【doc】植物小分子物质的免疫测定技术

【doc】植物小分子物质的免疫测定技术 植物小分子物质的免疫测定技术 商lOoo倍,所以它也是IAA的重要运输彤式之 —.玉米幼苗在经过2o秒钟的强闪光后其游离卷 IAA水平减少4G%,同时结台态增加.在植物中 存在参个酶系统,能可逆地催化IAA酯化和酰胺 化,催化结台态IAA合成和水解的酶系统能对环境 因素怍出快速反应,儿而调节体内IAA水平"一 光和重力都能引起结台态IAA的不对称分布.在 植物对光和重力伴出向性反应的过程中这种不对 祢分布有重要意义.有的结合奋生长素能促进生长 和生根,在生产上和科研申已有广泛的应用. 参考文献 1Bn如iRg.WaxeingPF(ed)PlantGrowth 8?bt.LOndon.Academ王e姆.19船.P.3. 0Gohe?RJ.HBjo目n性妇&.Metab0】mofplaI%0 H0Tm0?甜.1984,P.165; 3Oohe~J:D."P办{I982,93:403- 4Eutm~h13.L~thamD8.Pd&Lett1979,14: 205. 5BmE.P02hysffT~19808S:415. 0日yG8.AgeF004Ohen~1976,鸽:?20. ~abfekKT.P珊Growthm们l986,4:l? L幽m日.Pla~t脚iol4,117:卸 LethamD吕.脚3RevPla~tPhysio1963.3?:163 T.~hamD88t.Wa~e[ngPF(ed~lantGro- 伸8ub~t,L~ndon,AcadcmPre~s.1.82,147- LJebls:h.B~ochvmP20id1980,l丁5:Hs- l~[urakosk;Cke~nPm口"!7okyaIg7 25?船0. MalletPet0.&hmrK口(ed)Bioche- mls~ry&0hemlsfryofPlatG~owthRegu]a~ora 1974,p一115- Palmer?VetaJExpAo2981.船:18.q1一 Rood吕B.PZ珊101963,73:340. vaStadeuJ-DaveyJBZt~flanzenphysioZ198l? 1Ol53. Va?StadenJ,t~hysiolPld1976,3B:3a5. wa1k!MA.ZP批L啪8o{1981,l01:461? 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WeilerEW.P珊;01980,148:262. ?1tNe0P协c讯i8tTt1625. 杜抽t癌譬玉讯胁珊如蜘m.989(6):68,72 植物小分子物质的免疫测定技术 吴须如万寅生周燮(南京农业大学南京2l0014) 提要本文介绍了植物小分子物质免疫测定的基本原理,各种免疫原合成技术,免疫程穿,小分 子标记物的寅成以及免疫测定的方法.讨论了免疫测定技术应用于植物组分检测的可行性,并列举 了目前已用于免疫测定的植物小分子组分. 目前国际植物生理学界正加速开发免疫技术应 用于植物小分子组分的测定】.植物小分子物质 是指一娄分子量在1000道尔顿以下,本身不具免疫 原性的物质.当前发展和应用免疫方法对植物小分 子物质的测定主要有以下三类:(1)植物生长调节 剂;(2)植物发生代谢物;3)与植物有关的有毒费 留物. 用常规的理化方法如TLC,HPLC和aC等对 植物组分进行分析,需要繁琐而冗长的预处理程序, ?68? 使样品发生较大的损失.与此相比,免疫卿定则只需 对样品濠进行适当的分离提纯,还能对大量样品的 几种小分子物质进厅批量分析而且所要求的仪器 设备也较为简单.免疫测定畦每个小分子的测定都 需各自特定的抗体和标记物,要获得一理想的抗体 至少经数月的工作.因此必须有选择地对植物组分 进行测定 啦稿圳8年5胃l2日 0加n地u""n?舡船嚣 免疫测定法的类型 免疫测定法是利用抗原(A岛即小分子物质1和 抗体(Ab)的结台特性在一定的体系内,以适当的 标记抗原(Ag)和非记标抗原(Ag)对一定数目的抗 体结台位点的专一性竞争作用关系,再通过已知的 品作参考,定量测定植物样液中的小分子物质 选择使用高亲和的抗体与高比活度的标记抗原可得 至灵敏度高,选择性好的效果.Ag和Ag'对Ab的 竞争抑制反应遁常由以下几种方法实现: 1.放射免疫测定法(RIA)在这反应体系中, 抗体的浓度和放射性标记(一般用3且,埘I)的Ag. 量恒定,待测样的Ag与Ag竞争有限的Ab结台 位点,反应结果溶液中存在游离的AA和A AA-Ab结台物,此时只要选择适当的分离剂 (如硫酸铵,葡聚糖包被的活性炭或第=抗体)将游 离直gJA和其结合物分开,测定A的放射性强 度便可根据标准曲线计算样品溶液Ag的浓度(见 下式). Ag+Ab+Ag Ab—Ag+Ab-Ag+Ag+Ag' { 测定I测定II 2.荧光免疫法(FIA)和化学发光免疫法 (CLIA)其原理和mA相似,不同点在于它使慝荧 光物质(如异硫氰酸盐荧光黄,发绿色荧光)或化学 发光物质(如鲁米诺)来标记g或Ab,当进行适当 的ib-ig",Abg反应和分离后,通过协同反应 物的作用,利用发光光度计或光子计敦器测定光量 的大小?一: 3.酶联吸粥免疫诘(墨LI矗A)以酶和Ag(或 Ab)连接形成酶标物代替同位索或发光剂标记.固 相抗体法是将抗体吸附于聚苯乙烯微量滴定板,然 后用Ag租酶标A的竞争抑制反应形成AAg. 酶的复合物再由复台物上的酶催化无色底物反应 形成有色物并根据色泽的深汝击标准品计算样敞 小分子物质的含量. 墨.均质酶免疫测定法(HEI)H丘江是在整个 反应系统中,不用理化方法分离游离的酶标物和已 与相应抗原或抗体结台的酶标物,而遥过抗原和抗 体结台后酶特性的改变进行测定.酶放大免疫测定 技术(E~LIT)是一种经典的HEI 各类型的免疫测定技术都有利弊,可供RIA使 用的现成的同位素标记物极少,需要较昂贵的仪器 潞定.?(液体闪烁lf叟)或I(放射计数仪),且存 在放射物悸染的危軎,它有逐步被非放射免疫测定 责l小分子与蛋白质复奇糟告成的常用方法 怯所代替的趋势.FIA,CLI.A和ELIS.A避免了放 射性物质,但植物样品和抗血滑中的荧光背景(即自 然荧光)值较高,所以一般难以使用FIA.化学发光 需要专门的光接受器;ELISA现已得到广泛应用, 但它有酶本身易变,易受抑制及线性范围窄等映 点. 免疫原的合成法 分子量小于i000道尔顿的物质都需要连接到 一 个本身具有免疫原性的载体翰质(蛋白质)上才能 诱导抗体的生产.常用的载体蛋白有牛血清白蛋白 (BSi),^衄清白蛋白(HSA),钥孔娥血蓝蛋白 (KL?)或甲状腺球蛋白等.这些蛋白质的特点是 有适当的连接位点(如羧基,氨基等)及在水,有机溶 剂中有良好的溶解度,根据分子的结构特性,常用 的连接方法有下列几种(见1). 1.通过羧基的连接(1)混台酸酐法,0.3 ?瑚0l小分子物质溶子2.5mlN':甲基甲酰胺 ?69t (DMF)中,加陋三正丁胺和如.卓I甲酸异丁酯 放置30分钟,然后逐琦加^旋转振荡的B8A演 (420mgB8A溶予22m15c%DMF),加O.62ml 1mcl/LNa0I-i碱陀.搅拌过夜透枕冷冻千噪.笔 者台成酸性植物激素的连接比率(激索与BSA的摩 尔盏比)IAA5.2:1;IAA-asp)6:1.GAI,45:1. C3.5:l;GAl25:1;GAf,8:l;ABA,4.4:l. (j水溶性碳二亚胺(EDC)法100nlmol小分子 物质和I40nlmolEDC溶于200~150%DMF(p[{ 5.0置于室温搅拌15分钟,加500~10.5%BsA 50%DMF液,调pH至6.5J充反应4小列, 透析井冷凉干燥. 2通过羧基的连接琥珀酸酐法04-0r~.g小 分子物质和200rag琥珀酸酐溶于1ml吡畸充 力r盖后放置室温2,4天,真空抽去吡晓产品溶于 适当妁溶剂(如乙酸乙酯,视小分子而定),用水洗击 残留的酸配收集有机相,以lN}吹干,该产品已人为 地导人羧基,再通过--C00H和B吕A连接. 3通过氨基的连接(1)~annich反应,3O mg小分子物质溶于1.5ml永,再称100ragB$~ 溶于2ml王王她加1.2nd7.5,五(w)甲醛和0.67" ml3mol/L22酸钠.将两溶液混合,于室温搅拌过 夜,透析,冷冻干燥.(2)丙烯酸法.2g小分子物 质和580Hg丙烯酸分别溶于4-和】1nl乙醇混 合于7ff~C保温6小时I再加上述浓度的两烯酸乙醇 技0.65ml,70~C下2水时,将温度降至2O.a反应 蝴小时,G放置2o小时.收集小分子的丙酲衍生 物再通过羧基与蛋白质的氨基连接. 岳通过酚基的连接重氮化怯小分子物 质】5mg溶于0.9瑚I甲醇,转入3Oml0.1m0I/L硼 酸缓冲液(pH9.O).制成试剂A.以l5ml水溶 解mg对氧基马尿酸取代的B8以lmol/L Hc1两至pH1.冰潜上缓慢加^1.5皿ll2% 亚硝酸钠溶液,4分钟后加1.5mI6%磺胺,铷成 试剂B.试剂A,B混合,搅拌2小时,透析并冷冻 干燥.…一一… 5?通过醇基的连接氨基氧l乙酸法在? mI无水乙醇中溶解500~g小分子物磺和300mg 氨基氧乙霹加A20mI毗啶回流8小时,真空蒸发 e35.G)除去毗啶溶于少量热水,并滤岳教甲肟结晶 物,再通过羧基和蛋白质连接. 为了获得理想的免疫效果,需控制小努子物质一 蛋自质问的结合比率一般认为其比率在3~45:1 时兜疫反应强烈.结合比率可通过.H等内标物粟 计算也可通过紫外,红外和桉磁共振等方法来验 一70? 证.此外.由小分子的不同结合位点连接形成的拉 原所得Ab的特瞧不同,如ApA曲c:和BSA连 接所得Ab只和游离ABA反应,而通过c1礼3sA 连接所得Ab则和游离结合ABA两形态部反 应[捌通常连接时愈远离BSA的基团,其特征度 应意明显.即Ab识别直罾暴露基团曲能力较大, 周此有对可人为地在小分子和BsA间加上一长链 的"桥"的结构,以加强小分子和Ab结合的特异性. 抗体的产生 抗体生产需用试验动物如兔,鼠和山苹等,一 般选用适龄,健壮,无感染性疾患的雄性动物作竟疫 对象.采用的免疫进程,剂量,注射方法因实验室而 验室制取抗植物激素的多克隆抗体的程 异,我们实 序如下:取1mlGA'一BS~(舍l?g>抗原凌经等津 耪福氏完全佐剂(羊毛脂:石蜡油一4:6加100~l卡 介苗液)乳化后子鬼肯部皮内多点基础免疫,以后每 隔一个月不完全佐剂加强免疫两次,第三次加强 免疫瑁抗原的水帮注射,并配合足垫免疫.垂,6天 后由兔耳静脉采血检查效价并采血抗血清韵效价 为1:l~6(f. 单克隆抗体<mAb)的生产,需一定量正;alb/c 系的鼠骨髓瘤细胞和经免疫得阳住的脾细胞杂交, 彤成杂交瘤细胞.这祥可利用骨髓瘤细胞带八的可 在培养基上增殖,脾细胞分泌抗体姆特性通过细胞 培养不断地制取抗体.取约l脾细胞和1,2× lO的骨髓寤细胞,经5.%PEG处理1分钟使其细 胞融合,然后稀释棘去PEq置于多孔的培养扳J以 HAT培养基(含次黄嘌呤H氨基喋呤A胸腺嘧 啶核苷筛选,稀释至单细胞培养并克隆,融台两, 三周即可在显微镜下观察,井测定培养液抗体的浓 度. 取得的抗体可加0.1%a后冰冻干燥于 -- 40.C下保存数年或与等体积的甘油蝇合低温保 存,幢避免抗体的反复冻融.…一 标记物的合成 根据各小分子物质的特性,成标记物的方法 不同难段结出统—程序.RIA中常用?,I标 记,例如含双键的小分子可通过}加戚饱和制取 标记物.此外,小分子以羧基铷取免疫原者,可用 aH一破代甲烷进行甲醇化制取标.}己均,其方法如下: 取125wl小分子物质(O.28~mo1)的DS'~F激,il口 I~moi/LNa0H室温下混台3O分钟,再加.H—c砘I 比度为3t4x扎Hq/m.I)于室温搅拌过射性 夜除去溶剂并提纯产品 (放l标记比咀标记的比活凄大,医而谢定更灵 '敏上i蛞工晰数更方便,它的不足在于半袁期较 蛭.按下列方法厨标记小分子:在装有蜘-_碘 2,4啪i)的密封瓶中,依下列次序用针注入0.5 m.l』,~S(pR775J0.025m1),0.025ml小分子物质 (5烬)的P砖液,氯胺-T(0.05mlPBS中含g), 偏二业硫酸钠(01lniPBS中含240腭),然后对碘 标记物分离提照143. 酶标记物的台成类似于免疫愿的台成.但童注 意合成时保持酶的活性,从价格,稳定佳罹对底物 显色反应的特性看,一般适宜于用碱性磷酸酯酶 (AP),辣报过氧化物酶(KRP)和一半乳糖苷酶i 等. 免疫测定程序 取得抗体,标记物后便可免疫测定程序.优 化的程序需确定各试剂曲最佳旅度和反应时间一 般可甩滴度试验(R]4)和双向稀释反应(ELIS~) 来完成.根据笔者的经验J小分子的姒和ELlsA 可路出统一的优化程序: 1.RIA50p,1植物样液中加入100~1Ab稀 释随和5Dl0.6%BSA,混句于4~0反应1小时, 加入50.?—_标记物于4oo反应1小时,加25O 8As_蹯匀特管内蛋白质析出时离心除去结合慨嗳 出00l上清濠于闪烁瓶加5ml闪烁液后即可进 行游离0H_标记物的计数测定,. 2.ELISA(1)以0,2mlRMI(兔抗鼠 )包被聚苯乙烯擞量浦定板.4过夜,甸 IgG球蛋白 去溶液并用水洗一次.(2)加o.2ml稀释的raAb (单克隆抗体),G,小时后倒击请液加承冼两 次.(3)加0.05ml0.05mol/LTBS(pH7.8)和0.1 ml样液或标诲液反应小时(4)加9?05丑lAP一 酶标液,于4oc竞争反应3,J,舒,倒去滑液用水洗两 次.(5)加0.2ml0+1%对硝基苯磷酸南,于:7.C 保温1小对.(6)加O.o5ml5mot/LKOH终止反 应,并于波长410DID下测定光密度. 除标记,J,分子物质和Ab的浓度及反应时间外, 优化程序还必须考虑:(1)确定测定范臣裢查鲥定 的童复性;(2)确定专一性,分析交叉反应,(s)检壹 法的长期稳定性,有机溶剂对抗体的影响等. J . 植物样品测定的可行性爱现状 1.可行性凫疫潮崆应用于植物样品,应考虑 其可行性,即要求样品的稀释曲线和标准曲线的斜 率保持一致,稀释浓度间有良好的比仞关系?一般 只要将样品中干扰物质除去即可龃『这一要求,植 物阵品的干扰源有三娄:(1)r绿体色素的猝灭效应 (丑IA)或直接影响显色(E1A).它可通过薄板 层析,乙酸乙酯一酸碱水稆革职或过胶柱除 去.(2)其它交叉反应物质.(8)使搞体和酶失潘 或钝化购物质(如草取时曲有机溶剂等). 为了撩上述三类干扰源必须对植物提取液 进行初步聍分离纯化.一般的有机小分子经适当 的溶剂(如80%甲醇)研磨提取,溶剂萃取和过0" 胶拄,其回收率均可达g以上. 2. .霉状(1)植毋释毒.再冉19年开 始应用免疫法泓定IAA和iPA以来过去的10年 中该领域发展相当迅速.由于植物激素的含量通常 低幸水平,尤其是.在I鹾嗡营养俸内含 量极微.RlA和ELISA可测定fmol水平的植物 激索,是较为理想的手段.现已有IAA.GACTK (细胞分裂素)和ABA的mA和ELISA.1"~85年 ,ZR 起美国IDETEK公司开始出售抗IAA,B土和DI~IZR的mA我们实验室也研究并出售 2tBA.0A1】3,的RIA掼淀药盘.利用免疫法可 测是热细胞的原生质中的植物潋素的含量?]. (2)植物璁生代谢特主要对具有药理意义的 扶生代谢‰如甾萜类的毛地黄糖苷人参皂苷生 物碱娄的蛇抿碱,长春花碱,麦角酸,最仙子胺,烟 碱,吗啡等}娄黄酮类的柑桔苷宰进行mA或(和) ELIS~其翊f定范围在披个pg至g之间,并已广 泛应用于植物敬生代谢物高产细胞株的筛选或普 查锄,鲫.. (3)与植特有关的有毒特盾已发展了抗农药 残留物,真菌毒素如黄曲霉素和玉米赤霉烯酮等的 抗体,进行食品和环境蛆分的普查". 利用竟疫法测定小分子的最低量可达10mo[, 相当于或超过当今最先进的物理j=艺学测定法.免疫 方法由于它具有高度专一性,灵敏涟与操作简便等 托点,必将璺到植物生理学界的日益重视而成为一 种常规设0定技术 参考文 1Robln甜.LinkersHF.J…SOnJF(eds) 2mmunologyinPlantScience.S~ringer—Ver]u 1986P.86- 2崔徽等.植特生理学通讯l哪(2): ? l_】? 8周燮,徐义俊,南京农亚太学1987[.):9 4WeikEW.Wf鲫zo1eRV.础姐把1081.152:l5g. 5是烦如等,南京农业大学1988,i1(e):127 6Wei]e:cBW.Li~skensHF.J~ksonl丁Kced) aDiece.Sprlag~r—Ver]az ImmunologyinlP】 王.吕8,口.1. 7Eobi~?.mI984,船:Ill9. 8Tea/0Jgq-i~G%Pm1977,4:169. 9WEW面.P舡}l081,t0'艘岫. 10JourdanP8.Plan~a19镏.44:8牙 11JourdanPBBi.J廊Ghom1983,BI:1249 I2~'eilerEw.如lg8o.I48:2昭. 13Kuro~ochl8ef.1.phytochem19B7,?:2895t l4Gr~enwoodFCetBio~hem]963.嚼:114 15曼颂如等,植轴生理学通讯I蚰8(6):51. 16吴顷如荨,址轴生理莘通讯王.聃(5):4 17w"eiI~肼勘2PlanlP耐1984,l鬟;:85 18WeikEW}P缸l口船,1524. 19Wo1]erEW(江苏省植物生理学会犏)一植物生长调节 卉{的免疫捌定,南京捉业太肇,41页. ?WeilerEW.厕?e}?,goc'ie狮l983 (IJ):4. 壮拓t曙萼tl氟p月~ommunlcatlonsl.89(5):,76 植物细胞培养的生物反应器 韩迎山(中国科学院武汉植物研究所,武昌4昌o0z4) 提要本克介绍了植物细胞培养的特点及其生物匣应器畸设计隳理,概述了植物细 胞息浮培养 和固定化细胞系统中各类生物反应器的俸氧,混台和流体力学特性与植物细胞生 长和次生代谢物生 产的关系. 生物反应器在微生物发酵中亦称为发酵曜J是 指能提供可控制环境以满足细胞正常生长和生物合 成的窖器,其中的物料至少为两相组残的非均一系 统,如气相和液榀另装有通气和搅拌装置使物料 均匀混合及各组分和热量在不同相际问传递.在埴 物纲胞大量培养生产挟生代谢物冲,生物反应器的 设计爱其放大对生产过程的经济效益起决定性作 用n. 早在1959年,Talecko和一Niekell在20L玻璃 瓶中建立了第一十植物细胞大量培养系统并放大 到3L和134L不锈钢发酵罐1962年Byrne 等也用机械搅拌罐成功地进行了植物细胞培养.随 扁W?g,Lamport,Gmebe,V?m及Ve~iky 等人分剐设计了多种不同形式的生物反应器,但大 多数反应器均难放大到工业生产勰模[419Kato 等?研究了机械搅拌罐中搅拌器转速对烟草细胞生 长的影响,提出50~190r/ram的搅拌速率最为合 适.1977年,Wagner和V0lgBLmann吲报道了海巴 戟细胞在乎叶轮搅拌罐,卡普兰叶轮导流商反应器, 气丹式反应器等中的生长和产物台成,结果发现气 升式反应器审蒽醌产量比摇瓶申乡30%是其它反 疵器的两倍,但细胞产量不受反应器类型的影响.近 -T2. 年来已有多种生物反应器用于植物细胞培养. Tara等垛用侍氧效率高的转鼓反应器成动地进 行了长春花细胞培养.Ulbrlch等采用螺旋反应嘉 培养洋紫苏细胞获得了较高产葺的迷迭酸. Hegg~in等【.J报道了一种具低切变力,可用于植物细 胞团培养的类似蔬l化床的反应器.衄外诮有多种 固定化鲴弛反应器用_于植物细胞培养】.本文对植 物细胞悬浮培养和固定化细胞系统中生物反应器的 设计原理,类型,操作形式及其放大作一概述. l{ 植物细胞生物反应器的设计原理 写微生物相比植物细胞体积较大,且常襄集成 团,应注意不同相际间物质传递(ma驰franker)的 限铷.其中尤以氧气的传递至为重要,在大多数情 况下,细胞培养物的氧消耗速率(r)匣等于是应器内 气液界面同的氧传递速率(?). 已知r=00I-x = kLa(G'-o) 即,-x=kLa('-a) t r?- 收稿1985年4月l6日