仙台病毒核酸疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞分型的作用

仙台病毒核酸疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞分型的作用 [ 文章编号]1000886(12011)08067603 ---论著?? 仙台病毒核酸疫苗对小鼠脾脏淋巴细胞分型的作用 * 张 园，王华，赵琢，李宁涛，王利兵 [摘 要] 目的 核酸疫苗 pVAX1-F 和 pVAX1-HN 的免疫效果。 用成功构建的仙台病毒天津株 HN 基因和 F 基 因的真核达质粒 pVAX1-F 和 pVAX1-HN，单独或联合免疫幼鼠，采用流式细胞技术Flow ( Cytometr，yFCM)。免疫后第 7、 14、21 和 28 天的脾脏淋巴细胞分型，观察它们在幼鼠体内的免疫应答作用。结果 淋巴细胞分型结果显示，构建质粒能够增高 ++++CD3CD4/CD3CD8比值、B 细胞和 NK 细胞百分含量。结论 构建的核酸疫苗 pVAX1-F 和 pVAX1-HN 能够有效增强小鼠的细 胞特异性免疫能力。 [关键词] 核酸疫苗 ;脾脏;小鼠;淋巴细胞分型 [中图分类号] Q786;Q939.4 [文献标识码] A The effects of Sendaivirus DNA vaccineon mouse spleenlymphocytes ZHANG Yuan,W ANG Hua,Z HAO Zhuo, LI Ningtao, WANG Libing Technical Centerfor Safetyof Industrial Products,Tian jin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300191,China [Abst ract] The objective of the studyis to evaluatethe immune responseand immunological protectofion expression vectopVrsAX 1 -HN and pVAX1 -F. Eukaryotic expression vectors harbouHNring and F geneof the Sendai virus were constructed, and used solejoinly tlandy to immunize infant mice.At 7, 14, 21, and 28 daysa f) ter the immunization,T lymphocyet subtypeof spleen was measubyred FC M to monitor the immunologicalre ) sponse.The analysis indicated that DNA vaccinep VAX1 -HN or pVAX1 -F can effectively induce specificim) munological responsein infant mice. [Key words] DNA vaccine; Spleen; Mice;T ly mphocyet subtype [1] 副流感病毒可引起一系列的呼吸道疾病，副流本文作者成功构建。主要仪器:生物安全柜，流式细感 I 型病毒是幼儿呼吸道感染的主要病原体，如治 胞仪。 疗不及时还可感染成人。仙台病毒 HN 蛋白和 F 蛋 1.2 动物的选取、分组、免疫接种方法与免疫应答的 白是病毒主要抗原，与人源副流感病毒 1 型对应蛋 小鼠随机分为 5 组，每组 20 只。分别为 动态监测 白序列高度同源，仙台病毒常常作为研究副粘病毒 [2]空白对照组、空质粒 (pVAX1) 组、pVAX1-F 组、 属的模式病毒。本研究应用仙台病毒天津株构建的 pVAX1 -HN 组、联合接种(pVAX1 -F +pVAX1 -HN) HN 基因和 F 基因真核表达质粒，单独或联合免疫 幼鼠，观察它们对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用和对 组，采用肌肉注射法免疫动物。为加强免疫效果，促 细胞周期的影响，评价构建的真核表达质粒及其免 进肌肉对药物的吸收，免疫前24 h 小鼠右侧股四头 疫方法的效果。 肌注射 0.25%布比卡因 100 μl，注射剂量为 50 μ g/1 材料与方法 只。初次免疫后第 2 周和第 3 周，进行加强免疫，剂 1.1 材料 实验动物为 ICR 小鼠，SPF 级，雌性，6:8 量同初次免疫，共2 次。在幼鼠免疫当天、免疫后第 周龄，购自中国医学科学院放射医学研究所实验动 物中心;真核表达质粒 pVAX1F 和 pVAX1HN 由 1 周、第 2 周、第 3 周和第 4 周 5 个时点从组随机选-- 取 2 只幼鼠，称重后，分别采集小鼠脾脏，通过淋巴 细胞分型动态观察小鼠的免疫应答水平。 1.3 FCM 检测淋巴细胞分型 ?脾淋巴细胞悬液制 备:无菌取脾，用注射器吸取约2 ml DMEM培养 液 缓缓注入脾脏，重复1 :2 次，收集液体至离心管中， 作者单位:300191，天津出入境检验检疫局(张 园，王 华，赵 琢， 李宁涛);410004 长沙，湖南出入境检验检疫局(王利兵) 1 500 r/min，离心 5 min，弃上清;加入含 10%FCS的 通信作者:王利兵，E-mail:wanglb@163c.om * DMEM培养 液洗涤脾细胞，1 500r/ min，离心 5 min，弃 上清，加入红细胞裂解液(NHCl: 3.735 ，gTris: 1.3 g 2 结果 4 加蒸馏水至 500 ml，过滤除菌)，室温放置15 min，12.1 免疫后第 7 天脾脏淋巴细胞亚群 与空白对照 500 r/min，离心 10 min，弃上清，加入 PBS，洗 2 遍， +组相比，pVAX1F 组 CD3淋巴细胞略有增高 (P, -5 过 200 目网;?镜下细胞计数，每管取 5×10个细 + + + + 0.05)， 但 pVAX1 -HN 组 CD3 、CD3 CD4 、CD3 胞，每个样品 2 管，1 500 r/min，离心 5 min，弃上清， +++CD8、CD4/CD8比值明显偏低，可能与样品制备过 每 管 加 入 CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP或 C D19程的操作有关;pVAX1 HN 与 pVAX1 F +pVAX1 ---FITC/NK1.1 PE/CD3 PerCP直标荧光抗体 各 10 μl， ++HN 质粒联合组的 CD4/CD8与空白对照组相比有 避光放置 20 min，然后加入生理盐水100 μl，上流式 所降低;pVAX1-F 组与 pVAX1-HN 组的 NK 细胞和 细胞仪检测。+ CD19细胞百分比显著增高(P,0.05)，见表 1。 表 免 疫 后 第 天 法检测脾脏淋巴细胞亚群 1 7 FCM Tab 1 Lymphocyte subsetsof sp een on the7th day detectedby FCM l + ++ ++ +++ Groups CD3(%) CD3CD4(%) CD3CD8(%) CD4/CD8 NK(%) CD19(%) Control 33.62?0.48 22.44?0.58 10.14?0.13 11.53?0.57 20.00?0.35 2.21 a21.73?0.71 20.17?0.26 9.17?0.38 14.96?0.37 28.51?0.42 pVAX1 2.20 aaa39.73?3.01 25.49?2.16 12.75?3.48 55.81?5.16 46.60?4.28 pVAX1-F 2.00 aaaaa 9.66?1.75 5.58?1.09 4.46?0.88 19.28?1.82 35.47?3.15 pVAX1-HN 1.25 34.3?6.82 16.88?4.21 14.35?2.07 9.73?1.87 22.46?3.16 1.18 pVAX1-F+pVAX1-HN n=3;a) P,0.05, comparedw ith controlg roup. ++2.2 免疫后第 14 天脾脏淋巴细胞亚群 表 2 显示 组相比有显著性 (P,0.05)CD4/CD8比值也有所增 ++++++pVAX1-HN 组 CD3、CD3CD4、CD3CD8及 NK 细 高;pVAX1F 组 NK 和 CD19细胞百分比与空白对 -++胞百分比、CD4/CD8比值与空白对照相比，均有显 照组相比显著增高 (P,0.05);pVAX1-F+pVAX1- +著性增高 (P,0.05);pVAX1F+pVAX1HN 质粒联 --HN 质粒联合组 CD19细胞百分比较空白对照组也 +++合组 CD3、CD3CD4细胞百分比增高，与空白对照 显著增高(P,0.05)，见表 2。 表 免 疫 后 第 天 法检测脾脏淋巴细胞亚群 2 14 FCM Tab 2 T ymphocyte subsetsof spleen on the 14th day detectedby FC M l + ++ ++ +++ Groups CD3(%) CD3CD4(%) CD3CD8(%) CD4/CD8 NK(%) CD19(%) Control 30.17?1.65 21.56?0.82 12.23?0.74 12.34?1.87 30.17?1.84 1.76 26.59?2.82 20.32?1.73 10.08?1.82 13.21?3.49 29.86?2.59 pVAX1 2.02 aa33.28?0.27 20.08?0.37 9.87?0.93 21.64?0.31 38.76?0.67 pVAX1F -2.03 aaa 46.13?2.56 31.85?1.82 15.27?0.57 16.58?0.28 32.13?1.29 apVAX1-HN 2.09 aaa48.52?0.34 29.77?0.57 11.26?0.24 11.34?0.37 35.28?0.81 apVAX1-F+pVAX1-HN 2.64 n = 3;a) P ,0 .05, compareidth w control group. ++ 2.3 免疫后第 21 天脾脏淋巴细胞亚群 pVAX1-HN 0.05)，CD4 /CD8 比值也增高;pVAX1 F +pVAX1 --+ + 组和 pVAX1 -F +pVAX1 -HN 联合组的 CD3 、CD3 +HN 联合组的 CD19较空白对照组增高，且有显著性 +CD4细胞百分比与空白对照组相比，显著增高(P, 差异(表 3)。 表 免 疫 后 第 天 法检测脾脏淋巴细胞亚群 3 21 FCM Tab 3 T lymphocyte subsetsof spleen on the 21th day detectedby FC M + ++ ++ +++ CD3(%) CD3CD4(%) CD3CD8(%) CD4/CD8 NK(%) CD19(%) Groups Control 25.42?3.85 12.39?2.54 10.06?2.13 12.43?4.08 33.58?2.81 1.23 32.99?2.34 17.69?1.84 13.32?1.62 14.57?1.14 34.66?1.57 pVAX1 1.33 35.36?2.76 15.81?1.37 14.02?1.59 16.29?1.09 31.85?2.19 pVAX1-F 1.13 aa 56.44?3.63 35.70?2.81 13.35?1.32 12.53?0.82 27.58?2.08 pVAX1-HN 2.67 aaa 42.61?2.35 26.52?1.08 12.67?1.62 11.86?0.98 38.69?2.18 2.09 pVAX1-F+pVAX1-HN n = 3;a) P ,0.05, comparedwith controlg roup . ++++++2.4 免疫后第 28 天脾脏淋巴细胞亚群 pVAX1-F 粒组的 CD3、CD3CD4、CD3CD8和 CD19细胞百分 +组与 pVAX1-HN 组 CD3与空白对照组相比，显著 比与空白对照都有所下降，差异有显著性P(,0.0)5; ++++ 增高 (P,0.05)，pVAX1-HN 组 CD3CD4、CD3CD8++ +pVAX1 -F +pVAX1 -HN 联合组的 CD3 CD4 、CD4 / 细胞百分比与空白对照组相比有所增高，且差异有 +CD8比值也都较空白对照组显著降低 (P,0.05)，见 ++ 显著性，CD4 /CD8 比值也明显增高;pVAX1 空质 表 4。 表 免 疫 后 第 天 法检测脾脏淋巴细胞亚群 4 28 FCM Tab 4 T lymphocyte subsetsof spleen on the 28th day detectedby FC M + ++ ++ +++ Groups CD3(%) CD3CD4(%) CD3CD8(%) CD4/CD8 NK(%) CD19(%) Control 38.77?2.43 26.84?1.85 14.28?1.27 10.13?1.07 40.08?2.59 1.88 aaaaa33.09?2.39 13.64?1.33 6.78?0.82 18.12?1.54 31.08?2.83 pVAX1 2.01 aa42.19?0.16 27.90?0.11 12.75?0.08 13.29?0.14 30.59?0.56 pVAX1-F 2.19 aaa 49.48?5.51 34.80?2.16 9.43?1.76 12.58?1.27 38.80?2.44 pVAX1-HN 3.69 aa34.81?1.80 18.16?1.92 11.95?0.81 14.57?0.95 43.11?1.86 pVAX1-F+pVAX1-HN 1.52 n = 3;a) P ,0 .05, comparwiedt h control group. [6] ，进为核酸疫苗通过肌肉注射直接接种于正常小鼠3 讨论 行免疫效果评价。结果发现该核酸疫苗可显著增强 CD3 表达于所有 T 淋巴细胞表面，可代表T 淋 ++ 免疫小鼠的细胞特异性免疫能力及 NK 细胞活性。 巴细胞总体水平CD，4/CD8值是重要的免疫学指 [3]标 。NK 细胞是天然免疫系统的关键组成部分，可 说明本研究构建质粒是一种有一定应用前景的核酸[4]疫苗，但其引起的免疫反应不够强，尚需联合其它抗 非特异直接杀伤靶细胞。本研究利用三色流式细胞 技术分析了不同免疫阶段小鼠脾脏和外周血的淋巴 原基因或免疫原性增强基因，来诱导机体更强的免 细胞分型，能够准确定量 Th 和 Ts细 胞。脾脏淋巴细胞 疫反应。 中，pVAX1-HN 单独注射组和 pVAX1-F + pVAX1- 【参考文献】 ++++ HN 联合组 CD3CD4/ CD3CD8值均有明显升高， 说明构建质粒能够有效提高机体 T 细胞介导的免疫 黄志英, 董 琳.人副流感病毒的病原学、流行病学及所 [1] 应答反应。在免疫前期，pVAX1-F 组和 pVAX1-HN 致疾病的特点[J].国际呼吸杂志, 2006, 26(9): 687690. - 组的 NK 细胞和 B 细胞含量明显增高，但 pVAX1- [2] SangsterM , Smith FS, Coleclough C, et al. Humanp arain- HN 组随后即下降，而pVAX 1-F 组下降时间要较 fluenza virus type 1 immunziation of infant mice protects pVAX1-HN 组晚 1 周左右，而 pVAX1-F + pVAX1- from subsequentS endai virus infection [J]. Virology, 1995, HN 联合组在免疫中后期的 NK 细胞和 B 细胞含量 212(1):13-19. 显著增高，说明各组均能刺激 NK 细胞和 B 细胞含 黄 键, 沈永生, 冯 霞.流式细胞仪检测淋巴细胞亚型 量，但作用时间有所不一致，可能不同质粒作用机制 [3] 中若干问探讨[J].临床检验杂志, 1998, 16(4):227229. - 不同，其免疫作用表达时间也不一样。 田志刚, 魏海明, 孙 讷. NK 细胞免疫识别及其调节机 CD19是一种属 于 Ig 超家族成员、相对分子质 [4] 制与免疫相关性疾病[J].中国科学技术大学学报, 2008, 量为 95 000 的穿膜糖蛋白，分布于 B 细胞表面，与 38(8):896-904. [5]B 细胞活化和信号的转导有关。在免疫动态监测过 张荣波, 胡 东,李 庆, 等.粉尘螨过敏性哮喘患者外周程中，pVAX1-F 组和 pVAX1-F + pVAX1-HN 联合 [5] J 缸淋巴细胞亚型分析 [J]. 现代预防医学, 2007,3 4(1):组 的 B 细胞百分 含量都有较高水平增高 ，而 22- 24. pVAX1-HN 组作用不很明显。 赵 凯，杨滨燕，吴长有. SARS SDN A 疫苗不同免疫方 本研究将 pVAX1-F 和 pVAX1-HN 表达载体作[6] 案诱导细胞免疫应答的影响[J].免疫学杂志, 2010,2 7(1): 13- 18. 收 稿 日 期 修 回 日 期 ,,, ,,2011-04-212011-0530- 编辑 瑞 侯()