[word格式] 钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功能分析

[word格式] 钩端螺旋体liprmA基因的达及其产物的纯化与功能分析 钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的 纯化与功能分析 遗传HEREDITAS(Beijing)27(5):792,796,2005研究 钩端螺旋体liprmA基因的表达及其 产物的纯化与功能分析 孙艳菊’,周忠卫’,姚建秀’,孙体昌,许琰艳’,文 (1中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京100101; 2北京科技大学土木与环境工程学院,北京100083) 雅’,鲍时来’ 摘要:以钩端螺旋体基因组DNA为,通过酶联聚合反应(PCR)得到钩端螺旋体中prmA的同源基因liprmA 的全基因编码序列,并克隆到原核表达载体pET22b中.通过优化大肠杆菌培养和诱导条件,含目的蛋白的融合蛋 白可溶表达量达到40mg/L,约占菌体总蛋白的40%.经Ni—NTAHisBind亲和柱纯化,得到纯度大于95%的目的 蛋白.氨基酸序列同源性分析显示liPrmA与原核生物和真核生物的核糖体蛋白L11甲基化转移酶的功能域一级 结构高度一致;活性分析显示.纯化的liPrmA有钩端螺旋体核糖体蛋白L11甲基化转移酶的活性. 关键词:钩端螺旋体甲基化转移酶;钩端螺旋体;基因表达;纯化;大肠 杆菌 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编 号:0253—9772(2005)05—0792—05 GeneExpression,Purificationand FunctionalAnalysisofliprmA SUNYan—Ju,ZHOUZhong—Wei’,YAOJian—Xiu,SUNTi—Chang, XUYah—Yan.WENYa’.BAOShi—Lai (1InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology,OhineseAcademyofSciences.Beijing100101,China 2UniversityofScienceandTechnologyofBeijing.Beijing100083.China) Abstract:Leptospirainterrogans(Linterrogans)genomicDNAwasusedastemplatetoamplifythefull—lengthgene forribosomalproteinL11methyItransferase(f『尸 m1A)byPCR.ThepET22b一/liprmAexpressionplasmidwassuccess— fuIlyconstructedinEscherichiacoil(E.coil)strainTOP10andconfirmedbyrestrictionenzymedigestandsequen— cing.ThroughoptimizingexpressionoftherecombinantIiPrmA一 6xHisfusionproteininexpressionhostEcoil.BL21. theyieldofsolubletargetproteinreached40mg(1iterculture), TheLiPrmAwaspurifiedtoapparenthomogeneityin asinglestepusingNi—NTAHisBindchromatographyAminoacidhomolog ousanalysisshowedthatIiPrmAsharedsig— nificantidentitywithotherprokaryoticPrmAandeukaryoticputativePrmAi nthecatalyticregionincludingAdoMetbind— ingdomainMethylationactivityexperimentsshowedpurifiedliPrmAwasab letocatalyzetheribosomalproteinL11Of adenosyl—methionine( L.interrogansmethylatedunderthepresenceofS— AdoMet) Keywords:ribosomalproteinL11methyltransferase;Leptospirointerrog~n s;geneexpression;purification;Esche— richiacolf 核糖体是蛋白质合成的细胞器,原核生物的核 糖体是由rRNA和核糖体蛋白两部分组成.核糖体 蛋白正常发挥作用是核糖体保持功能正常的关键因 素:.通过研究人们发现,核糖体蛋白L11是一个 收稿日期:2004—09—06;修回日期:2004—10—21 作者简介:孙艳菊(1972),女,硕士研究生,专业方向:生物化工 通讯作者:鲍时来(1964),男,副研究员,研究方向:蛋白质甲基化转移 酶结构和功能,DNA损伤与修复.E-mail:slbao@geneticsaccn;Te 86—10—64889350 5期孙艳菊等:钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功 能分析793 重要的核糖体蛋白,其功能包括体内胁迫应答一, 核糖体亚基联合,翻译停止,在人体内能增强 P53(肿瘤抑制蛋白)的稳定性和活性一?等,而L11 的功能受多种翻译后修饰的调控,其中甲基化 是最经常发生的调控方式之一.目前的研究普遍认 为核糖体蛋白L11甲基化转移酶(PrmA)是细菌中 惟一确认催化L11甲基化的酶0,它负责将9个甲 基转移至L11的N末端结构域.截止目前尚未有 PrmA作用机理的报道. 钩端螺旋体(Leptospirainterregans)感染引起 的钩虫病是世界上广泛传播的人畜共患疾病之一, 症状从感冒到多器官功能衰竭的weil’S症一”j.随 着分子生物学技术的发展,人们对该病的研究重点 放在了基础研究和应用研究上?j.我国国家人 类基因中心南方研究中心于2002年率先完成了钩 端螺旋体全基因组的测定0,为深入研究钩端螺旋 体和该病的发病机理及治疗打下了良好的基础.钩 端螺旋体中prmA同源基因,liprmA(LA1391, AE011318),由第一条染色体编码,基因编码区不含 有内含子.本文报道了liprmA和L11在钩端螺 旋体中的同源基因『『L11(NC一004342)的克隆及其 在大肠杆菌中的表达,生化实验证明所表达的liPr— mA蛋白确实具有催化?L11甲基化的活性,这为进 一 步研究它们的相互作用机理及钩端螺旋体IiPrmA 的功能奠定了基础. 1材料和方法 1.1菌株与质粒 大肠杆菌TOP10,BL21和钩端螺旋体基因组 DNA由本研究组提供.质粒pET22b和pET28a购 自Novogen公司. 1.2试剂,酶与仪器 [.H]标记的s一腺苷一L.甲硫氨酸([.H]AdoMet) 购自PerkinEImerLifeSciences公司;NAMP100 Amplify试剂购自AmershamBiesciences公司;Ni— NTAHisBind介质购自Nevagen公司. 1.3方法 1.3.1liprmA和f『L11基因的扩增及鉴定 用PCR方法扩增IJprmA和『『L11基因.根据 国家人类基因中心南方研究中心公布的钩端螺旋体 liprmA(AE011318)和J『L11(NC一004342)基因序列, 各自设计并合成一对引物.liprmA上游引物为5一 AACATATGAGATATAGAGAAATCATATTAAG一3,含 有NdeI酶切位点;下游引物为5”-AACTCGAGTC— CTTTTCTTTTCCATTCGATC一3,含有XheI酶切 位点.『『L11上游引物为5一CCGGATCCATG— GCAGCAAAAAAAGTAGTAAAGCAGATC一3,含有 BamHI酶切位点;下游引物为5一AAAAGCTTCTA— AGCCTCTACAGTGACGCCCATGGAGCG一3,含有 Hind?酶切位点.以钩端螺旋体DNA为模板,扩 增长度为903bp的liprmA和429bp的『『L11基 因.反应条件:95?预变性2min,再以94?变性30 S,低温复性(1iprmA55?复性40S,『『L1165?复性 30S),72?延伸90S循环30次,最后72?10min 补平.PeR产物都用EcoRI进行酶切鉴定. 1.3.2liprmA和胜11重组质粒的构建与鉴定 liprmAPCR扩增产物和pET22b质粒分别用 NdeI和XhoI双酶切,『『L11PCR产物和pET28a 质粒分别用BamHI和Hind?双酶切,目的片段经 柱离心式胶回收试剂盒回收后,用T4DNA连接酶 连接,连接产物用CaCI法转化大肠杆菌(E.coli) TOP10,阳性克隆用酶切法做初步鉴定后,再经序列 测定进一步确定构建结果.构建好的质粒分别命名 为pET22b/liprmA和pET28a/『『L11. 1.3.3质粒DNA的提取,酶切,回收,连接,转化 参照分子克隆实验手册. 1.3.4pET22b/liprmA和pET28a/liL11重组基因 在大肠杆菌中的表达 将pET22b/liprmA和pET28a/liL11的重组质 粒用CaCI2法转化E.celiBL21,含pET22b/liprmA 重组子的转化产物涂布含100ug/mL氨苄青霉素的 LB固体培养基平板,含pET28a/liL11重组子的转 化产物涂布含50pg/mL卡那霉素的LB固体培养 基平板,37?培养过夜.分别挑取平板上单克隆菌 于含相应抗性的液体LB培养基中,37?振荡过夜, 按1:100的比例转接至含相应抗性的液体LB培 养基中,37?振荡培养至OD?为0.6时,含 pET22b/liprmA重组子的菌体用0.6和0.8mmoI/ L的IPTG诱导,20?培养8h后4?,12000rpm/ min离心15rain,收取菌体,用12%的SDS—PAGE电 泳鉴定表达情况;含pET28a/liL11重组子的菌体用 O.6mmol/L的IPTG诱导,25?培养8h后4?, 12000rpm/min离心15min,收取菌体.用15%的 SDS—PAGE电泳鉴定表达情况.表达蛋白分别命名 794遗传HEREDITAS(Beijing)200527卷 为IiPrmA和IiL11. 1.35菌体破碎 收取的菌体以1:100(g:mL)溶于Ni—NTAHis Bind亲和柱平衡缓冲液中.IiPrmA用20mmoI/L Tris,300mmol/LNaCI,5mmol/L咪唑,pH85;?L11 用50mmoI/LTris,300mmoI/LNaCI,pH8.0,在冰 浴条件下超声破碎,破碎后菌体4?,12000rpm min离心40min,收取上清,4?保存. 1,3.6liPrmA的纯化 将IiPrmA超声离心上清用Ni—NTAHisBind亲 和柱进行纯化.采用pH8.0和8.5两个不同pH值 的缓冲液摸索纯化方法.平衡缓冲液:20mmoI/L Tris,300mmoI/LNaCI,5mmoI/L咪唑;冲洗缓冲液 I:20mmoI/LTris,300mmoI/LNaCI,10mmoIL 咪唑;冲洗缓冲液?:20mmoI/LTris,300mmoIL NaCI,100mmoI/L咪唑;洗脱缓冲液:20mmoIL Tris,300mmoI/LNaCI,300mmoIL咪唑.用12% 的SDS—PAGE检测各条件下目的蛋白纯度. 1.37IiPrmA酶活鉴定 将2ug纯化的liPrmA和20uLliL11的表达上 清,1pL(0,55pCi)[.H]AdoMet,适量EDTA(pH 8.0)和PMSF混合并用超纯水补充使总体积至50 uL,混合液中EDTA和PMSF的终浓度都为5 mmoI/L.对照品1不力口liL11,又寸照品2不力口liPr— mA,其余组分完全相同.3种混合液都在30?孵育 30min后加入SDS电泳上样缓冲液,95?煮5min, 15%SDS—PAGE电泳.电泳胶考马斯亮蓝染色脱 色后用信号放大试剂处理30min,干胶,压片,压好 的X光片在一80?曝光2d后冲洗?]. 2结果 2.1liprmAPCR扩增产物,pET22b/liprmA和 pET28a/liL11的鉴定 ffprmAPCR产物用EcoRI酶切后产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定为300bp和600bp两 条带;pET22b/liprmA用NdeI和XhoI双切后,得 到910和5400bp两条带,用NdeI/BarnHI双切 得到58O/5700bp两条带,结果都与预期值相符, 图1所示. pET22b/ffprmA和pET28a/IlL11序列测定结 果显示得到的克隆的基因序列与文献报道一致. 2.2IiPrmA和IiL11蛋白表达鉴定 重组质粒在大肠杆菌BL21中用不同浓度的 IPTG诱导表达后,菌体超声,沉淀和上清分别经 SDS—PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后,和相同条件 下诱导的含空载体的菌体比较. 123456bp ?---—一??- ??- —_一2OOO 1000 —--—— —?一一-——750 _?_-一5OO _—?-一25O 图1liprmAPCR产物和重组质粒酶切鉴定的 琼脂糖凝胶电泳分析 1:PCR产物;2:EcoRI酶切PCR产物; 3:pET22b,liprmA重组质粒;4,5:pET22bliprmA分别 用NdeIBarnHI和NdeIXhoI双酶切; 6:DNA分子量marker. Fig.1ldentificationandrestrictionanalysisof liprmAPCRproductandclonebyagarose gelelectrophoresis 1{PCRproduct;2:PCRproductdigestedbyEcoRI; 3:pET22bliprmARecombinantplasmid; 4:pET22bliprmAdigestedNdeI/BernHI; 5:pET22b/liprmAdigestedbyNdeIandXhoI; 6:DNAmarker 图2中明显看到含pET22b/liprmA的菌体诱导 后沉淀和上清中在35kDa处都多出一条蛋白带(箭 头所指),和用pET22b做载体时IiPrmA一6XHis融 合蛋白理论分子量一致,并且菌体用不同浓度的 IPTG诱导,上清中目的蛋白含量没有明显差异,所 以选用0.6mmoI/LIPTG,20?做为大量表达该蛋 白的条件.可溶蛋白表达量约占细菌蛋白总量的 40%左右,达到40mg/L. kDa 972 662 430 31O 12345678g1O11 兰秘 图2liPrmA诱导表达的SDA?PAGE图 1:蛋白marker;2,3:分别为末诱导的pET22b上清,沉淀; 4,5:pET22b08mmol,LIPTG诱导上清,沉淀; 6,7:pET22bliPrmA未诱导上清,沉淀; 8,9:pET22b,’liPrmA08mmol/LIPTG诱导上清,沉淀; 10,?:pET22b/liPrmA06mmolLIPTG诱导沉淀,tc清. Fig.2SDS-PAGEanalysisofexpressedliPrmA jProteinmarker;2,3:Non—inducedpET22bsupernatant andpellet;4,5:pET22bsupernatantandpelletafterinduced by08mmoILIPTG;6,7:Non—inducedpET22bliPrmA supernatantandpellet;8,9:pET22b/fiPrmAsupernatantand pelletafterinducedby08mmol/LJPTG;10,l1:pET22b/liPrmA pelletandsupernatantafterinducedby06mmol/LIPTG 5期孙艳菊等:钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功 能分析795 图3中明显看到含pET28a/liL11的菌体诱导 后上清中在18kDa处都多出一条蛋白带(箭头所 指).和用pET28a做载体时liL11—6xHis融合蛋白 的理论分子量一致. kDa1234 兰l一? 20.2二===叠 图3IiL11诱导表达的SDA—PAGE图 1:蛋白marker;2:诱导的pET28a全菌: 3,4:pET28a/IiL11诱导超声沉淀,上清. Fig.3SDS-PAGEanalysisofexpressedliU1 aftersonicated 1:Proteinmarker;2:pET28awholecellafterinduced; 3.4:pET28a/IiL11sonicatedpelletandsupernatant afterindLuced 2.3liPrmA蛋白的纯化鉴定 比较不同条件下纯化结果,确定最佳纯化条件 为:平衡缓冲液:20mmoI/LTris,300mmoI/L NaOI,5mmol/L咪唑,pH85;冲洗缓冲液:20 mmoILTris,300mmoI/LNaCI,10mmol/L咪唑,DH 8.5;洗脱缓冲液:20mmoILTris,300mmoIL NaOI,100mmol/L咪唑,pH85.该方法目的蛋白 收率高,纯度高.将Ni—NTAHisBind亲和柱洗脱时 的峰分3段收集,各组分用12%SDS—PAGE电泳检 测纯度.凝胶经考马斯亮蓝染色脱色后结果如图4 (箭头所指为目的蛋白),洗脱峰纯度在95%以上. kDa12345 972—d磷瞬 ..,薰 430—舞 一———— 310— 图4IiPrmA纯化后SDA-PAGE图 1:蛋白marker;2:牛血清白蛋白(15pg); 3,5:liPrmA洗脱组分. Fig.4SDS-PAGEanalysisofpurifiedliPrmA 1:Proteinmarker;2:BSA(15pg): 3,5:ElutepeakofpurifledliPrmA 2.4liPrmA酶活鉴定 图5中1,4为SDS—PAGE胶考马斯亮蓝染色 后图片(分子量在35kDa处箭头所指为IiPrmA,分 子量在18kDa处箭头所指为?L11),5,8依次为1 --, 4干胶压片后X光片曝光冲洗图片.由图可以看 到当只有[.HIAdoMet和liPrmA存在或只有[.H] AdoMet和?L11存在时,都没有发生甲基化反应, [.H]AdoMet,IiPrmA和liL11同时存在才能发生甲 基化反应.证明liPrmA以[.HIAdoMet为甲基供 体,能催化使?L11甲基化. kDa12348765 二=习——,20. 2二_:一一<1--- 图5IiPrmA酶活鉴定图 1:蛋白marker;2:IiL11f:清加[.H]AdoMet: 3:纯化liPrmA加[.H]AdoMet;4:纯化liPrmA加 [.H]AdoMet和liL11菌体上清. Fig.5AnalysisofliPrmAmethyItransferaseactivity 1:Proteinmolecularweightstandard:2:Supernatantwith liL11plusLHAdoMet;3:PurifiedliPrmAplus [.H]AdoMet;4:PurifiedIiPrmAplus [.H]AdoMetandsupernatantwithIiL11 3讨论 用CLUSTALW(182)multiplesequence alignment软件进行氨基酸序列分析.比较包括钩端 螺旋体在内的四种原核生物PrmA氨基酸全长序 列,IiPrmA(AAN48590),嗜热菌(Thermusther— mophilus)PrmA(AAS80645),链球菌(Streptococ— cusagalactiae)PrmA(AAN00829),大肠杆菌 (Escherichiacoil)PrmA(AAO76291),分析得知:氨 基酸一致性(identity)为29.44%,这说明原核生物 的PrmA结构和功能高度保守-20.21.比较IiPrmA (AAN48590),拟南芥(Arabidopsisthaliana)PrmA (BAB10722),人(Human)推断的PrmA(XP374839) 和加鼠(Mouse)PrmA(AAH65807)包括功能域在 内的10o个氨基酸序列,分析得知除AdoMet结合 功能域(DxGxGxGxL)高度保守外,氨基酸的一致性 很低.这说明物种由原核生物进化到植物和哺乳动 物的过程中PrmA功能域外的氨基酸受环境影响变 化很大. 大肠杆菌表达外源蛋白时,极易形成包含体,使 得纯化步骤繁琐,目的蛋白收率低.为此我们选择 20?做为诱导表达温度,增加了外源蛋白的可溶性 796遗传HEREDITAS(Beijing)200527卷 表达.此外,我们选用带有6个His标签的pET系 列载体做目的基因的表达载体,既保证了目的基因 高效转录与翻译,又简化了目的蛋白质的纯化步骤, 目的蛋白经过镍离子螯合层析柱一步纯化,纯度可 达95%以上.表达的融合蛋白中6xHis标签很小, 不会影响被纯化蛋白功能研究的研究. 参考文献(References): [1] [2] 3] [4] [5 [6] [7] [8] [9] [10] DecaturWA,FournierMJrRNAmod…catiOnsandribosome functionndsBiochemSc,,2002,27(7):344,351 ThakurtaDG.DraperDEContributionsofbasicresiduestori— bosomalproteinL11recognitionofRNAJMolBiol,2000.295 (3):569,580 OchiKArelaxed(re1)mutantofStreptomycescoelicolorA3 (2)withamissingribosomalproteinlackstheabilitytoaccumu— lateppGpp?A—factorandprodigiosinJGenMicrobiol,1990, 136(12)12405,2412 ZhangS,ScottJM,HaldenwangWGLossofribosomalpro— teinL11blocksstressactivationoftheBacillussubtilistran— scriptionfactorsigma(B)JBacterio1.2001.183(7)2316, 2321 WendrichTM,BlahaG,WllsonDN,MarahieIMA,NierhausK HDissectionofthemechnismforthestringentfactorRelAMol Cel,.2002.10(4):779,788 GotzF,FleischerC,PenCL,GualerziCOSubunitassocia— tiondefectsinEscherichiacoilribosomemutantslackingpro— teins$20andL11EurJBiochem,1989.183(1):19,24 TateWP,ShulzeH,NierhausKHTheEscherichiocellriboso— malproteinL11suppressesreleasefactor2butpromotesre— leasefactor1activitiesinpeptidechainterminationJBiol them,1983,258(21):12816,12820 TateWP,DogninMJ,NoahM,Stoffler—MeilickeM.Stoffler GTheNHz—terminaIdomainofEscherichiacolfribosomaIpro— teinL11,itsthree—dimenslenaIIocationandItsroleinthebind. ingofthereleasefactor1and2JBiolChem,1984,259(11): 7317,7324 DykeNV,XuW,MurgolaEJLimitationofribosomalprotein L11availability/nvivoaffectstranslationterminationJMolBi— ol,2002,319(2):329,339. 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