食用菌孢子分离技术专业版

附录四  食用菌孢子分离技术（专业版） 孢子分离法是常用的食用菌菌种分离方法之一，这种方法是在无菌操作条件下，使孢子在适宜的培养基上萌发成菌丝体而获得的纯菌种，属于有性繁殖。孢子分离法是指用食用菌成熟的有性孢子（担孢子或子囊孢子）萌发培养成菌丝体而得到菌种的方法。 食用菌的有性孢子具备双亲的遗传特征，而且孢子的数量大，变异的机会多，生命力强，所得菌种菌龄小，培育成的菌种质量好。 有性孢子是选育优良新品种和杂交育种的好材料。孢子分离又可分为单孢分离和多孢分离，双孢蘑菇、草菇等同宗结合的菌类可采用单孢子分离法；香菇、平菇、木耳、金针菇、杏鲍菇等大多数异宗结合的菌类应采用多孢子分离法，否则菌丝不育，培养成的菌丝体不能产生子实体，不能用作菌种。单孢分离法主要用于杂交育种的研究。 孢子分离法的主要操作程序：选择种菇→种菇消毒→采收孢子→接种→培养→挑菌落→纯化菌种→母种。 一、 单孢子分离法 主要用于单孢子的分离。为了从孢子中选优及杂交，必须进行单孢子分离，即在人工控制下，使两个优良品系的单孢子进行杂交，从而选育新的优质菌种。从许多孢子中挑选出单个孢子，一般需要单孢子分离器。如果没有单孢子分离器，也可采用平板稀释法、连续稀释法、毛细管法获得单个孢子。 1、 平板稀释法 将菌盖置于超净工作台内的硫酸纸上获取孢子。 在无菌条件下挑取少许孢子放在无菌水中，充分摇匀制成孢子悬浊液。然后用医用注射器吸取悬浊液并滴到PDA培养基上，用无菌玻璃三角刮把液滴推平，使孢子分散成单个。 在25℃下培养，经48-72小时后，镜检平板背面，观察孢子萌发情况，并在萌发的单个孢子旁做好标记。继续培养，待见到星芒状菌落时，转接到斜面培养基上。 待菌落长到1cm左右时，再进行镜检，取菌丝于载玻片上，将刚果红滴于其上，观察锁状联合。根据有无锁状联合，初步确定是否为单核菌丝，再考虑选用。 2、 连续稀释法 获取孢子后，在无菌条件下用接种针挑取一定量的孢子，注入10ml无菌水中摇匀，再从中取出1ml孢子液，加入9ml无菌水中，如此反复稀释，一直到每滴稀释液中，在低倍镜下一个视野内只有一个孢子时，用无菌注射器把孢子液缓慢流下至培养基上。 经恒温培养后，培养基面就会出现星星点点的菌落时，立即转移到新的培养基上继续培养，经镜检鉴定，是单核菌丝后，选取最优者作为原种扩大繁殖。 3、 毛细管法 将稀释后的孢子悬浮液用玻璃毛细管吸取，滴在无菌培养皿盖壁上，点样的地方做标记，点样后的培养皿仍盖在有培养基的底皿上。镜检后，确定液滴是单个孢子者，做好标记。取一小块培养基，放在单孢液滴旁，轻轻推动接触液滴。待菌丝长到培养基上后，再转移到斜面培养基上，经培养后获得单核菌丝，并继续培养。 二、 多孢分离法 1、 整菇插种法 在无菌条件下，首先将消毒过的种菇插入孢子收集器内收集孢子。然后把收集的孢子直接挑入PDA培养基上，或用无菌水稀释成悬浮液，用注射器接种到PDA培养基上。接种后，将试管置于恒温箱中培养，待发生白色的菌落时，将生长势强的单个菌落转移到另一试管培养基中继续培养，即可得到纯菌种。 2、 钩悬法 此方法多用于收集银耳、黑木耳及毛木耳等孢子。 在无菌条件下，将新鲜成熟的耳片，用无菌水冲洗数次，然后用无菌纱布把水吸干，取一小块耳片挂在钩上，（收集黑木耳和毛木耳的孢子时，耳片腹面朝下），钩的另一端挂在三角瓶口上，三角瓶内装有PDA培养基，耳片距培养基表面约2-3cm。在适宜温度下培养24h后，即可在培养基表面见到雾滴状孢子堆。此时取出耳片，塞好棉塞继续培养。银耳培养2-3后，即可在培养基表面见到乳白糊状，边缘光滑凸起的菌落，此为银耳的芽孢。再挑取少许芽孢，移入斜面试管内扩大培养，即得银耳芽孢菌种。黑木耳的孢子萌发需要5-6天，当见到有星芒状菌落出现时，挑取少许移至斜面培养基扩大培养，即可得到木耳纯菌种。 3、 贴附法 取一小块成熟的菌褶或小块菌块，用熔化的琼脂或胶水、糨糊之类（均先灭过菌），贴附在试管斜面的正上方试管壁上或培养皿皿盖上，经6-12小时，待孢子落下后，立即把试管或培养皿中的培养基移到另一消过毒的空白试管或培养皿中进行培养。 4、 菌褶涂抹法 取成熟种菇，切取伞柄基部，带入超净工作台内，用75%酒精对菌盖、菌柄进行消毒，用接种环直接插入两片菌褶之间，轻轻地抹过褶片表面，然后用画线法涂抹于试管培养基上。操作时，只要注意勿使接种环抹到暴露在空间的菌褶部分，很容易获得成功。在野外采集时常采用此法分离孢子，从而获得菌种。 5、 孢子印分离法 取成熟的伞菌或胶质菌的子实体，经表面消毒，切去菌柄，菌褶向下，放置于灭过菌的有色纸上（红、黑、蓝），用通气钟罩罩上，在室温下静置24小时，大量孢子便落在灭过菌的纸上（白色孢子用黑纸），形成孢子印。再从孢子印上挑取少量孢子移入试管培养基上培养。 6、 空中孢子捕捉法 伞菌的孢子（如平菇、香菇、金针菇等）大量弹射时，子实体周围可以看到“孢子云”，可在 “孢子云”飘去的上方倒放平板培养基，使孢子附在其上，再盖上皿盖，用封口膜封好培养，整个过程动作尽可能要迅速敏捷。 7、 简易收集法 将种菇插在支架上，置于9cm培养皿中，培养皿内预先放好无菌滤纸条，然后将种菇及培养皿一同放入1000ml烧杯中，上面盖一个大培养皿，在恒温培养1-2天，当大量孢子弹射后，将带孢子的滤纸条转入无菌小试管中，即可保存待用。此法孢子萌发率高，萌发速度快，适于长期保藏和遗传研究。