基因工程方法生产乙肝疫苗

基因方法生产乙肝疫苗 乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。[1] 我国乙肝感染率为60%，乙肝面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。[2] 疫苗接种是预防乙肝的主要途径。国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。[3] 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗。[4]1982年, Valenzuela等人在国际上首次成功运用基因手段构建重组质粒，在酵母中表达出乙肝病毒表面抗原。[7] 1986年，美国批准了酵母来源基因工程方法生产的乙肝疫苗投放市场。[5] 本文主要是简要总结运用基因工程方法，以酵母为载体生产乙肝疫苗的。 乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白，主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，前S1抗原和前S2抗原。乙肝病毒包膜相关蛋白的编码基因位于HBV基因组的S区。S区基因有三个起始密码子和同一个终止子，从不同的起始密码子开始转录，可得到三种不同的包膜蛋白。小蛋白（SHB,即主表面蛋白,S蛋白）包括表面抗原HBsAg（p24为非糖基化形式，gp27为糖基化形式），由226个氨基酸组成；中蛋白（MHB）除了具有S蛋白的226个氨基酸，N端多出55个氨基酸残基（前S2蛋白）；大蛋白（LHB）除了具有S蛋白和前S2蛋白还具有前S1蛋白。在完整的乙肝病毒Dane毒粒中，小蛋白、中蛋白与大蛋白通过各自S蛋白之间的二硫键共价连接，外包脂膜形成完整颗粒。由于三种蛋白中均包括S蛋白区域，故含有HBsAg的疫苗可以在机体中引发针对乙肝病毒的免疫反应。[2] 基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。[6] 这可能是由于原核表达系统中不能进行糖基化修饰，或者原核细胞环境不适合专性寄生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表达，故应选用真核表达系统。选用酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主系统，因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点，既可使蛋白以分泌形式表达，又可以使蛋白糖基化变为活性形式。克隆载体构建时，将编码HBsAg的基因（野生型adw）添加到酵母酒精脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）的启动子之后。如图1所示构建载体。[6]将质粒转化至酵母菌中，通过HBsAg抗体与酵母菌积累产物HBsAg之间的特异性反应筛选出成功转化的菌体。对筛选出的菌体进一步发酵培养，摸索合适的基因工程菌培养条件，使产物尽量高效积累。 基因工程法表达的乙肝病毒表面抗原以22nm的蛋白颗粒形式存在，分离纯化时可采用分离纯化蛋白质的方法，先浓缩，再精制纯化。具体方法如下：第一步浓缩时，先将发酵液离心，将酵母细胞置于高压均质机内进行破碎均一化处理，加入蛋白酶抑制剂后立即冷却，防止目的蛋白降解。再经过微滤和超滤系统处理去除细胞碎片进行第二步浓缩。第三步浓缩方法是硅胶吸附和硼酸洗脱。硅烷醇基表面的氢键可与乙肝病毒表面抗原蛋白结合，硼酸离洗后可得到HBsAg蛋白粗制品。精制纯化第一步采用丁基琼脂糖疏水层析，通过洗涤和收集得到高纯度表面抗原蛋白。第二步精制纯化采用亲和色谱法（原理是HBsAg抗原与其特异性抗体的结合）。[2] 精制纯化后还要进行除菌过滤。纯化出的抗原要进行下列多个的检验，合格后才可继续进行后续步骤。[7]（1）总蛋白量测定（2）抗原含量测定：通过SDS-PAGE检测产物是否是大小正确的HBsAg。再通过放射免疫实验（RIA），酶联免疫吸附实验（ELISA），或免疫印迹实验检测HBsAg含量。（3）抗原纯度测定：通过液相色谱或酸性蓝/银染SDS-PAGE检测总蛋白中HBsAg含量。（4）检测蛋白质、脂类、核酸、糖的种类和含量（要低于一定标准）。（5）检测载体DNA的残留量（要低于一定标准）。（6）检验是否无菌。 上述检验合格后进一步进行成品化处理。添加佐剂氢氧化铝（作用是增加抗原表面面积，延长抗原在体内保留时间，使抗原与淋巴细胞充分接触，使疫苗更容易诱发机体的免疫应答）和添加抗生素处理（避免细菌污染，破坏疫苗效果和安全性）。处理后要检测佐剂含量、抗生素含量和无菌性。此外，疫苗还要进行效价测定、热源检测。[7] 当以上检测全部合格后，疫苗才可以进行包装和贴标签处理。 综上所述，用基因工程法纺生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成品检测鉴定、包装几个步骤。对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性尤其重要。 目前对基因工程法生产乙肝疫苗方法的优化方向主要如下。第一，目的基因除了HBsAg外还可添加前S1蛋白和前S2蛋白。前S蛋白在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应中有十分重要的作用。[8] 若在疫苗中加入前S蛋白可增加疫苗的免疫原性，起更好的预防作用。第二，改变基因表达载体系统。若选用中国仓鼠细胞（CHO）作为基因表达系统，得到的蛋白折叠和糖基化形式更类似于天然乙肝病毒表面抗原。但是这种方法的主要问题是后续纯化处理后仍存在极少量外源DNA残留，有潜在致癌风险。第三，对分离纯化的工艺进行优化，提高产量，提高目的蛋白的最终纯度。这就需要综合利用多种浓缩和精制方法多次处理。 目前，运用基因工程法生产乙肝疫苗技术已经比较成熟，可为其它类似原理疫苗的制作提供范例。随着技术的发展，目前也已出现预防多种病毒的结合型的疫苗（例如白喉-百日咳-破伤风-乙肝病毒多价结合型疫苗[3]）。这种疫苗的出现大大减少接种工作复杂性，可取的事半功倍的预防效果。 图1 乙肝病毒表面蛋白表达载体的构建（摘自Pablo Valenzuela, Angelica Medina ,William J.Rutter Synthesis and assembly of Hepatitis B virus surface antigen particles in yeast. Nature Vol.298 22 July 1982） 参考文献： [1] William J. McAleer, Eugene B. Boynak, Robert Z.Maigetter, D. Engene Wampler, William J. Miller, Maurice R.Hilleman Human Hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Nature Vol. 307 12 January 1984 [2] 重组CHO细胞乙肝疫苗生产工艺的优化  孙研  吉林大学毕业论文  2009年 [3] Hepatitis B vaccines  Daniel Shouval EASL International Consensus Conference on Hepatitis B [4]William J. McAleer, Eugene B. Boynak, Robert Z.Maigetter, D. Engene Wampler, William J. Miller, Maurice R.Hilleman Human Hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Nature Vol. 307 12 January 1984 [5] M.R. Hilleman Yeast Recombinant Hepatitis B Vaccine Infection 15 (1987 ) Nr.1 [6] Pablo Valenzuela, Angelica Medina ,William J.Rutter Synthesis and assembly of Hepatitis B virus surface antigen particles in yeast. Nature Vol.298 22 July 1982 [7] Hepatitis B Vaccine (rDNA) European Pharmacopoeia 6.0 01/2008:1056 [8] 李琪玲，前S2蛋白与乙型肝炎病毒复制的关系 《现代中西医结合杂志》，2005，14（22）：3035~3036.