组织裂解液和细胞裂解液的配制

组织裂解液和细胞裂解液的配制 组织裂解液和细胞裂解液如何配制? 一、细胞裂解液配制 方法一 一、试剂准备 1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液: 150 mM NaCL 1% NP-40 (去垢剂) 0.1% SDS (去垢剂) 2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入) 1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂) 1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂) 1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选) 以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。 2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF 1.5 mM EDTA 1mM NaVanadate (钒酸钠)(任选) 3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶(90%以上生长面积)。 二、实验步骤 1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。 2、 向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。 3、 吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 (置于冰上)，然后重复步骤2 以刮取剩下的细胞。 4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。 5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定)，分装保存在 -70?。 4方法二 NP-40 or Triton-100 1% TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L NaCl 150mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟) 0.1mmol/L(100µg/ml) Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml) Leupeptin(亮抑制肽) 0.5mg/ml Aprotinin(抑蛋白酶肽) 0.3µmol/L(1µg/ml) (注:PMSF 贮存液:100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中; Aprotinin 贮存液:10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0); Leupeptin 贮存液:10mg/ml溶于水中; Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20?保存) 裂解操作程序: 7* 离心收集1×10 个细胞 * 加入4?预冷1%NP-40裂解液100µl * 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀(如为组织进行匀浆) * 4?放置15~30min * 4?离心，15 000rpm,10min，取上清备用。 方法三 , 细胞裂解液的主要目的:1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞;2. 溶解蛋白;3. 蛋白变性使其稳定;4. 抑制蛋白酶活性 推荐RIPA buffer: . 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 ? 150 mM NaCl 等渗体系 ? 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 ? 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 ? 5 µg/ml Aprotinin (抑肽酶)蛋白酶抑制剂 ? 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 ? 1% Triton x-100 破坏细胞 ?1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 , 细胞裂解液的主要目的:1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞;2. 溶解蛋白;3. 蛋白变性使其稳定;4. 抑制蛋白酶活性 推荐RIPA buffer: . 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 ? 150 mM NaCl 等渗体系 ? 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 ? 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 ? 5 µg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂 ? 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 ? 1% Triton x-100 破坏细胞 ?1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 ?0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂 其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，,20?保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。 , 用于普通的 Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋 白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40 裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或 SDS裂解液。 RIPA裂解体系: 150 mmoL/L Nacl， 1.0% NP-40或Triton-x-100 ，0.5%脱氧胆酸钠， 0.1% SDS， 50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。 一、组织裂解液配制 组织裂解液配方:` 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea(76.12) 1.5224 g 100mM DTT 0.1543 g 4% CHAPS 0.4 g 0.5mM EDTA 0.00146 g 40Mm Tris 0.0485 g 2%(v/v) NP-40 0.2 ml 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml 5mM PMSF用前加 0.00871 g 2%pharmalyte 0.2ml 共10ml分装成400µl/每管(可应用于30-80毫克组织裂解) 注:已配好分装成400µl/每管可供应用 不需另配～～～ 细胞裂解液配方: 6M Urea(60. 06) 1.8018 g 2M thiourea(76.12) 0. 7613 g 65mM DTT 0.050 g 4% CHAPS 0.2 g 40Mm Trisbase 0.02425 g 共5ml分装成200µl/每管(可应用于50-100ml培养瓶内的细胞裂解) 细胞裂解液: 组织裂解液配方: 7 mol/L 尿素、 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2 mol/L硫脲、 2M thiourea(76.12) 1.5224 g 2% NP-40、 2%(v/v) NP-40 0.2 ml 1% Triton X-100、 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml 65 mmol/L DTT、 0.1003g 100mM DTT 0.1543 g 5 mmol/L PMSF、 5mM PMSF用前加 0.00871 g 4% CHAPS、 4% CHAPS 0.4 g 40 mmol/L Tris、 40Mm Tris 0.0485 g 2% pharmalyte(pH3-10)、2%pharmalyte 0.2ml 0.5mM EDTA 0.00146 g 25 mg/L DNase I、 7 mg/L RNase A、 20 mg/L aprotinin、 20 mg/L leupeptin、 2 mmol/L Na3VO4、 Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 1ml水化液配方: 8M Urea(60.06) 0.48048 g 2% CHAPS 0.02 g 痕量溴酚兰 0.4 µl 1%的痕量溴酚兰(10mg+1000µl双蒸水) 450µl水化液 加DTT 0.00135mg or 400µl水化液 加DTT 0.00126mg 各种细胞裂解液的功用都分别是什么，SDS ，NP-40 ，TritonX-100有何作用 SDS ，NP-40 ，TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。 SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。 NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。 TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。 但是去垢剂属性只是一方面，buffer、配比、浓度、提取方法和处理也都是关键因素，建议参考《分子克隆》来做。