机 活性氧自由基。而活性氧自由基的诱变作用已有报 体细胞产生活性氧,进而引起损伤。自由基 道。有研究证实,组织细胞内脂质过氧化作用的增 攻击能够引起氧化损伤,而氧化损伤会 强导致活性氧的产生量增加,引起基因突变和线粒 导致肿瘤、衰老及职业病的发生。脂质过氧化与衰 体 的氧化损伤。脂质过氧化可以造 老、中毒、肿瘤、炎症反应等多种疾病有关。脂质过 成基因点突变,引起原癌基因的激活或抑癌基因的 氧化进程中可产生多种自由基和非自由基产物而引 失活,最终导致细胞增殖的失控和癌变。在体外 起细胞功能障碍,特别是具有中等反应活性的脂自 实验中,大鼠微粒体脂质与 , 和细胞色 由基 ?,和?,易穿透并扩散进入细胞 素 还原酶共育导致 质粒双链损 核,与碱基起加合反应,直接攻击或。如 伤,将转染给 . 细胞。结果在未经紫外 果此类加合产物不能及时清除和修复,就可能引起 线辐射诱导产生修复的宿主细胞中突变率增 突变并致细胞癌变 。另外,氧 化损伤 加 倍,而在诱导产生修复的宿主细胞中突变 研究的深入,还可以为阐明某些粉尘毒性的作用机 率增加 倍,且存活率是未经诱导宿主细胞 制提供新的途径。引起损伤的内源性因素有 的一半。对 序列分析结果显示,主要是 氧化、甲基化、脱氨、脱嘌呤,其中以氧化为损 单个碱基的置换,主要是 : ? : 的颠换,其 伤的主要类型。引起损伤的外源性因素方 次是 : ? : 颠换。在诱导的 . 宿 面,一般有以下几类:?物理因素:如电离辐射、超声 主细胞中,脂质过氧化物的光谱类似 。 ,提示脂 波等。也有文献报道, 的紫外线引 质过氧化过程中产生的过氧化物有诱变作用,但没 起活性氧与氧自由基如, 一和的产生量 有发现脂质过氧化的终产物,例如醛或链烷。四氯 增加,引起细胞膜损伤及损伤,促进皮肤癌前 化碳经生物转化后形成自由基,引发肝微粒体脂粒 病变和皮肤癌的发生。?化学因素:有几类化学物 的脂质过氧化,攻击导致 、 、 碱基突变。 质与生物体内形成多种自由基关系十分密切。醌的 有研究发现,直肠癌细胞中亦发生 ? 、 ? 颠 代谢产物萘 可引发脂质过氧化作用。 换,且 一 ? 和量增高。 的脂质过氧化作用可被维生素 琥珀酸盐 显 著抑制。电离辐射、环境污染、化学致癌物、致纤维 氧化损伤所造成的生物学后果与人类的 化粉尘均能诱发自由基攻击,表现为单 健康和某些疾病有着紧密联系。大多数文献常常涉 链断裂 ,双链断裂 ,交联等碱基损 及到的是肿瘤和衰老。癌症可能是由于致癌物经体 伤以及分子水平上出现无嘌呤位点,一羟甲基尿嘧 内代谢活化后,形成自由基攻击才发生的致 啶, 一羟基脱氧鸟嘌呤 一 ?等。 癌作用。通常,促癌剂的促癌能力与其产 生自由基 自由基可以直接作用于核酸,引起碱基的修饰 的能力呈正相关。能清除自由基的物质也能抑制促 和链的断裂。碱基的改变可导致在基因控制 癌作用。但目前的研究多基于体外实验,体内实验 下进行的许多生物过程受到破坏;链断裂可使 和人类的资料不足。衰老是一个极为复杂的过程, 核酸的完整性和构型受到破坏,最终引起细胞死亡。 自由基致损伤只能解释部分现象 有研究发 修饰过的,一方面具有抗原性,刺激机体产生 现,向细胞培养基内加入抗氧化剂并不能显著增加 抗体,导致机体自身免疫反应发生。另一方面, 细胞的寿命。许多学者也已经注意到氧化磷酸化的 携带有遗传信息,自由基作用于导致遗 老年变化。在电子传递呼吸链中产生的自由基可以 传信息的改变,从而控制以为的蛋白质 导致线粒体损伤,以及使一些线粒体的 的合成,参与机体代谢。由于生物体系的复杂多样 包涵体进入细胞核基因组。研究表明,褪黑素分泌 性,氧化损伤的研究主要集中在体外模型系统 的减少,体内抗 氧化损伤能力的减迟与衰老 上。自由基引致损伤主要表现为碱基释放、 有密切关系。氧化损伤与尘肺的发生也存在 一 解聚、碱基受损、交联 种类型。在脂质体、红细胞 定的关系。虽然石棉引起肺纤维化和恶性肿瘤的 膜、大鼠肝细胞核膜脂质过氧化对核影响的 发病机制目前还不十分清楚,但有些学者认为自由 研究中,发现脂质过氧化引起的损伤以交联 基和其他一些活性氧产物介导了暴露于石棉后的组维普资讯 ////. 动物医学进展 年 第 卷 第 期总第 期 织损伤,石棉纤维中的铁和培养介质中的铁催化产 . 紫外线引起的损伤 生活性氧自由基,导致 损伤、基因突变和癌症 分子损伤最早从研究紫外线效应开始。 发生。而且,吸入石英粉尘也可导致肺部纤维化,最 当受到最易被其吸收波长 的紫外线 后发展为矽肺。有些资料表明,石英粉尘可能与肺 照射时,主要是使同一条 链上相邻的嘧啶以 癌有一定联系。一般矽肺患者的肺癌发病率高于末 共价键连成二聚体,相邻的 个 、或 个 、或 与 间都可以环丁基环 连成二 患矽肺的接触粉尘者。 抗氧化剂及各种自由基清除剂在氧化损 聚体,其中最容易形成的是 二聚 体。 伤中的作用方面已多有报道。像 、、苯甲 . 电离辐射引起的损伤 酸钠、甘露醇等都被证实有抑制 氧化损伤作 电离辐射损伤有直接和间接的效应,直 用。近年来,许多天然抗氧化剂的研究越来越受到 接效应是直接吸收射线能量商遭损伤,间接 重视。据报道茶多酚可以抗心血管疾病、延缓衰老、 效应是指周围其他分子 主要是水分子 吸收 抗癌,而且还有其他保健作用,如可提高机体免疫机 射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤 能。茶多酚的抗氧化损伤功效为今后开发绿 。电离辐射可导致 分子的多种 变化:? 色天然抗癌食品提供了一条新途径。尽管氧 碱基变化。主要是由自由基引起,包括 化损伤的机制还不是很明确,但脂质过氧化引致 链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破 损伤的结论已被证实, 在肿瘤、职业病、衰老等 坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。?脱氧核糖 疾病的研究中也取得了有意义的成果,并且已找到 变化。脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能 了一些高效的抗氧化剂。但对于氧化损伤的 与反应,导致脱氧核糖分解,最后会引起 机制及氧化损伤与疾病的关系仍需进行深入 链断裂。?链断裂。这是电离辐射引起 研究。 的严重损伤事件,断链数随照射剂量而增加。射线 辐射损伤 的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二 辐射损伤主要包括 结构的辐射损 酯键断开而致链断裂。双链中一条链 伤与染色质的辐射损伤 种类型。的辐射损 断裂称单链断裂,双链 伤会对的复制、转录、翻译有一定影响,而且 在同一处或相近处断裂称为双链断裂 还能产生一些其他生物学后果。对于结构的。虽然单链断裂发生频率为双链断裂的 辐射损伤,是因一般电离辐射后的碱基和糖 倍~ 倍,但还比较容易修复;对单倍体细胞来 基都有可能发生一系列的化学变化,从而引起碱基 说如细菌 一次双链断裂就是致死事件。?交联。 的破坏和脱落,脱氧戊糖的分解,磷酸二酯键的断裂 包括链交联和 一蛋白质交联。同一条 和核苷酸链的单链和双链断裂。由于碱基的 链上或两条 链上的碱基间可以共价键 变化,与附近的蛋白质形成共价键结合的 结合,与蛋白质之间也会以共价键相连,组蛋 蛋白质交联,的同一条链内和 相邻两条 白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录 链问的碱基也可能发生共价键结合的链内交联和链 有关的酶都会与共价键连接。这些交联是细 间交联。在射线的作用下,的高级结构也发生 胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分 变化。而对于染色质的辐射损伤,通常是通 子基础,会影响细胞的功能和复制。 过转录将遗传信息传递给 ,指导蛋白质和酶 的辐射损伤问题作为辐射对活 细胞作用 的生物合成,使基因蕴藏的信息得以表达。但在真 的关键靶分子,一直是放射生物学分子水平研究的 核细胞中,要行使这些功能,一刻也离不开染 中心课题。近几年来,在分子生物学技术迅速发展 色质蛋白。组蛋白和非组蛋白对基因表达起着重要 的渗透下,该领域的研究进展迅速,主要表现在以下 的调控作用 “ 。因此,要深入研究电离辐射对细 几个方面:一是低能辐射研究。低能辐射,特别是 胞内的效应,讨论辐射损伤对转录和翻 ~ 水平低能电子、超软 射线、 真 空 译功能的影响,必然会涉及到染色质以及染色质蛋 紫外 及 电子对损伤的研究受到很大 白与的相互关系。总的说来,辐射损伤 重视并取得某些突破性进展。其原因主要有 个方 主要有以下几种类型: 面:一是常规电离辐射的生物效应归根结底主要是维普资讯 ////. 邱志芳等:生物标记物在氧化损伤及辐射损伤检测中的应用 ?一个细胞群中只有部分细胞产生旁效应,其比例 通过大量次级低能电子 能量仅为几十 甚至更 小 的能量沉积事件所引起;另一原因是实验技术的 大小与细胞种类及照射 水平有关;?引起旁效应的 可能机理有活性氧自由基,受照射介质的效应,细胞 发展 因为低能辐照需有特殊的设备和制样技术 。 间通讯或信号转导。 这类研究以加拿大和英国学者的工作最为突出。二 目前更倾向于第 种解释,但需深入研究。预 是同步辐射 软 和方面的研究。 期对这一新现象及机理的阐明,将对辐射生物学基 指出,作为广泛应用的 一个方 本理论产生重大影响,并在辐射防护领域可能要重 面??第 代 高亮度、高品质软 射线和 新考虑低剂量辐射危险度的评价。另外,随着新技 技术的发展,为低能辐射研究提供了极好的手段,并 术、新方法的大量应用,辐射生物学研究发展很快, 被认为是研究辐射直接作用的成功方法。其主要原 特别引人注目的重要新技术有核磁共振谱仪,分子 因有以下 点:?利用 可系统地研究损伤 动力学,芯片,时间分辨 射线晶体衍射,同步 的光能依赖性特别是 ~ 范围发生辐射第 代 ,共焦激光显微镜,脉冲电子?核磁共 和的作用谱 ;?软 射线微束技术的发展可 振谱仪以及高效液相色谱与质谱或串联质谱联用技 选择照射单个细胞,研究旁效应和细胞间通讯; 术等等。这些高新技术的应用将会使辐射损 ? 从结构水平开展蛋白质、和辐射化 伤研究的进入一个新的发展阶段。 学研究可获得生物大分子“”信息。 值得注意的是, 用 软 射线研 生物标记物在损伤检测中的应用 究人成纤细胞染色单体断裂并与 射线比较后得 生物标记物是近年来提出的一群与细胞生长增 出:对染色单体断裂产额, 比 射线大 倍~ 殖有关的标记物。随着分子生物学理论和技术的迅 倍,但二者均与 吸收剂量 呈线性关系;而对等 速发展,生物标记物的研究作为一个崭新的领域逐 位染色单体断裂产额, 比 射线大 倍~ 倍, 渐引起了国内外预防医学界的 共同关注。生物标记 但二者均与 呈线性关系。在辐射所致损 物被称为是环境医学发展到分子水平的重要里程 伤研究中,簇损伤 研 碑,它的研究在分子流行病学、分子毒理学、劳动卫 究受到广泛重视,成为近年研究热点。簇损伤 生学、环境医学等诸多领域中 均具有极其重要的价 是辐射所致细胞死亡或突变的关键损伤,但因检测 值。目前,生物标记物在 辐射放射生物学领 方法跟不上,因而对它的发生率、可修复性及生物学 域正逐步被广泛应用。 后果仍不甚了解,甚至在概念上时有模糊 如 . 生物标记物概述 是簇损伤吗 个或多个损伤的范围有多大 。此 生物标记物是指生物系统接触外源物质后出现 外,产额与的关系一直是个有争议的问 的一种改变。具体来说,就是指能反映生物体系与 题。近年的研究还表明,细胞产额及其 外界环境因子 化学的、物理的或生物的 相互作用 空间分布受辐射质的影响。另外,链断裂的一 所引起的生理、生化、免疫和遗传等多方面的分子水 个重要机制??对糖的抽氢反应,也引起了 平的改变的物质。通常,生物标记物可分为 类。 一 辐射化学家们的很大兴趣。 世纪年代以来, 是接触生物标记物 ,指机 辐射生物学上有两个相关现象被认为对传统辐射作 体生物材料中外源性物质及其代谢产物 内剂量 , 用模式构成了挑战,一是辐射诱导基因组不稳定性, 或外源性物质与某些靶分子之间相互作用的产物 另一个就是旁效应 旁效应指的是受照射细胞能发 生物有效剂量 。内剂量生物标记物包括细胞、组 出某种信号引起邻近未受照射的细胞损伤。传统观 织或体液如血、尿、粪便、乳汁、汗液、毛发、指甲、唾 念认为,辐射对细胞的遗传效应都是损伤的 液 中的毒物及其代谢产物;有效剂量到达剂量或 直接结果,群体中未受到照射的细胞则“ ”。 靶剂量 生物标记物如加合物,蛋白质加合 旁效应显然是传统理论无法解释的新现象,正在引 物,.蛋白质交联物等等。二是效应生物标记物 起研究者们的极大兴趣。旁效应在广泛的应用领域 ,指机体内能反映生化、 生理或 如预测放疗疗效和估计暴露于低剂量辐射人群的 其他方面改变的物质。依照改变程度的不同,效应 风险 可能具有头等重要性。近年的研究结果表明: 生物标记物又可分为反映早期生物学效应、结构和 ?高辐射所致旁效应比低辐射强烈; 或 功能改变、毒性或疾病 类标志物。机体内能维普资讯 ////. 动物医学进展 年 第 卷 第 期总第 期 修复与代谢酶多态性指标 ,谷胱甘肽硫 反映早期生化、生理或其他方面改变的物质称为早 转移酶 及乙酰化酶等的测定。研 期生物学效应生物标记物,如链断裂、癌基因 究表明,尿中一羟甲基尿嘧啶可作为人类氧化应激 活化、抑癌基因失活等;当外源性物质引起细胞结构 的生物标记物,反映某些外源化合物低剂量接触人 或功能改变时,机体内能反映生化、生理或其他方面 群的潜在毒性。但目前仍然缺乏简便、灵敏、可靠的 改变的物质叫做细胞结构和功能改变的生物标记 理想的生物标记物,比如一的检测设备昂贵, 物,如有机磷农药中毒时胆碱酯酶活性抑制,铅中毒 成本高,这是目前自由基人群毒理学研究的最大障 时占一活性抑制,多胺水平的升高,肿瘤生长因 子,癌胚抗原等;能反映外源性物质机体毒性的物 碍,也是目前有关研究工作仅局限于离体实验及动 质,如 实验,染色体畸变,姐妹染色单体交换 物实验的主要原因之一。现在认为导致损伤 和微核实验等,称作毒性生物标记物。三是易感性 的 个内源性过程 即氧化,甲基化,脱氨基和脱嘌 呤 中最重要的内源性损伤是氧化损伤 。这种 生物标记物 ,指反映机 认识促使人们想发明一种技术,以用于常规监测个 体先天或后天获得的对接触外源性物质产生反应能 力的指标。理想的生物标记物应是特异性强,敏感 体中的这种损伤。 近年来新的生物标记物 一 一 , 一 性高,能用非损害性技术测出,省钱,并与接触水平。 , 一羟脱氧鸟苷 的出现,引 有量的关系。实际上,生物标记物能具备上述理想 条件者不多,但对完成某种目的来说,仍可选用。为 起了众多学者的兴趣,高效液相色谱一电化学技术 了寻找理想的生物标记物,学者们一方面热衷于发 /的联合应用,已经成功地将其检测出 展新技术,例如由外源物质的活性代谢产物与体内 来。。 是最重要的生物标记物。 大分子相互作用而形成加合物,用作接触外源物质 最初于 年发现 经 射线产生后产生。 的标记物,并可定量。另一方面重新审视过去的多 年 等在用各种致癌物处理的中也 种类型测定物,评价其作为生物标记物的价值 。 发现了它。同年 等首次用 / 法检测 出经 ? : :等处理的脱氧鸟苷 中产生的 . 氧化损伤与辐射损伤的生物标记 物检测 。 。 提出。 是诱变剂。 年以后 等对 的方法进行了多 是生命活动中最重要的遗传物质,易受各 次改进并用于生物样品检测。又由于。 固有 种因素的作用而出现损伤,导致完整性的改 的特点,使其在短短的几年问,很快成为众学者推崇 变,引起细胞及机体损害。损伤的特点就是细 的氧化损伤的生物标记物之一。 。 胞正常周期调控受阻,导致细胞增殖。因此标志 综上所述,。 是氧化损伤所产生的 损伤的检测一直受到重视。特别是近年来对 一 种主要的加合物,与诱变、致癌、衰老及与衰老有 调节细胞增生的各种因子及其分子生物学基础有了 深入的认识,检测的技术和方法也有了迅速的发展 关的退行性疾病均有密切的关系。的 和更新。但由于损伤的直接检测过于复杂和 / 法的建立,提供了检测内源性氧化 损伤的最好手段。国外这方面的研究进展很快,我 困难,一般需采用间接的灵敏可行的生物标记物法。 国仅见台湾 ? 等关于姜黄抗助长研究 损伤的生物标记物可主要分为 种,即特异性 以此为标志物的报道,此法初建时需要较大的投资, 酶和代谢产物,特异性修复基因和加合物。 有一定困难 。随着各种新技术新方法的发展,相 因此,生物标记物已成为损伤标记物的一个 重要分支。总之,生物标记物以新的方法检测,能反 信我国不久将会赶上国 际先进水平。 映各类损伤机理及过程,并可望普及应用,检 结语 出损伤位点,在常规检测方法应用的今天,不失为一 随着生物标记物研究的日益规范化以及新技术 种损伤的有力检测指标。 新方法的不断出现,如 ?气相色谱一质谱仪 , 在毒理学研究中,寻找氧化损伤的生物 , 高压液相色谱一质谱仪 , 聚 标记物,对研究外源化合物及其他因素 如电离射线 合酶链反应 技术,单细胞凝胶电泳技术和荧光原位 等 对机体的损伤非常重要,例如,链断裂,一 杂交技术等的迅速应用,计算机模拟技术等,从各个? ,反映基因变化的指 标 和 ,反应 层次寻找出更多灵敏、特异的生物监测指标,建立更