[doc] 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究

[doc] 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其 性质的研究 一 舀 生物化学与生物物理进展1993年第20卷第l期 《6弓,f ?63? 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究 垫—塑.直盏俞惠新 (江苏省原子医学研究b无锟2i4063) 关键诃人胎盘耐热性碱?巨磷酸酶(P—FLSAP),P—HSAP的性质,P-HSAP的 地化,碱?j生磷酸酶sA}?镶撩 人胎盘耐热性谳髋磷酸酶(pl~oentMheBtstable 81kalinephosphatsse,p-HSAP)是一种高度对热稳 定的碱性磷酸酶[AP)同工酶”‘,分子量为13000’0,由 两个相同曲亚基组成.P-HSAP由台体滋养细胞台成 后分珏进入母体血液,孕妇血清中P’HSAP的活性变 化是有规律的h叫,可以作为胎盘功能监担5的指标. 目前P-HSAP也已怍为精原细胞肿瘤的标志物被广 泛采用….制备高纯度p-HSAJ?是建立定量检测方 法的前提.本文报道从人胎盘中纯化P-HSAP的方 法以及对其一些性质的研究.. 1材料和方法 i.1材料人眙盘由解放军第1ol医院提供; DEAE—DE52,Seph~dexG一200为Pharmaci~产品; cM52为Whstman产品;考马斯亮蓝G25为Fluks产 品;等电点标准为LKB产品;十二烷基硫酸钠(SDS), 苯基磷酸二钠为上海化学试剂商店进口分装;其它试 剂均为国产分析纯和生化试剂. 1.2AP活力测定主要参考龅氏法”‘铡定,但 有较大改进.以苯基磷酸钠为底物,反应缓冲液为 0.04mol/L巴比妥缓冲液,pH9.6,于37?保温 15rain后用三氯醋酸除去蛋白质,吸取0.1皿l上清加 人定磷试剂,经45?保温l0m1.后在660n皿进行比 色.酶的话力单位(u)定义为在此条件下每min产 生lg无机磷的酶量为lu. 1.3蛋白质舍量测定用考马斯亮蓝G250测 定…,略加改进(所加考马斯亮蓝试剂的体积增加1 倍).牛血清白蛋白为标准蛋白. 1.4聚丙烯酰胺凝腔电泳(PAGE),SDS—PAGE 和等电聚焦(IEF)均按LKB2117电泳手册进行. 1.5酶的分离纯化”胎盘的预处理和正丁 醇抽提接文献【8]进行.将正丁醇抽提波加热至65? 并保持10mia后离心括为4379U/ mg,酶活力回lI殳为57.996. 衰1P—HSAP的分离纯仡 步骤总活力总蛋白比话回收 (u)(mg)(u/mg)(%) 正丁醇抽提蔽29100025601l3.71O0 热空性抽提斌270900980276.493.1 DEAE柱层析lB640062.529B2.464.1 cM柱届析17447050.2{47,.560.0 ~ephsdexG一200屡析16860038.54379.257.9 表中数据为两改提取的翠均值,每改提取所用胎盘组瓶 的重量为3OOg. 卫生部青年科学研究基盎资助项目. 收稿日期:1991-10-04怔回日期:1992-01-07 = 田2CM柱屠析纯他P—HSAP 实线:蛋白泼塞Am;虚线:酶活力U/ml 由3SePbldelG一200纯化P—HSAP 实线:蛋白浓度Am;虚线}酶活力u/mt , 喜 R 蝗 落 生物化学与生物物理进展1993年第2O卷第1朝 33 吾 2三 言 l星 2.2酶学性质由本法制各的P—HSAP,以苯 基礴酸=钠为底物,测得其米氏常数为2.5×10 mo|/L,最适反应pH为l0.5左右…’,最适反应温度 在屯左右. 2.3酶的理化性质用SephadexG-200I主层 析测定P—HSAP的分子量约为130000’圈4),用SDS PAGE测得其亚基分子量为65000(图5),说明由两 千相同的亚基组成,与文献报道相符. -, J- 盱4凝睦过滤洼_厕定P—HSAP?的分子量 t蛋白i4403(102.过氧化氢酶(z3oooo);3.醛 缩配(160”000);4- HSAP对热较稳定,纯酶在65?保蕊3h,活性仍保留 80%以上;当温度提高到90?时活性很快丧失.另 外纯酶在室温放置一和二个月后测定活性,发现话性 并未明显下降. 2.4酶的纯度和嚣基酸组成PAGE和SDS— PAGE均显示本法制备的P—HSAP为一条带.P— HSAP的氨基酸组成见表2. 文献报遭应用正丁醇拉挺,pH,丙酮,硫酸镀 分级分离,离于交换柱层祈和凝胶过摅,从人耐”, 肝”Lq]胎盘.’等组织中可以纯化到电泳纯的高活 I - ,一 … 组成,亚基分子量 为65000,等电点为4.6,以苯基磷酸二钠为底物的 值为2.×lO-*~nolf.L,其最适反应pH为10.5左右, ?65? 最适反应温度为65?左右,特别是诙酶对热的稳定睦 很高,在6s?保温几个小时仍保留大部分括力,宅温 放置二个月瑶性未见下降.这一热稳定性在应用匕具 有较大价值. 参考文献 lo口icaDRosend~hlK.atdenlindL.1nberJteJIreace ofaheastableatkatJnephosphatantsofplacental aIhlineDhospha:ase.Bioc~emGen~~Jl976:14:777 9Ooellga*tGTFishmanWHPurificationDfhuman DIa~cnTaIaIkalinc口ho:phata.Bioekem197}:14I: 440 0GPJ,$u~smanHHSIractu~icomparisonof eelnplcandnormalplacentalalkalinepl~osphatasePro~ ,23:l537 l{SuglttraM.Hi~anoK.1imoS”a/Purificationand prnpertJesofnliveralka]inePbosphatase.C,~em PharmBull,l979:23:2369 l4BdgKSussmnHH.StrlIcturevidencethat humanliverandplacentalalkalinephospl*atai’ m口dedbvdifferentgenes.ProcNal1.gc~dSet ?.】976:T3:2201