466_肝气郁证模型大鼠下丘脑中单胺类神经递质检测分析

466_肝气郁证模型大鼠下丘脑中单胺类神经递质检测分析 肝气郁证模型大鼠下丘脑中单胺类神经递质检测分析 张惠云 薛玲 孙丽 (山东中医药大学 山东济南 250014) 摘要 目的 采用HPLC检测大鼠下丘脑中单胺类递质，探讨肝气郁证模型大鼠发病的微观机 用捆绑法造模制作肝气郁证模型大鼠，采用反相离子高效液相色谱(RP-IP-HPLC)制。方法 测定大鼠造模前后下丘脑中去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)及5-羟色胺 -HT)四种神经递质含量变化含量。结果 肝气郁证模型大鼠下丘脑中E、 DA、5-HT显著(5 升高， NE显著降低，且用药后均得到明显改善。结论 肝气郁证与下丘脑中E、DA、5-HT关 系密切，可以部分解释肝气郁证形成原因。 关键词 肝气郁证;下丘脑;单胺类神经递质;HPLC检测 Analysis of monoamine transmitters in hypothalamus of rats model of liver-qi depression syndrome Abstract Objective a high performance liquid chromatographic method was developed for the detection of monoamine transmitters in hypothalamus of rats to explore the micro pathogenesis of liver-qi depression. Methods adopting binding as a type of emotional stimulation method to make rats model of liver-qi depression，detect the monoamine neurotransmitter by RP-IP-HPLC of NE, E, DA and 5-HT(Results the contains of E，DA and 5-HT in hypothalamus of the model rats markedly increase while NE decrease markedly，and they all improved after medication. Conclusions depression of liver-qi is in close relation to the increase of some substance such as E, DA and 5-HT, which can partly explain some symptom of liver-qi depression. Key words depression of liver-qi; hypothalamus; monoamine transmitters; HPLC detection 单胺类神经递质是参与情绪活动、消化功能和疼痛机制的重要生化物质，神 [1]经递质的测定能够反映机体植物神经功能。该类神经递质在下丘脑部位含量很 高，作用活跃;下丘脑是自主神经系统的整合中枢,在维持机体内环境稳定和决 [2]定情绪、行为反应等方面起着重要作用。我们通过检测肝气郁证模型大鼠该部 位单胺类神经递质含量的变化，来探讨肝郁证发病的微现机制。 1 材料与仪器 1.1 材料 动物:健康未孕雌性大鼠，体重180,220g，Wistar种(由山东中医药大学 实验动物中心提供)30只，SPF级。 1 方药:经前舒颗粒(秦皇岛药业集团公司，批号:040513)。 1.2仪器与试剂 仪器:岛津LC-6A高效液相色谱仪，高速冷冻离心机， RF-535荧光检测器，C-R4A数据处理装置等。 、DA、5-HT品(Sigma A.R)，EDTA-NE(上海试剂厂A.R)，试剂:NE、Ad2 十二烷基磺酸钠(SDS)(上海试剂一厂A.R)。 2 方法与结果 2.1分组造模及用药 将大鼠随机分为3组:正常对照组、肝气郁模型组与肝气郁用药组各10只。 [3] 造模及用药:用绷带细条束绑大鼠四肢，使其行走困难，活动受限。造模同时用药组灌胃给经前舒颗粒2m1/100g体重(浓度l?1，生药材1g/m1);模型组大鼠给予同体积生理盐水;正常对照组大鼠不给予任何刺激，给同体积生理盐水，常规饲养。 2.2 组织取材 分别于造模第5天，取出各组大鼠，断头处死。取出大脑置于液氮罐内速冻1,2min取出，在冰浴玻片上取出下丘脑，精确称量后移至玻璃匀浆器中，加入预冷的0.1mol/LHCIO(内含0.05%EDTA-NE)1ml，于冰浴上充分研磨，制成匀4 2 浆，离心(20.000g，30min，0,2?)，取上清0,4?冷藏备用。 [4]2.3 溶液的制备 标准对照液 分别精密称取NE、E、DA、5-HT标准品适量，用流动相溶解制备成标准储备液。分别稀释储备液，作为各组分的标准品对照液。 供试液制备 取2.2项下供试液200μl置于EP管，加入等体积的5,高氯酸(v:v)溶液，摇匀，室温放置20min以充分沉淀蛋白质，离心(10000r/min, 15min) 取上清，0.22μm微孔滤膜过滤即得供试液。 [5] 2.4 RP-IP-HPLC测定 2.4.1色谱条件 色谱柱:CLC-ODS;流动相:PH2.5离子对试剂(每升中含SDS0.15g，EDTA-NE0.028g，HSO0.22ml，甲醇400ml);流速:1.2ml/min;柱温40?;检224 测波长:荧光激发波长285nm，发射波长313nm。 [6]2.4.2标准曲线制备 测定各组分的标准对照液，各对照液色谱峰面积A对浓度C作线性回归，得NE、E、DA、5-HT的线性回归方程，结果见1。 2 表1 标准品NE、E、DA、5-HT的线性范围 组分 回归方程(n=5) r NE C,1313.34A+505.00 0.999 E C,1524.37A +79.32 0.999 DA C, 774.60A+356.00 0.999 5-HT C, 620.01A+103.35 0.998 结果表明，四种组分标准曲线线性关系良好。 2.4.3 样品含量测定 受试大鼠下丘脑中5种单胺类神经递质含量结果见表2。 —表2 受试大鼠下丘脑中五种单胺类神经递质含量(ng/g湿重，?SD) , 组分 样本数(n) 正常对照组 肝气郁模型组 肝气郁给药组 NE 10 1245.13?68.36 849.13?83.36** 2390.01?228.58?? E 10 ----- 3879.82?362.51 2444.39?212.17?? DA 10 252.01?16.51 4583.70?424.59** 4133.39?391.04? 5-HT 10 1001.42?91.08 2312.71?236.37* 1943.80?184.46? 与正常对照组比较“*”P<0.05，“**”P<0.01;与造模组比较“?”P<0.05;“??”P<0.01。 结果表明:与正常对照组比较，模型大鼠下丘脑中E、DA、5-HT显著升高，NE显著降低，且均具有统计学意义;与模型组比较，用药后E、DA、5-HT显著降低，NE显著升高，四种神经递质含量均显著改善。 3 讨论 脑内NE是机体情绪活动的重要物质，NE含量升高和降低可分别引起情绪激动、急躁易怒与情绪低沉，抑郁寡欢。机体中枢内去甲肾上腺能神经元系统与5-HT能神经元系统在调节机体机能活动中常呈现对立统一关系。总的来说，5-HT对中枢以抑制为主，NE则以兴奋为主，两者含量改变则引起精神情志等方面的变化。 [7]脑内的DA在影响机体的一般行为和精神情绪活动方面也起着重要作用，它既是NE的前体，又是一种独立的神经递质,在结构和功能上与NE有密切联系，在中枢 [8]神经系统中主要起着调控情绪的作用。 从本实验结果可以看出，肝气郁证模型组大鼠下丘脑中NE含量明显低于正常对照组(P<0.01)。说明NE含量变化是肝气郁证情志改变的机制之一。而5-HT含量与NE改变相反，较正常对照组大鼠明显升高，具有显著性差异(P<0.05)。5-HT增加，NE含量下降，中枢活动以抑制为主，与造模大鼠呈现出抑郁神减、活动少、 3 饮食差、多似睡眠状相符。肝气郁证模型组大鼠DA含量比正常对照组大鼠显著升高(P<0.01)。从大鼠模型的整体反应及两证临床表现推测:DA可能对上述活动呈现抑制作用，模型大鼠的抑郁表现除了NE含量降低外可能还与DA含量升高有关。中枢内DA能神经元系统与NE能神经元系统有相互拮抗,DA含量升高进一步抑制NE [10]可能是肝气郁证其情志抑郁的微观机制之一。 活性，加重抑郁形成， [9]E作为神经递质在脑内含量很低，正常对照组大鼠E未能检出，模型组大鼠 各组分均得到改善。这表明，经前舒颗粒可以E含量升高。服用经前舒颗粒后， 降低下丘脑中E、DA、5-HT含量，提高NE含量，提示经前舒颗粒治疗肝气郁证可能是通过降低大鼠下丘脑中E、DA、5-HT含量，提高NE含量实现的。 情绪的产生机制非常复杂，情志异常涉及的神经递质、内分泌激素并非一种。因此，检测造模大鼠下丘脑中NE、E、DA及5-HT四种神经递质的含量，有助于从神经递质的相互联系相互影响的角度，去阐明大鼠模型的微观机制，为揭示肝疏泄失常的现代机理，提供实验资料与科学解释。 参考文献 [1]徐建阳，覃菁，陈慧侬，等.中医肝郁证的动物模型研究[J].广州中医药大学学报，2004， 21(1):73-76. [2] 沈自尹(中医基础理论现代研究[M](南京:江苏科学技术出版社(1985:227( [3] 吕志平.“肝郁”大鼠血浆TXA,、PGI2水平与肝微循环变化及逍遥散作用,J,(中国 微循环，2000，4(3):161. [4] 文江平，唐爱国.高效液相色谱法快速测定血清中的芳香族氨基酸.中国中医药信息杂志 [J]，1999，6(4):25. [5] 吴栩,王海军,高冬梅,等. 肝气逆证模型大鼠下丘脑中单胺类神经递质变化研究[J].山 东中医药大学学报.2005,29(4):304-305. [6] 刘师莲,张兆莲等.大鼠脑组织单胺类递质及其代谢产物的检测方法研究[J].山东大学 学报/医学版,2002,40(5):473-475 [7] 张燕云译(情绪心理学[M](沈阳:辽宁人民出版社，1987:399. [8] 毛海燕, 叶林，叶向荣.肝郁证大鼠中枢神经递质变化的观察[J].福建中医药.2002, 33 (2):17-18. [9] Neil Carlson Psychology Boston;Auyn Houst 1987;346. [10]刘玉莲,魏盛,张惠云，等.肝气逆肝气郁患者月经前后尿液儿茶酚胺含量分析[J].山东 中医杂志,2005,24 (8):459-461. 4