从孕妇外周血分选胎儿细胞行无创性产前诊断的研究

从孕妇外周血分选胎儿细胞行无创性产前诊断的研究 前 言 一、本研究的现实意义 在过去的半个多世纪中,伴随着人口和疾病模式的转变,出生缺陷问题日益突出,已成为我国婴儿死亡、儿童和成人残疾的主要原因之一。根据1986年至1987年卫生部组织的全国出生缺陷监测资料,全国出生缺陷的总发生率为13.01‰。但我国出生缺陷监测结果所显示的数据,并不能反映我国出生缺陷的真实发生水平,监测所得到的出生缺陷发生率仅仅是冰山之顶,明显偏低。国外研究明,在发展中国家,严重遗传性疾病和出生缺陷到5岁时的累积发生率可达到78.6‰,但在出生时仅仅能发现其中的27.6‰。鉴于我国出生缺陷监测对象偏重于城市地区、诊断水平还不高等原因,我国专家根据现有的国内外资料判断我国出生缺陷的发生率应在40‰~50‰以上,我国每年实际发生的出生缺陷至少有80万~100万例,即每30秒~40秒钟就有一个出生缺陷儿降生。所以,从2000年起,我国决定在全国范围开展出生缺陷干预工程。 出生缺陷干预的关键是预防,世界卫生组织提出的预防出生缺陷的“三级预防”策略是: 一级预防是防止出生缺陷儿的发生,包括婚前检查、遗传咨询、选择最佳的生育年龄、孕早期保健,包括合理营养、预防感染、谨慎用药、戒烟戒酒、避免接触放射线和有毒有害物质、避免接触高温环境等;二级预防是减少出生缺陷儿的出生,主要是在孕期通过早发现、早诊断和早采取措施,以预防出生缺陷儿的出生;三级预防是对出生缺陷的治疗。由于大部分出生缺陷还缺乏特异的一级预防措施,目前出生缺陷干预在很大程度上依赖于产前筛查和产前诊断。 产前诊断是近代医学科 学的一项重大进展,它通过对胚胎或胎儿是否患有某种遗传病或先天缺陷在出生前作出准确判断,指导进行选择性流产,以防止病残儿出生,从而使生育健康后代的理想成为现实。在过去的几十年中,产前诊断的方法主要是靠绒毛活检 (chorionic villus sampling,CVS)、羊膜腔穿刺和脐静脉穿刺等有创伤性的检查,且主要是应用在怀疑孕育有染色体病胎儿的孕妇和高龄孕妇中。但作为一个群体,这些高危人群生出的唐氏综合症患儿的绝对数量只占20%左右,80%以上的患儿是35岁以下的低危孕妇所生【1】,而这些孕妇往往并没有做产前诊断,原因是这些有创性产前诊断方法可能导致0.5%~1%的胎儿流产或早产,另外还可能造成宫内感染、胎儿肢体损伤、孕妇焦虑症等不良后果,从而妨碍了产前诊断的普及。 目前在临床上常规应用的无创性产前诊断方法包括超声和孕妇血清筛查。但研究证实这两种方法均不十分理想。Ewigman及其同事【2】在1993年进行了一项多中心研究,15000名选用超声筛查的孕妇,只有35%的胎儿畸形被发现,且这其中只有一半(17%)的异常是在妊娠24周以前被发现的。尽管许多超声学标志如胎儿颈项透明层(nuchal fold thickening,NT)、心脏缺陷、股骨及鼻骨缩短等被证明与唐氏综合征有关,但用这些联合指标综合也只能诊断出40%~60%的唐氏综合征患儿【3】。在孕妇血清中含有由胎儿或胎盘产生的特异性蛋白如未结合雌三醇、甲胎蛋白及人绒毛膜促性腺激素,如果在孕早期检测孕妇血清中以上三种激素的含量,即所谓孕妇血清学三联筛查,用于35岁以上的高龄孕妇时,可以发现87%的唐氏综合征,但假阳性率高达23%~34%;如果用于筛查小于35岁的孕妇,则只有60%的唐氏综合征病例被筛出,假阳性率为5%【4】,所以这种筛查方法也是不理想的。因此探索一条可应用于所有孕妇的、常规筛查胎儿 染色体异常的无创伤性产前诊断新途径近年来一直是当前国际医学遗传学和生殖医学界关注的焦点之一。本研究即是要探讨一种从孕妇外周血中分选出胎儿有核红细胞从而进行无创伤性产前诊断的方法,如果这种方法可行并能成功应用于临床,必将使未来的产前诊断更加简便、安全和普及,必将明显降低新生儿出生缺陷发生率,提高出生人口素质,具有极大的经济效益和社会效益。 二、孕妇外周血中胎儿细胞的发现及种类 早在1893年,Schmol就在死于子痫的孕妇肺循环中发现滋养层细胞,首先提出孕妇血中存在来自胎儿的细胞,该观点后来被其他研究者所证实【5】。尽管滋养层细胞早在妊娠6周就可以出现于孕妇血中,终止妊娠后即不复存在,其特殊的形态也便于在显微镜下辨认,但因其在正常妊娠中,会很快在肺循环中被清除,且其多核特征及嵌合性特点干扰遗传学分析,故滋养层细胞并没有作为胎儿细胞的分选对象而得到广泛应用。 1969年,Walknowska【6】等发现了母血中的胎儿淋巴细胞可以说是无创伤性产前诊断技术发展的一个里程碑。他们发现在孕有男性胎儿的母血中的淋巴细胞分裂原存在Y染色体。1979年,Herzenberg等【7】报道使用HLA-A2的单克隆抗体,用荧光激活的细胞分选法自孕妇外周血中分离出了淋巴细胞。但因淋巴细胞的生存周期较长,难以分辨是否来源于前一次妊娠的胎儿,所以淋巴细胞也不适宜作为分选对象。 1990年,Bianchi 等【8】首先用FACS法发现了孕妇血中的胎儿有核红细胞nucleated red blood cell, NRBC,其他研究小组也相继用各种方法分离出了胎儿NRBC。目前认为, 胎儿有核红细胞是用作无创性产前诊断最理想的细胞类型, 因为:1.NRBC在孕早期是胎儿血中最普遍的细胞。孕11周时,在胎儿循环 中NRBC占红细胞总数的10%【9】,成人血中的NRBC则极为罕见;2.生存周期短,近90天,不会受前一次妊娠的影响;3.含有细胞核基因的全部成分,分离后可直接用作分子遗传学分析;4.NRBC拥有很多不同的可用作分离的抗体,如细胞膜上的转铁蛋白受体(CD71)抗体以及细胞膜磷脂糖A(GPA)抗体。细胞浆内还有胚胎及胎儿血红蛋白或珠蛋白链 HbF ,γ、ε、δ肽链 ,有利于细胞的鉴别和分离 ,因此,对孕妇外周血中胎儿NRBC的研究日益受到人们的重视,是一种非常有前途的可用于进行产前诊断的靶细胞。本课题研究的也是孕妇外周血中的胎儿有核红细胞。 1992年,Wessman 【10】等用密度梯度离心法富集11位孕7~13周妇女血中的胎儿细胞并用原位杂交技术检测到103个Y染色体阳性细胞,其中62%形态学上为粒细胞,而38%为淋巴细胞,表明母胎间存在粒细胞交通而且早在孕7周即已发生。但这项工作未被重复。粒细胞的分离也很少受到关注。 尽管孕妇外周血中胎儿细胞的发现已有百余年历史,且1969年已有学者考虑到将它作为产前遗传病诊断的材料,但因基础研究条件不成熟,所以该研究被长期搁置,直到20世纪90年代,随着分子生物学和细胞生物学技术如单克隆抗体技术、流式细胞计数技术以及聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、荧光原位杂交fluorescence in situ hybridization, FISH技术的发展,使从母血循环中识别、分离和检测胎儿细胞成为可能, 从孕妇外周血分选胎儿细胞进行无创性产前诊断才再次成为国内外学者的研究热点。 三、孕妇外周血中胎儿细胞的富集分离技术及其标记性抗体 孕妇外周血中的胎儿细胞含量甚微,研究结果表明,胎/母细胞数目之比约为1:105~107【11】,所以对胎儿细胞要进行有效的富集分离才能用于进一步 的产前诊断。目前主要的方法有: 荧光激活的细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting, FACS)、磁激活细胞分选法(magnetic-activated cell sorting, MACS)、电荷介导分离法(charge flow separation, CFS)、简便的密度离心法、抗体结合柱法和单细胞的显微操作等。其中最常用的是FACS和MACS,本研究也先后选用了这两种方法对孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行富集分离。 FACS自1990年由Bianchi首次成功应用于胎儿NRBC的分选,现已成为有效的分离工具而被广泛应用于胎儿细胞的分离。其优点是富集的纯度较高,但耗时较长,设备昂贵,技术复杂,须专业技术人员操作。 MACS法1992年由Ganshirt-Ahkrt建立,其原理为在外加磁场的作用下,将结合磁性微粒的单克隆抗体标记的细胞分离出来。MACS系统的优点是用时短,费用相对低廉,可同时分离多个样本。其缺点是富集纯度相对较低,因其只能在一个标准参数上进行分选。 在富集和分离胎儿细胞过程中,选用特异性抗体来标记胎儿细胞是分离成功的关键。目前常用的有: 抗细胞膜上标记物抗体,包括抗转铁蛋白受体抗体CD71、抗凝血酶敏感蛋白受体抗体CD36; 抗细胞膜糖蛋白AGPA抗体; 胎儿有核红细胞的抗原标记γ珠蛋白抗体,以及代表胎儿HLA-GMRNA基因信号的抗原标志HLA-G【12】等。除了用上述特异的单克隆抗体进行阳性选择外,还可以采用阴性选择,即利用母体白细胞特异性抗原抗体CD45去除母体细胞后再进行阳性选择。由于尚未发现对胎儿细胞具有特异性的抗体,所以目前多数国内外学者认为采用联合标记的方法可提高胎儿细胞的分选数量及分选纯度【13】。 四、分选孕妇外周血中胎儿细胞在产前诊断中的应用 目前主要从基因和染色体两个水平上对孕妇外周血中胎儿细胞作遗传分析: 1. 基因水平上的遗传学分析基因水平上的遗传学分析主要是通过对分选出 的胎儿细胞进行特异性基因片断的扩增,从而鉴别胎儿性别、诊断胎儿β-地中海贫血、RhD血型和HLA多态性等。如Camashella应用PCR技术从孕妇外周血中扩增出父源性血红蛋白 Lepore 基因特异性 DNA ,正确诊断 2例胎儿血红蛋白病;Nagy【14】用GPA标记胎儿细胞,经流式细胞仪分选后用PCR诊断出2例Klinefelter综合征胎儿;国内学者陈小蔓【15】采用免疫磁珠法分离胎儿细胞,经套式PCR技术寻找男性胎儿SRY基因片断,扩增有效率为87.5%。国外学者Geifman-Holtzman【16】用 FACS 法从 Rh 阴性孕妇外周血分选到的胎儿 NRBC进行 Rh 位点的 PCR 扩增,预测胎儿 Rh 血型的特异性和敏感性分别为 100%和84%。 2. 染色体水平上的遗传学分析 应用孕妇外周血分选出的胎儿细胞进行染色体水平上的遗传学分析主要是通过荧光原位杂交诊断21-三体、18-三体和47,XYY等胎儿非整倍染色体病。Price 首次应用 18号染色体特异性探针对母血中胎儿细胞进行检测,诊断出1例18-三体胎儿;Sohda 等【17】用 Y 染色体特异性探针对 28例经 FACS 分离的孕妇外周血 NRBC 进行胎儿性别检测,其特异性达 100%,敏感性为88%;Bischoff等【18】将分离出胎儿 NRBC用五色探针做FISH,从40例标本中诊断出2例21-三体胎儿;Yang等【19】用GPA标记的免疫FISH从30例孕妇外周血中诊断出3例21-三体胎儿。 五、本研究的目的尽管从孕妇外周血分选胎儿细胞进行无创性产前诊断的研究近年来取得了较大的进展,但是目前大部分工作尚处于实验阶段,对于胎儿细胞是否真正可以被分选出来用于产前诊断,及其分选鉴定的方法、标记性抗体的选择等,国内外学者尚存在较大的争议。本研究的目的是探讨孕妇外周血中胎儿 有核红细胞的富集分选方法??FACS法和MACS法及其标记性抗体的选择,并对FISH法产前诊断胎儿性别及非整倍染色体病进行初步探讨,为从孕妇外周血分选胎儿细胞行无创性产前诊断积累资料和经验。 第一部分 流式细胞仪分选孕妇外周血CD71和HbF 标记的胎儿有核红细胞的研究 摘要 目的: 比较CD71单染,HbF单染和CD71、HbF双染对单个核细胞的标记情况,将双染色标记法用于流式细胞仪对孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行分选,并初步探讨NRBC比例与孕周的关系。 方法: 选用红细胞特异性抗体CD71、胎儿特异性抗体HbF对正常孕妇外周血、未孕妇女和胎儿脐血单个核细胞进行标记,并结合流式细胞仪对孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行分选。 结果: 用CD71和HbF进行双染色标记,正常孕妇、未孕妇女和脐血单个核细胞的阳性标记率与CD71或HbF单染色标记相比差异有显著性(p<0.01)。同时将双染色标记法成功地用于流式细胞仪分选出了孕妇外周血中的胎儿有核红细胞, NRBC的分选纯度达62?2.5%,其比例在妊娠21~24周达峰值。 结论: 用CD71和HbF双染色标记单个核细胞,可提高胎儿有核红细胞的特异性标记和分选纯度,有利于进一步的产前诊断工作;利用孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行产前诊断的最佳时间应在妊娠21~24周。 关键词: 流式细胞仪;胎儿有核红细胞;CD71;HbF The study of sorting fetal nucleated red blood cells from peripheral blood of pregnant women with the use of flowcytometry by CD71 and HbF staining method Abstract Objective: To compare mononuclear cells labled by CD71 or HbF single-staining method with CD71 and HbF double-staining one. To sort nucleated red blood cells in peripheral blood of pregnant women by flow cytometry using the latter method,and investigate the relationship of frequency of NRBC to gestational age Methods: Mononuclear cells in umbilical blood and peripheral blood in normal pregnant women and unpregnant women were labled by erythrocyte specific antibody CD71 and fetal specific antibody HbF. Furthermore, NRBC were sorted by flow cytometry Results: Compared double-staining method with single-staining method, the positive labeling rate of mononuclear cells in all cases was significant different.p0.01. Meanwhile, CD71 and HbF double-staining method was successfully used in sorting NRBC in maternal blood by flow cytometry and the purity is62?2.5%. Frequency of NRBC increased until 21~24 week’s gestation. Conclusion: CD71 and HbF double-staining method could improve NRBC specific lable, sorting purity and make advantage for the next prenatal diagnosisThe optimum time of prenatal diagnosis using fetal NRBC in maternal blood should be at the 21~24 week of gestation. Key words: Flow cytometry ; Fetal nucleated red blood cell; CD71; HbF 由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少,Hahn和Bianchi等【20,21】报道胎儿细胞与母体有核细胞的比例为(1~2):106,Ariga等【22】报道每毫升母血中仅含1~10个胎儿细胞。所以选用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记,并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术,是分离纯化母血中胎儿细胞的有效手段【23】。本部分应用荧光激活细胞分选技术(FACS)对母血中CD71和HbF双标记阳性的单个核细胞进行富集分离并分选,以对FACS法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞进行探讨。 资料与方法 研究对象及纳入标准: 研究对象: 随机选自2003年8月至2004年2月到深圳市人民医院产前检查的健康妊娠妇女92例。 纳入标准:(1)孕10~35周; (2)年龄20~35岁; (3)无贫血(Hb>100g/L)等妊娠合并症或并发症的孕妇。 采取肘静脉抗凝血(肝素抗凝)20ml,室温放置,24h内进行标记处理。 设阴性对照组 15 例,为无孕产史的健康妇女,抽取肘静脉血5ml; 设阳性对照组 15 例, 为妊娠20周至30周的胎儿,抽取胎儿脐静脉血3ml (胎儿脐带血来自到我院做脐带血穿刺行产前诊断的孕妇)。 研究组孕妇和阴性对照组妇女之间均衡性比较无显著性差异(P>0.05)。 2. 主要实验仪器、试剂及其配至制: EPICS Altra 流式细胞仪:美国贝克曼库尔特公司产品,见图1-1。 Altra系统包括Coulter FlowCenterTM工作站,一种结合英特尔奔腾技术的高功能多媒体平台。该系统采用EXPO32TM软件控制仪器,在Windows环境下进行数据的获取和分析。图1-1. EPICS Altra 流式细胞仪Ficoll淋巴细胞分离液(密度为1.077):Sigma 公司产品 单克隆抗体CD71:(为小鼠抗人IgG )Serotec生物公司产品 单克隆抗体HbF:IQ生物公司产品 鼠抗人IgG1-PE和IgG1-FITC:Santa Cruz生物公司产品 3.方法: 单密度梯度离心(density gradient centrifugation): #密度梯度离心原理: 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种,见图1-2。 A、速度沉降 速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 B、等密度沉降 等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间,沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 图1-2 A速度沉降,B等密度沉降本研究选用的是速度沉降法,将血标本用不含Ca2+、Mg2+ 的PBS 按1:1稀释,将每6ml缓慢加于3ml淋巴细 胞分离液上,800g离心20分钟,在血浆和Ficoll之间可见单个核细胞层,小心吸出该层细胞,其主要成分是胎儿有核红细胞、淋巴细胞及血小板等。 2免疫荧光染色: 将第一步得到的单核细胞用含1%BSA(小牛血清)的PBS洗涤两遍,按1×105个细胞/ul的比例加入磷脂酸乙醇胺PE标记的CD71单克隆抗体,室温避光孵育30分钟,PBS洗涤两遍,加入1ml1%多聚甲醛溶液固定30分钟,洗涤一遍。加入B-D打孔剂100ul打孔20分钟,并按1×106个细胞/10ul的量加入异硫氰酸(FITC)标记的HbF单克隆抗体染色30分钟,洗涤一遍,上机分选。同时做对照,分别加入鼠抗人IgG1-PE和IgG1-FITC,操作步骤同前,排除非特异性结合。 FACS分选: #流式细胞仪的工作原理:见图1-3图1-3. 流式细胞仪的工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包被下单行排列,依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90?方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接受方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可 转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同有多种输出形式。单参数数据以直方图的形式表达,其X轴为测量强度,Y轴为细胞数目。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的散点图、等高线图或三维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。包被细胞的液流称为鞘液。在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片,充电后振动,包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴,形成千万个包含单个待测细胞的液滴。在激光束的照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检测,转换为电信号,送入计算机处理,输出统计结果。同时给流束一个电脉冲信号,使液滴全部带上电荷。当带有不同电荷的细胞液流经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时,带电的液滴就根据自身所带的电荷性质产生偏转,落入各自的收集容器中,不带电荷的液滴就进入中间的废液容器中,从而实现了细胞的分选,见图1-4。 本研究在样品测试前,先用标准荧光微球校准仪器,使其在一定的阈值内分选率达最高。根据细胞的前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)等设定分选参数。沿有核红细胞作分选逻辑门,用流式细胞仪依据细胞的大小、颗粒及荧光强度等多参数分选标记阳性细胞,分别记录各标本的阳性标记率及孕妇外周血双标记阳性细胞的分选纯度。回收阳性细胞制成滴片、涂片在荧光显微镜下观察,并经Kleibaur-Giemsa染色后置于普通显微镜下观察胎儿有核红细胞。 4.统计学方法 采用SPSS 10.0软件中的t检验进行统计学分析。 图1-4 流式细胞仪的细胞分选原理 结 果 1 CD71单标记染色 结果见表1-1,经统计学处理,P0.01,各组差异均有显著性。 表1-1. 各组人群CD71阳性标记率组别 例数CD71阳性标记率?s×10-2 妊娠妇女 92 5.59?4.83 未孕妇女 15 0.14?0.05 脐血 15 27.56?21.32 2 HbF单标记染色 结果见表1-2,经统计学处理,P0.01,各组差异均有显著性。 表1-2. 各组人群HbF阳性标记率 组别 例数 HbF阳性标记率?s×10-2妊娠妇女92 4.62?3.42未孕妇女15 0.05?0.03 脐血 15 36.85?28.64 3 CD71和HbF双标记染色 结果见表1-3,经统计学处理,P0.01,各组差异均有显著性。表1-3各组人群CD71和HbF双标记阳性率组别例数双标记阳性率?s×10-2 妊娠妇女 92 1.54?0.29 未孕妇女 15 0.02?0.01脐血 15 10.51?8.63 4 将孕妇外周血分别经CD71或HbF单染色标记和双染色标记所得三组数据进行统计学处理,单染色标记的两组数据P>0.05,差异无显著性;CD71或HbF单染色标记和双染色标记比较,P<0.05,差异有显著性。孕妇外周血的单染色标记和双染色标记图见图1-5至图1-8。 5 CD71和HbF双染色标记在流式细胞仪上的分选纯度为62?2.5%,明显高于文献报道【27】的HbF单染色标记的分选纯度(45%)。 图1-5.HbF单标记染色图 图1-6. CD71单染色标记图图1-7.流式细胞仪上所设的逻辑门 图1-8CD71和HbF双染色标记分选图6分选出的阳性细胞的观察 6.1 CD71和HbF 双染色标记后的孕妇外周血经流式细胞仪分选出的阳性细胞,用1%BSA包被过夜的3ml塑料管收集,离心后制成滴片和涂片。将滴片置于Olympus荧光显微镜下观察,可见绿色荧光阳性细胞,见图1-9。 图1-9. 荧光显微镜下观察所见分选出的荧光阳性细胞×400 6.2 将自然干燥的涂片用80%的乙醇固定5分钟,洗涤后晾干,经Kleibaur-Giemsa染色后置于普通显微镜下观察,可见形态完整的胎儿有核红细胞,见图1-10。 图1-10.经Kleibaur-Giemsa染色镜下所见的胎儿有核红细胞×1000 792例孕妇外周血中CD71和HbF双阳性细胞含量与孕周的关系见表1-4 表1-4. 孕妇外周血中CD71和HbF双阳性细胞含量与孕周的关系 孕周 例数 CD71和HbF双阳性细胞含量 ?s×10-2 10~12 10 1.25?0.5413~16 13 1.68 ?0.7217~20 16 1.74?0.6521~24 19 1.92?0.8425~28 14 1.45?0.5629~32 13 1.22?0.6233~357 1.15?0.46 合计92 1.54?0.29 从表1-4可以看出,孕妇外周血中CD71和HbF双阳性细胞,即胎儿有核红细胞含量在孕早、中期随孕周的增加呈上升趋势,13周以后上升较快,至21~24周左右时含量最高,约为(1.92?0.84)×10-2,以后逐渐呈下降趋势,至31~35周时仅有(1.15?0.46)×10-2。 讨 论 一、 分离孕妇外周血中胎儿有核红细胞的单克隆抗体的选择 目前分离胎儿有核红细胞所用的抗原标记可分为两类:一类是阳性选择标记,即利用抗胎儿NRBC表面或细胞内特异性抗原的单抗,如CD71、抗细胞膜磷脂糖AGPA、γ球蛋白、抗凝血酶敏感蛋白受体(CD36)等;另一类是阴性选择标记, 即利用母体白细胞特异性抗原CD45去除母体细胞后再进行阳性选择。Bianchi 等【24】曾用CD71、CD36和GPA三种单抗经流式细胞仪分选胎儿NRBC进行胎儿性别检测,结果CD71准确率为57%,CD36为88%,CD71或CD36与GPA联合预测的准确率为100%,而单独应用GPA仍为100%,说明GPA单抗特异性最好。而 Troeger 【25】等的研究发现GPA会导致分选出的细胞发生普遍凝集而影响下一步的实验。目前认为,现有的抗体和标记还没有一种对胎儿NRBC有绝对的特异性,致使分离到的有核红细胞大部分仍来自母体,所以分离胎儿细胞时单克隆抗体的选择就显得至关重要。 本研究同时选用CD71和HbF 双标记染色,明显提高了胎儿有核红细胞的分选纯度。CD71即转铁蛋白受体,是一种胎儿红细胞膜抗原,在胎儿NRBC上高度表达,它随孕周而增高,并随着胎儿红细胞的成熟,这种抗原消失,最适宜分离胎儿细胞之用。但CD71在活化的母亲淋巴细胞、成熟红细胞、网织红细胞、血小板表面也有一定程度的表达(约占11.9%)。因而在使用单一的CD71进行标记时,分选所得的胎儿NRBC纯度较低。胎儿血红蛋白HbF(α2γ2)于孕6周出现,在孕12~32周时HbF占胎儿全部血红蛋白的90%~100%,而成人一般低于2%。Bianchi【26】采用Kleihaner-Betke技术对HbF进行染色而分离到胎儿NRBC;Demaria【27】等的研究表明83~100% 均数为98%的HbF阳性细胞为胎儿NRBC,而 82~100% 均数为92.5%的HbF阴性细胞为母体细胞,其细胞分离纯度可达45%。但由于妊娠可以刺激母体合成少量的HbF,所以使用单一的HbF进行标记所得的阳性细胞也会混有一定量的母体细胞,从而降低分选纯度。本研究在选用CD71标记的基础上,再用HbF标记,排除了大量混含的活化母亲淋巴细胞、成熟红细胞和网织红细胞、血小板等,从而大大提高了分选纯度。本研究结果显示,用CD71和HbF 分别单染色标记所获得的阳性细胞率差异无显著性(P>0.05);CD71或HbF单染色标记与双染色标记所获得的阳性细胞率比较, 差异有显著性(P0.01)。说明双染色标记分选效果优于单染色标记,在流式细胞仪上的分选纯度也明显提高,可达到62?2.5%。 二、 流式细胞技术及其用于孕妇外周血中胎儿有核红细胞分选的影响因素 荧光激活细胞分选技术(FACS),又称流式细胞技术,是一种高速定量测定细胞和亚细胞成分及从多种细胞混合物中分离出特定细胞成分的生物物理技术,也是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,是当代最先进的细胞定量分析技术。 随着单克隆抗体的广泛使用,新的荧光物质的不断发现,使流式细胞技术成为分离胎儿细胞的主要工具。1996年,Bianchi【28】等研究认为FACS是最佳的富集分选胎儿细胞的方法。我们在研究中发现,因流式细胞仪操作技术复杂,在应用FACS分离母血中胎儿有核红细胞时多种因素可以影响分选结果,如仪器振动信号的频率和振幅、每次充电滴数、细胞间距、延迟时间、标记抗体的种类、标本的浓度和目标细胞的纯度等都会对分选效果产生较大的影响,所以我们在常规分选过程采取了如下措施:(1)我们在研究中发现,用流式细胞仪进行分选时,振动在液流表面引起的波动会影响液流对光的折射和散射,从而影响到测量和分选的准确性,离喷嘴越近的液流表面受到的扰动越小,所以我们在选择合适的频率和振幅的同时,尽量将测量区靠近喷嘴。(2)选用细胞内外的双重抗原来标记待选细胞,从而大大提高了胎儿有核红细胞的分选纯度。(3)多参数光散射分析。本研究注重分 析测定每个细胞的光散射性质,如细胞的前向角散射和侧向角散射,进而了解细胞的体积、核质比、胞浆密度和颗粒性等,以便在细胞分布范围上将待分选的胎儿有核红细胞与母体血细胞更好地区分开来。总之,我们认为,采取以上措施对于从孕妇血中识别、分离胎儿有核红细胞是至关重要的,因为胎、母细胞在流式细胞分析图上通常有较大的重叠。 三、 孕妇外周血中胎儿有核红细胞比例与孕周的关系 孕妇外周血中胎儿NRBC数与孕周的关系不同学者报道不一,Ganishirt、【29】Lo等【30】的证据表明母血中胎儿细胞的数量随孕周的增大而增加,并且存在于整个孕期;Sohda等【31】的观点认为孕早期胎儿细胞数量最多。我国学者陈汉平等【32】认为胎儿NRBC在孕17~18周达峰值。所以分离孕妇外周血中的胎儿NRBC进行无创伤性产前诊断的最佳时间一直存在争议。我们的研究表明:早、中、晚期孕妇外周血中均存在胎儿有核红细胞,且孕早中期胎儿NRBC比例随孕周的增加呈上升趋势,以13周以后上升最快,约至21~24周达峰值,约为(1.92?0.84)×10-2,以后整体上呈下降趋势,此结果与大部分国内外学者的结论相符。所以我们认为应用孕妇外周血中的胎儿有核红细胞进行无创伤性产前诊断的时间应尽量选择在妊娠13~24周,而以21~24周左右为最佳。但因母血中的胎儿细胞数量通常存在较大的个体差异【45】,且我们的样本数量有限,所以该结论尚待循证医学证实。 注:本部分研究拟用Y染色体特异性探针对15例孕有男性胎儿(经B超及胎儿脐静脉穿刺染色体培养证实)的孕妇外周血标本经流式细胞仪分选出的CD71、HbF双标记阳性细胞做荧光原位杂交,但因分选出的细胞量较少(2000~40000个),在经过反复的离心、低渗、固定等杂交前的处理后,大量细胞 丢失或破坏,11例标本在杂交前制片后相差显微镜下观察已找不到完整细胞,4例标本虽可找到数个细胞但终因未能达到FISH所需量,导致杂交失败,故荧光显微镜下均未见到Y探针信号,FISH未能成功。 第二部分 阴性和阳性选择MACS法分选孕妇外周血中 胎儿有核红细胞做FISH行无创性产前诊断的研究摘 要 目的: 尽管胎儿有核红细胞在母血中含量甚微,但它的存在为无创伤性产前诊断提供了潜在资源。本研究意在建立一种从母血中分选出胎儿有核红细胞从而进行无创性产前诊断的方法。 方法: 抽取21例妊娠18周至32周的拟行产前诊断的孕妇外周血20ml,分别进行单密度梯度离心、用CD14、CD45、CD71标记的阴性和阳性免疫磁珠分选、Kleihaur-BetkeK-B染色和X、Y、21或18号探针的荧光原位杂交。 结果: 所有标本均分选出胎儿有核红细胞,并经K-B染色和双色或三色FISH鉴定。对胎儿性别的判定,本方法诊断男胎的灵敏度为92.3%,特异度为100%;诊断女胎的灵敏度为100%,特异度为92.3%。同时诊断出3例非整倍体胎儿。所有结果均经脐带血培养染色体核型分析证实。 结论: 同时应用阴性和阳性选择磁激活细胞法分选孕妇外周血中的胎儿有核红细胞,并通过FISH进一步检测胎儿特定染色体诊断非整倍染色体胎儿的方法是一种有创新的、快速、准确的无创性产前诊断方法。 关键词: 产前诊断; 胎儿有核红细胞; MACS; FISH Noninvasive prenatal diagnosis from maternalblood: FISH of fetal nucleated erythrocytes isolated by negative and positive magnetic-activated cell sorting Abstract Objective: Fetal nucleated red blood cells are rare in maternal circulation,but there presence constitues a potential source of non-invasive prenatal diagnosis.This study was undertaken to establish a non-invasive prenatal diagnosis method using isolated fetal NRBCMethods: The study population included 21 patients from 18 to 32 weeks of gestation. A multi-step methed including single density gradient,negative and positive magnetic activated cell sortingMACS usingCD14,CD45 and CD71, Kleihaur-Betke staining,and fluorescence in situ hybridization FISHusing probe X,Y,21 or 18 was performedResults: Fetal NRBCs were separated from all cases and confirmed by K-B stain and FISHThe fetal sex determination showed 92.3% sensitivity and 100% specificity for males; 100% sensitivity and 92.3% specificity for females, and three cases of aneuploid chromosome fetals were diagnosedAll these results were confirmed by the cordocentesis. Conclusions: We showed the method that enriching and isolating fetal NRBC.from maternal blood by negative and positive magnetic activated cell sorting and detecting aneuploid chromosomes by FISH with a specificity is rapid, accurate,innovative and useful non-invasive prenatal diagnostic methodKey words:Prenatal diagnosis; Fetal nucleated red blood; MACS; FISH 由于荧光激活的细胞分选法从孕妇外周血分选出的胎儿有核红细胞量过少,将其进一步行荧光原位杂交进行无创性产前诊断未能成功,故我们改用磁激活细胞分选法(MACS)分选。本部分着重探讨应用CD14、CD45标记的阴性选择和CD71标记的阳性选择磁激活细胞分选法富集分离孕妇外周血中的胎儿有核红细胞,并联合双色和三色荧光原位杂交对胎儿进行无创性产前性别诊断及非整倍染色体病的诊断。 资料与方法 研究对象及纳入标准:研究对象:随机选择2004年3月至2004年8月因高龄(孕妇年龄大于等于35岁)或唐氏筛查风险高于1/270,或彩超筛查显示胎儿异常的,或既往有畸形胎儿分娩史的,来我院行产前诊断的孕妇21例。纳入标准: (1)孕龄为18~32周, (2)无贫血(血红蛋白?100g/L)等妊娠合并症或并发症 抽取孕妇肘静脉血20ml,肝素抗凝,室温放置12小时内分离;同时行脐带血穿刺抽取胎儿脐静脉血0.5ml,送培养做染色体核型分析以做对照。 2. 主要实验仪器及试剂: MSP磁珠分离仪:Clemente公司产品,见图2-1。 图2-1MSP磁珠分离仪 热平台:英国Cytocell公司产品 NikonE600型荧光显微镜及荧光图像处理系统:美国PSI公司产品 Ficoll(密度为1.077):美国Sigma公司产品 单克隆抗体CD45:eBioscience公司产品 单克隆抗体CD14:eBioscience公司产品 二抗磁珠:为直径250nm的羊抗鼠磁珠,Clemente公司产品 包被CD71的磁珠:直径250nm,Clemente公司产品 0.075mol/L氯化钾低渗溶液的配制:蒸馏水500ml+氯化钾粉2.795g 固定液的配制:甲醇?冰乙酸3?1混合 X、Y染色体特异性着丝粒探针:英国Cytocell公司产品 18染色体特异性着丝粒探针:英国Cytocell公司产品 21号染色体特异性单一序列探针:英国Cytocell公司产品 3. 方法: 3.1 胎儿有核红细胞的富集分选过程: 3.1.1单密度梯度离心: (原理见第一部分) 将血标本用不含Ca2+、Mg2+的0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)按1:1的比例稀释,将6ml 稀释后的标本缓置于3ml密度为1.077的Ficoll上,离心800g,30分钟。在血浆和Ficoll之间可见单个核细胞层,小心吸出该层细胞,用3倍体积的含1%BSA(小牛血清)的PBS洗涤2遍,离心200g,5分钟,去上清。 同时应用阴性和阳性选择磁激活细胞法分选胎儿有核红细胞: #磁激活细胞分选法分选原理: MACS法分选的原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合,或者已包被二抗羊抗小鼠或羊抗大鼠的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁性标记完后,把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱/试管。分选柱/试管里的基质造成一个高梯度磁场。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上,被磁性标记的细胞滞留在柱里/试管里,而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后,滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来,这样就可以实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。磁激活细胞分选法分选原理及简单步骤见图2-2。图2-2. 磁激活细胞分选法分选原理及简单步骤模式图 #本研究MACS分选的具体操作步骤:按每20ul/107个细胞的比例加入单克隆抗体CD45和80ul/107个细胞的比例加入单克隆抗体CD14,室温孵育20分钟; 按80ul/107个细胞的比例加入二抗磁珠,4oC冰箱孵育20分钟,放入MSP磁细胞分离仪中分离10分钟; 丢弃掉与磁场侧试管壁黏附的细胞,剩余细胞为待选的阴性选择的细胞。用PBS洗涤2遍,再次放入MSP磁细胞分离仪中分离10分钟; 按20ul/106个细胞的比例加入已包被CD71的磁珠,冰箱4oC孵育20分钟; 再次放入MSP中分离10分钟,与磁场侧试管壁黏附的细胞为待选的阳性选择的细胞,用PBS洗涤2遍,200g离心5分钟去上清,加入少量PBS制成细胞悬液,重复步骤(5)两遍,将分选出的细胞加入适量PBS制成细胞悬液。 3.2 用细胞计数板计数分选出的阳性细胞数 3.3 Kleihaur-BetkeK-B染色:取少量分选出的细胞,涂片,用80%酒精固定5分钟,流水冲洗后晾干,浸于酸性缓冲液中11分钟,冲洗晾干,分别用伊红和苏木精染色5分钟,冲洗晾干后置于光学显微镜下观察。 3.4 荧光原位杂交FISH: 3.4.1 NRBCs杂交前处理: 用0.075mol/L氯化钾溶液低渗处理30分钟,甲醇冰乙酸混合液连续重复固定3次,制成细胞悬液,于-20?储存。FISH检测 : 探针:18、X、Y染色体特异性着丝粒探针,区域定位于p11 1~q11 1。探针分别以香豆素Coumarin、异硫氰酸荧光素fluorescein isothiocyanate , FITC、四乙基罗达明Tetraethylrodamine B200,RB200直接标记;21号染色体特异性单一序列探针,区域定位于21q22 2,以RB200直接标记。Coumarin的最大吸收波长为354nm,最大发射波长为430nm,在荧光显微镜下呈现蓝色荧光;FITC的最大吸 收波长为495nm,最大发射波长为520nm,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光;RB200的最大吸收波长为495nm,最大发射波长为520nm,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。 预处理:常规制片,在相差显微镜下检查并划定杂交区域,将标本放入2×SSC溶液中洗涤2分钟后,用浓度分别为70%、85%、100%的乙醇系列脱水各2分钟,空气干燥。 杂交:分别将X、Y染色体探针11号和20号标本另加入18号染色体探针,17号标本另加入21号染色体探针溶液10μl加到载玻片上的杂交区域,用盖玻片覆盖后橡皮胶密封,置75?热平