精品高密度发酵影响因素高密度脂蛋白高密度脂蛋白偏高

精品高密度发酵影响因素高密度脂蛋白高密度脂蛋白偏高 高密度培养 HCDC(high-cell density cultivation) HCDCHCDC的定义、优势HCDC的主要限制因素及解决方法HCDC的生物反应器HCDC的补料策略 1.1 高密度培养的定义高密度培养:是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌 1.2 高密度培养的优势提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等。 2.HCDC的主要限制因素固态或挥发性底物在液态培养基中溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累对细胞生长产生限制呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用 2.1 培养基高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。 2.2 培养温度培养温度随菌种、培养基成分和细胞生长阶段的不同而不同，温度不仅影响发酵液的理化性质，还对外源蛋白的表达和活性有很大的影响。细胞密度较高时，呼吸作用释放大量热量导致发酵液的温度升高，因此发酵设备需要快速有效的降温散热系统。温度还可作为高密度发酵的调控手段 温度的调控目前主要的控温策略是手动调节冷却水的流量针对不同的发酵过程，罐温控制方式也不相同。大致分为两类(据发酵过程中最适温度是否变化): 定值控制 程序设定控制(例如:自适应PID等) 2.3 pH发酵体系pH值是发酵液成分与细胞代谢综合作用的结果。C源消耗而产生的有机酸，CO2的溶解，补料的流加，次级代谢产物的积累，菌体自溶裂解等都可导致pH的变化。pH不仅是反映细胞生长代谢的指标，也是调控高密度培养的手段 pH调节pH的调节需要从发酵初始培养基开始，初始pH不同，最终发酵效果可能也会有很大差异。发酵过程中pH的调节，可分为两种:内源性调节:过程中通过补加C、N源调节(C源经代谢产酸使pH降低;供能不足时，N源的C骨架作为能源参与代谢，产生NH4使pH升高)外源性调节:流加酸(H3PO4)碱(氨水)调节。氨水还可以作为N源。 2.4 溶解氧(DO)溶解氧DO浓度很大程度上影响细胞生长及外源蛋白的表达。DO浓度随菌体密度的增加和呼吸作用的增强而降低，发酵液黏度增加也会影响氧传递的速率。DO浓度一旦低于临界氧浓度值，细胞停止生长，甚至死亡。 溶解氧的调节物理方法调节:增加空气流量，提高搅拌转速;增大罐压;通入纯氧(混合不均，易养中 毒)化学方法调节:加入H2O2(利用菌体产生的过氧化氢酶促使其分解产生O2)生物改造方法:在菌体中克隆具有提高养传递能力的透明颤藻蛋白(VHB) 2.5 比生长速度比生长速率【μ(dN/dT)/N】是高密度培养过程中最重要的过程参数，它影响细胞对营养成分的吸收和分配、细胞的生长、外源蛋白的表达与折叠、核糖体的浓度、RNA的浓度和副产物的生成与积累等一般认为大肠杆菌的比生长速率控制在0.10.3h-1之间较合适，能较好地避免或减少副产物乙酸的生成。但比生长速率也应根据菌株、培养条件、细胞生长?锥魏屯庠吹鞍资欠癖泶锏仁导是榭龆飨嘤Φ鹘凇?2.6 代谢副产物 (以大肠杆菌为例)大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。针对这个问题，可以从以下几方面予以考虑:发酵过程调控:指数流加;pH、DO在线监测反馈调节;透析发酵偶联。代谢工程调控:代谢工程以提高细胞产量、生产效率及细胞综合生理功能，降低或避免副产物为目的。与DNA重组技术结合有目的地改进代谢流流向及中间代谢物。 3. 补料策略培养基营养成分过高会抑制细胞的生长，采用流加补料是提高细胞浓度和外源蛋白产量的有效方式，高密度培养通过调节限制性底物的流加速率来调控细胞生长。目前报道的最高生物量Methylobacteriumextorquens已达到233 gDCW,L;已报道的高密度培养大肠杆菌最高生物量为190gDCW,L，非常接近大肠杆菌在液体培养基中可能达到的理论最高生物量水平200 gDCW,L。 反馈数据测量反馈补料主要是依靠各种探头的稳定、迅速、耐用的特性才得以实施。(1) 定量测量方法 实验室:在线葡萄糖监测:可加压加热的葡萄糖生物探头;流动-注入式分析;在线HPLC系统。 工业:主要是采用光学测量方法，包括荧光分析(主要是测生物量)，二维荧光分析(可监测蛋白质浓度变化)，近红外线光谱分析(C、N、生物量、副产物)，原位显微镜(细胞大小、体积、生物量等)，流式细胞仪(对每一个细胞进行分析)。(2) 定性调控方法(许多公司采用) 集成分析 模式识别 Knowledge-based systems(KBS) Expert systems(专家系统)