CD40配体通过诱导型环氧合酶途径诱导单核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶

CD40配体通过诱导型环氧合酶途径诱导单核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶 CD40配体通过诱导型环氧合酶途径诱导单 核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶 第 Aca 二 dAcadJ 军 See 医 MiM 学 ed 学 Un 报 iv 2..6Aug;27(8)l…','…,?845? ? 论着? CD40配体通过诱导型环氧合酶途径诱导单核巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶 樊民,李岚,吴宗贵h,黄佐,任雨笙,潘晓明 (1.第二军医大学长征医院心内科,上海200003;2.中国人民解放军第411医院内4科,上海200081) [摘要]目的:观察重组人CD40配体(rhCD40L)对U937细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的影响,探讨其可能的作用机 制.方法:不同浓度(0.1,0.2,0.4t~g/m1)的rhCD40L和不同浓度(10一,10,,10mol/L)的N~398(COX一2特异性抑制 剂)分别刺激体外培养的U937细胞24h后收集上清液;在加入终浓度为 0.4ttg/mlrhCD40L的基础上,分别加入终浓度为 10mol/L的阿司匹林(C0X一1抑制剂)或N~398,共同刺激U937细胞24h后收集 上清液.酶谱法测定上述U937细胞培养 上清中MMPs活性.结果:rhCD40L可使MMP一2和MMP一9活性增加 (P<0.01),且随浓度的增加而逐渐增强,0.4g/ml rhCD40L作用最强;NS-398可抑制MMP一2和MMP一9的活性,且抑制作用随 剂量的增加而增强(P<0.05).NS-398,阿司匹 林均可抑制rhCD40L诱导U937细胞分泌MMP一2和MMP一9(Pd0.01),N~398 的抑制作用强于阿司匹林(P(0.05)结 论:rhCD40L以浓度依赖的方式诱导单核巨噬细胞分泌MMPs,这种诱导作用可能 与诱导型环氧合酶(COX)有关,而且与 C0X一2的相关性可能较C0)(.1更密切. [关键词]CD40配体;诱导型环氧合酶;基质金属蛋白酶;巨噬细胞 [中图分类号]R543.5[文献标识码]A[文章编号]0258—879X(2006)08—0845—03 rhCIMOLinducesmononuclearmacrophagessecretingmatrixmetalloproteirmsesthrough cyclooxygenase-2pathway FANMin,LILan2,WUZong—gui?,HUANGZuo,RENYu—sheng,PANXiao— ming(1.DepartmentofCardiovasology, ChangzhengHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China;2.The FourthMedicalDepartment,No. 411HospitalofPLA,Shanghai200081) 1-ABSTRACT]Objective:ToevaluatetheinfluenceofrhCD40Lonmononuclearmacroph age,U937cells,secretingmatrixmet— aIloproteinases(MMPs)anditspossiblemechanism.Methods:U937cellsweretreatedwith differentconcentrationsofrh— CD40LandN~398(specificantagonistofCOX一 2)for24handthesupernatantswereharvested.Cellstreatedwith0.4t~g/ml rhCD40Lwerefurthertreatedwith10, mol/LN~398oraspirinseparatelyfor24handthesupernatantswereharvested.Zy— mographywasusedtodeterminetheactivitiesofMMPsintheabovesupernatants.Results:rh CD40Lincreasetheactivityof MMP一2andMMP一9inadose—dependentmanner(P(0.01);theincreasedpeakedwhenrhCD40Lwasat0.4t~g/m1.N~398 inhibitedtheactivityofMMP-2andMMP一9inadose-dependentmanner(P(0.05).N~398andaspirinbothsignificantlyin— hibitedtheactivityofMMP一2andMMP一9inducedbyrhCD40L(P(0.05).Conclusion:rhCD40LcaninduceU937cellstose— creteMMPsinadosedependentmanner,whichmightberelatedtoCOX,morepossiblythrou ghCOX一2thanCOX一1pathway. [KEYWORDS3CD40ligand;cyclooxygenase-2;matrixmetalloproteinases;macrophage s l-AcadJSecMilMedUniv,2006,27(8):845—847] 动脉粥样硬化(AS)后期,斑块不稳定性增加, 影响粥样斑块稳定性的因素有很多.单核巨噬细胞 分泌的MMPs能够降解纤维帽中的胶原成分,使纤 维帽变薄,是斑块不稳定性增加的一个重要环节. 目前研究Ll发现,CD40一CD40L可以诱导MMPs的 表达并与斑块易损性直接相关,但其具体机制尚不 明确.因此,本研究通过观察rhCD40L对U937细 胞分泌MMPs功能的调节探讨其可能的作用机制. 1材料和方法 1.1材料U937细胞购自上海中科院细胞所,垂 直式凝胶电泳仪为Bio—Rad公司产品,明胶(gela— tine)为美国Sigma公司产品.rhCD40L购于R&D 公司,阿司匹林购自上海九福制药有限公司,NS一398 为美国Sigma公司产品. 1.2U937细胞培养,处理及培养上清样本的制 备培养U937细胞,3,10代细胞接种于24孔板 中,每孔细胞数约为10.,培养液为含10小牛血清 (NBS)的RPMI1640液,逐孔加药,分别加入终浓 度为0.1,0.2,0.4~ug/ml的rhCD40L,和终浓度为 10一,10一,10mo|/L的NS_398,以及终浓度为 10mol/L的阿司匹林,每种浓度3孔,培养24h 后收集上清液,一20?冻存;未加药孔设为空白对 [作者简介]樊民,博士,主治医师. C0rresp0ndingauthor.E-mail:ggwu@medmail.eom.en ? 846?第二军医大学2006年8月,第27卷 照.此外,在加入终浓度为0.4~tg/mlrhCD40L的 基础上,分别加入终浓度为10mol/L的阿司匹林 和NS-398,培养24h后收集标本备测,每种标本均 设3孔. 1.3酶谱法测定上述上清中MMPs活性取1O l上清液样本与等体积的上样缓冲液混合,上样,在 电泳槽中加入预冷的电泳缓冲液,接通电源,电泳 180rain后溴酚蓝到达底线,停止电泳.小心将胶 剥离,浸泡于2.5%Triton液中30rain,然后将胶浸 泡于底物缓冲液中,37?过夜.次日将底物缓冲液 弃去,0.59/6考马斯亮蓝染色20rain,脱色液脱色至 凝胶蓝色背景上可见白色透明条带. 1.4统计学处理以SxImag25图像系统计 算条带的灰度值.实验重复3次,以空白对照的灰 度值为1,实验组数据与对照组相比取值,所有数据 以?S表示;以SPSS10.1软件进行t检验和方差 分析,P<O.05认为差异具有统计学意义. 2结果 2.1不同浓度rhCD40L对U973细胞分泌MMPs 的影响以不同浓度rhCD40L(0.1,0.2,0.4g/ m1)与U937细胞作用24h后,在蓝色的凝胶背景 上可见两条清晰的透明条带,分别位于68000和 92000处,相应分子量分别为MMP一2和MMP-9. 经SxImag25图像分析比较不同条件下的灰度值, 结果显示,rhCD40L可使MMP-2和MMP-9活性 增加,且随浓度的增加而逐渐增强,0.4~tg/mlrh- CD40L作用最强(图1). 茸 昌 鑫 蔓 control0.10.20.4 rhCD40L(oa/l~g.ml) 图l不同浓度rhCIMOL作用24h对U937 细胞分泌MMP-2及MMP.9的影响 Fig1EffectofrhCD40Latdifferentconcentrations onMMP.2andMMP.9secretionbyU973cells *P<0.05.*P<0.01control;"=3,?S 2.2不同浓度NS-398对U937细胞分泌MMPs t 的影响不同浓度NS一398(10一,10_.,10mol/ L)作用24h的上清液MMPs活性测定结果显示 NS-398可抑制MMP一2和MMP一9的活性,且抑制 作用随剂量的增加而增强(图2). g 鑫 要 Control0.10-20.4 NS一398(ca/mmol?L) 图2不同浓度NS-398作用24h后对 U937细胞分泌MMP.2及MMP-9的影响 Fig2EffectofNS-398atdifferentconcentrationson MMP-2andMMP-9secretionbyU973cells P<0.05control;"=3,? 2.3NS-398和阿司匹林对rhCD40L诱导U937细 胞分泌MMPs的影响rhCD40L(0.4rtg/m1)分别 与NS-398,阿司匹林共同作用24h后,经SxImag25 图像分析测定条带的灰度值,结果显示,NS-398,阿 司匹林均可抑制rhCD4OL诱导U937细胞分泌 MMP一2和MMP一9(P<0.01),NS一398的抑制作用 强于阿司匹林(P<0.05). 鲁 昌 嚣 蔓 ControlCD40LASA+NS一398+ CD40LCD40L 图3NS-398和阿司匹林对rhCIMOL 诱导MMPs表达的影响 Fig3EffectsofNs-398andaspirinonexpression ofMMPsinducedbyrhCD40L *P<O.05,P<0.01"UScontrol;?P<0.05"USCD40L;?P< 0.05sASA+CD40L;"=3,? 3讨论 急性冠脉综合征(ACS)是一系列危及患者生命 的临床急症,包括不稳定型心绞痛,急性心肌梗死和 猝死.研究证实粥样硬化斑块由稳定转为不稳定, 2O8642 ??OOOOO O5O5O5 322??OO O5O5O5 322?lOO 第8期.樊民,等.CD40配体通过诱导型环氧合酶途径诱导单核巨噬细胞分泌基质 金属蛋白酶?847? 继而破裂导致血栓形成是ACS最主要的发病机制. MMPs是一族Ca和Zn依赖性酶,pH值呈中性 时,它可以降解所有细胞外基质成分.MMPs家族 可降解各型胶原,明胶,纤维结合素,层连蛋白,其中 MMP一1特异性降解I,?型和?型胶原,MMP一2和 MMP一9降解变性的胶原(明胶)和弹性蛋白.研究 发现人冠状动脉不稳定斑块中间质胶原酶,明胶酶 及基质溶解素I的表达均有所增加;对不稳定型和 稳定型心绞痛患者旋切的斑块组织中明胶酶的检测 表明,前者明胶酶的量明显多于后者.炎性细胞分 泌的多种细胞因子可以促进巨噬细胞分泌MMPs, 但MMPs是以酶原形式分泌的,只有在受到激活活 化才能发挥作用.MMPs酶原一经激活,即成为具 有活性的MMPs,降解纤维帽中细胞外基质成分,使 纤维帽变薄,斑块不稳定而易于破裂. 近年来CD40和CD40L在AS发生和斑块稳定 性中的作用日益引起人们的重视.无论早期还是晚 期复杂AS病变中都有CD40和CD40L的表达,尤 其在斑块易破裂的肩部及破裂的斑块中更为显着. 多个研究发现,CD40L诱导而CD40L抗体抑制基 质金属蛋白酶表达[2.].CD40L可促进AS相关细 胞(如巨噬细胞,内皮细胞和血管平滑肌细胞)分泌 表达趋化因子,黏附分子,细胞因子,MMPs及促凝 因子,通过CD40能够诱导斑块相关细胞表达 MMPs与TF表达,从而诱发急性冠脉事件. Mehta等发现阿司匹林可以抑制人冠状动脉 内皮细胞中MMP一1的活性,同时另外一些研究[5 发现阿司匹林能够抑制MMP一2和MMP一9活性. Rupp等发现肺炎衣原体感染经由p38和p44/42 MAPK信号途径可诱导COX-2mRNA和蛋白快速 持续表达,而肺炎衣原体感染诱导的PGE和 MMP一1表达增加可以完全被NS一398所抑制;其他 研究者发现MMP一2和MMP一9表达增加是一个 PGEz依赖的过程;然而也有人得出相反的结果, Pillinger等[1叩发现COX一2介导的PGE通过抑制 ERK活性而抑制MMP一1的表达. 本实验以明胶为底物,采用SDS—PAGE电泳酶 谱分析方法分析巨噬细胞培养上清液中MMPs的 活性以及不同浓度的rhCD40L和COX-2抑制剂及 阿司匹林对其活性的影响.结果显示,U937细胞培 养上清液中有MMP一2及MMP一9活性表达,而用 NS-398和阿司匹林作用后,条带的亮度明显减弱, 表明MMP一2及MMP一9活性明显减低,且随着浓度 的增加,对MMP活性的抑制作用越强.而 rhCD40L可使MMP一2及MMP一9活性增加,亦呈剂 量依赖性,以0.4~g/ml剂量时作用最强.阿司匹 林及NS一398均可以抑制rhCD40L诱导的MMP一2 及MMP一9活性增加,而NS-398的作用强于阿司匹 林.由此我们推测rhCD40L对MMPs的诱导作用 可能与COX有关,而与COX-2的相关性可能较 COX一1更密切. [参考文献] [1]SchonbeekU,LibbyP.CINOsignalingandplaqueinstability [J].CireRes,2001,89:1092—1103. [2]NagashimaH,AokaY,SakomuraY,eta1.Matrixmetallo— proteinase2issuppressedbytrapidil,aCD40一CD40ligand pathwayinhibitor,inhumanabdominalaorticaneurysmwall [J].JVascSurg,2004,39:447—453. 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