种植前人胚胎细胞荧光原位杂交检测染色体非整倍体

种植前人胚胎细胞荧光原位杂交检测染色体非整倍体 种植前人胚胎细胞荧光原位杂交检测染色 体非整倍体 L}|山医科大学学报(adJSUMS),1999.20(4j:311—3133l1 ? 技术交流? 种植前人胚胎细胞荧光原位杂交检测染色体非整倍体. 三{- (中山医科大学附属第一医院生殖医学中心{广州,510080) 摘要目的:建立应用13/21染色体特异性探针荧光原位杂交技术(HSH)榆测种植前人类胚胎13/21染色体非整倍体 的方法.方法:应用FTI?标记的13/21染色体着丝粒部位杂交的卫星重复序列探针对27个未受精卵母细胞和36个多精受 精胚胎的卵裂球进行原位杂交.结果:单倍体卵母细胞核呈现2个杂交信号,固定率80%,杂交效率67%;多精受精胚胎的卵 裂球棱呈现6个杂交信号,届定率72%,杂交效率65%结论:应用荧光原位杂交技术在卵母细胞和胚胎细胞可榆测13/21染 色体非整倍体= 主题词非整倍体性;染色体畸变;胚泡;原位杂交.荧光 中围号而——一于1f)er DetectionofAneuploidesofChromosomeinHuman Blastomeres/nV/~robyFISH LiXiaohongZhuangGuanglun (DepamtlentofObstetricandGynecology,FirstAfli]JatedHospitalofSunYat-senUniversity ofMedicalSciences.cuarh0u,5113080) AbstractObjective:Tostudvtheaneuploidyofehm~me13and21inblastomeresdevelopedmvr2ro.Met h- ods:UsingaIplhasatelliterepetitiveprobespecificforchromosome13and21,hybridiz崦27infertilizationovu/nand36 blastomcresfrompolyspemtieentbryosf0rinter-FISH.Results:O?mproduced2hybridizationsignals,fixingratew/ts 80%,hybridizationratewas67%;Blastonwxesproduced6hybridizationsignals,fixinglateWas72%,h ybriditagionrate was65%.Condusions:FISHCandetectehromosomeaneuploidyeffectivelyino~qflllflandblastomere sandCanbe印一 pliedtopreimplantationgeneticdiagnosis. Subjectheadaneuploidy;chromosomeabenations;blastocyst;insituhybridization,fluorescence 种植前遗传学诊断(preimplantationgeneticdlag— nosis,eGO)是产前诊断方法学上的一项新内容,并 已展现出良好的应用价值和前景ltl.已知染色体 非整倍体是引起自然流产,婴儿死亡及神经系统发 育迟缓的重要原因,为此,我们探索荧光原位杂交 (fluorescenceinsituhybridization,FISH)检测人胚胎 细胞13/21染色体非整倍体的方法.以便(4 璃吸管,用玻璃吸管分别将卵母细胞及多精受精胚 胎在T)~xtesacid液(pH2.4)中约1s,去掉透明带 取卵母细胞及单个卵裂球分别进行荧光原位杂交 程序(图1). @Zona—.thinZona——removed二 OOooOO [\//] FISH 图I胚胎卵裂球 Fig.1瑚a0Tneofembl-yo 1.1.2低渗及固定处理低渗液为0.075tool氯 化钾,固定液为V(乙酸):V(甲醇)=(1:3)(自 制).分别将去除透明带的卵母细胞和单个卵裂球 细胞置于滴有2,3fL低渗液的玻片上(37?). 低渗液干之前在卵裂球上方滴加固定液至胞浆消 失.固定好的载玻片置装有甲醇的染色罐中2 rnin.若不立即作F璐H,把载玻片晾干后放入盒内 密封,一如?保存. 1,2探针 采用直接FITC标记的13/21染色体着丝粒部 位杂交的Q卫星重复序列探针ehiomosome13/21 a1pha-satelllte(DI3L1/D21Z1)Direct—labeled/Fluores— cein,Oncor公司Jc 1.3原位杂交 将标本从甲醇中取出自然晾干后置倒置显微 镜下确认固定的单个细胞是否存在,置体积分数为 70%甲酰胺(One,or)中73?5min,取出立即置一20 ?体积分数为70%,85%和1G0%乙醇脱水各2 min.取l探针加入2()fL杂交混合液(Oncor), 混匀,含探针的杂交混合液在7O?变性5min后置 冰水中,取2,3已变性的含探针的杂交混合液 准确地滴于载玻片的样本上,盖上盖玻片,用胶牯 合剂(mbberCenl~l-lt)封片,置于已预湿的湿盒中,37 ?温箱杂交4h. 1.4杂交后洗脱及信号检测 从湿盒取出标本,除去盖玻片,依次置0.4× ssc/~积分数为0.3%NP一40液(Oncor)73?5 min,2×SSC/体积分数为0.1%NP一40(Oncor)室 温1min,暗盒中晾干.加含D.~LPI(Oncor)的抗褪色 液复染,封片,镜检. 2结果 采用OlympusEX60荧光显微镜观察,结果见 图(2,3):a重复序列探针与卵母细胞及卵裂球核杂 交信号集中,荧光在油镜下可见在蓝色背景上有绿 色的荧光杂交斑点,单倍体卵母细胞标本核多呈现 2个杂交信号,三原核发育的胚胎卵裂球核多呈现 6个杂交信号(表1). 图22个杂交信号 ng.2TwoHybridizationsisals 图36个杂交信号 F.3SixHybrld~llon逝?出 第4期李晓红,等种植前人B胎细胞荧光碌位杂交幢染色傩非整倍休3l3 表1卵母细胞及卵裂球标丰的固定率,杂交率及棱中杂交信号数 Table1Fi:dng?HybridizationRateinovunvblastomere 3讨论 1986年Cremer等l2将FISH技术应用于产前诊 断,成功地捡出了18一三体,开始r问期细胞遗传 学在临床上的应用,I990年Handde等报道了 世界首例PGD后试管婴儿诞生,随后又以不同标 记的x,Y特异性DNA探针通过FISH鉴别胎儿性 别.近年Munne等l4.应用多色FISH以不同标记 的探针同时与卵裂球细胞杂交,诊断胚胎非整倍 体FISH已成为医学遗传学领域中一项极为重要 的研究手段J目前先天性疾病已经成为婴儿死 亡率的主要原因之一,其中染色体畸变占有很大比 例.本试验证明运用FISH技术,以重复序列探针 与卵母细胞及肛胎细胞杂交,能迅速检出染色体非 整倍体,对胚胎染色体畸变的PGD具有重大的临 床意义.本试验的l3/21染色体n重复序列探针 因其DNA片段重复几百到几千次,故杂交信号强. 在核中分布集中,能迅速地做出诊断(8h之内),满 足了胚胎在种植窗(preimplantationwindow)内移植 的需要本试验的结果表明该探针能有效的区分 单倍体及非整倍体.尽管该探针不能区分13和2】 号染色体,但13,18,2I,x,Y数目异常占染色体数 目异常的95%_,因此可在PGD中检测部分染色 体单体或三体. 由于PcD获得的样本量少,胚胎细胞本身又 有嵌合体的可能.因此,当作一个诊断时取两个细 胞分别杂交较杂交单个细胞更好 参考文献 lJosephGSebenkerprogressinprelmplantatJongeneticsJAs? sistReprodandgenet.1998.15f1):9 2CremerT.Lmtgegentl『.BrucknerA,e/a/.Detectionof ehremosomeaben’anor~inthe}lIl【rIaI|interphasenucleusbvvi? sualizafionofspecifictarget矾Aswithradioactiveand[IO/1-F~? dE,activeinsituhybridizationtechniquediagnosisoftrJsomy18 withprobeLI84H?Cenet,[986,74(4j;346 3Hand?sideAH,KlHJ吨i删uEH.HaedyK.a/.pf~g/lall- ciesfromN~iedhumanpvimp[amati~embryossexedbyY specificDNAamplificationNature,1990,3~(6268j:768 4MutmeS.WeierU.SimultaneousenmneratJonofchrmrl口?s唧es X,Y,13,l8,21ininterphasecellsforpreimplmlm~ongenetic diagnosisofaneupfoiC, vtoge~etCellGenet,1997,75(4): 263 5CorillCM,HatwrJC,WinstonRM,etflnfe~ec叩? pieswithRo~antranslcctrlionpminlp|antationgenetic am@sisofembry,csrevealsckaoticcleavagedJvisiom.Hum Cenet,1998,102(1):117 6ILaapAKAdvancesinfltloresceneeinsituhybridization MutatRes,1998,4OO(2):287 7RogerV,RobertR,HandemleyerR,ela/Prenataldiagno? siswithrepitifiveinsituhybridizationprobesAmJMed Genet,1992,43(5j:848 (1999.O卜15收稿1999.憾.o3修回)