猪体细胞敲除α13半乳糖基转移酶基因的研究

猪体细胞敲除α13半乳糖基转移酶基因的研究 中国农业大学 硕士学位论文猪体细胞敲除α13-半乳糖基转移酶基因的研究 姓名:李雪辉 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:林爱星陈永福 20030601 摘 要 克服超急性排斥反应(,,,)是猪一人异种器官移植研究首要解决的问。,,,是由于猪血管内皮细胞表达的糖蛋白末端的,一半乳糖(,—,,,)可与人体内天然抗体结合，并激活补体联级反应而引起的。而,,,,,在细胞内是通过, ,，,一半乳糖基转移酶(, ,，,,,)来合成，因此敲除该基因将能有效地克服,,,。本研究构建了适宜的基因打靶载体，通过体细胞基因打靶来获得敲除, ,，,,,基因的细胞系(并在此基础上展开相应的细胞方面的研究工作(为异种器官移植的深入研究打下良好基础。 首先，对, ,，,,,基因进行测序并与已知的,,,,及部分基因组序列进行比较，进一步酶切图谱，选择两段适宜的序列作为打靶载体的,?和,?同源臂。其中,?同源臂,,,,,,，包括完按的第五外显子、第六外显子、部分第七外显子和第六内含子: ,?同源臂,,,,,,，，包机部分第八内含子和部分第九外显子。以,,,为质粒载体，以,？,,为正选择标记基因，以,,,为负选择标记基因，构建新型的正负双向选择的无启动子打靶载体,，,,,，全长约,,(,,,。 从,个,,日龄猪胎儿中分离出成纤维细胞，经过体外传代培养建立了,个细胞系，并用,,,—,,,进行性别鉴定。 从出生,日的雌性幼猪体内取得主动脉内皮、肝脏、肾脏以及肺，分别进行原代细胞培养以及继代培养。获得基本纯化的主动脉内皮细胞、肝细胞、肾细胞以及肺细胞，并从细胞形态上进行初步鉴定。 采用优化的高压电击法将,，,,,转染胎儿成纤维细胞(,,,个)，经,天的,,,,(,,, , ,,,,)药物筛选，共获得,,,个细胞克隆(其中有,,,个克隆是发生非同源重组的荧光细胞克隆。目前已分离培养,,,个阳性克隆，对其中,,个克隆(包括,个绿色细胞克隆)进行了,,，,鉴定，结果表明，均为整台阳性。 转染,,,,,,,,,,基因的胎儿成纤维细胞，经嘌岭霉索药物筛选后的得到稳定的转,,,,,基因的阳性细胞。传代培养至第,,代与对照细胞相比，在细胞的生长状况及繁殖能力方面均无明显差异，初步说明人端粒酶基因的表达不影响猪成纤维细胞的正常生长。 关键词:猪体细胞，, ,，,,半乳糖基转移酶基因，打靶载体，基因敲除，人端粒酶基因 ,,,,,,;, ,,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,;;,,,,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,,, ,, ,,,,,,;,,, ,,,,;,,,,(,,,)，,,,;, ,,,, ,, , ,，,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,;,,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,(，, ,,,,,,，, ,,,,, ？,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, ,,,,,,, ,,, , ,，,,,, ,,,,,,,(, ,(,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,, , ,,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,(, ,，,,,),, ;,,,,(,,,,，;,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,;,,, ,, ,,,;, ,,, , ,，,,, ,,,,(, ,,,, ,,,,,,,,, ,,;,,, ,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,,,, , ,(,,, ,,,, ,, ,,,,,;, ,,, ,,,,,,; 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,,, ,, , , ;,,, ;,,,,, ,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,, ;,,, ;,,,, ,,, ,;;,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,;,,,,，,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,, ,,, ,,;,,, ,,,,—,,,,, ,,,, ,, ,,,, ,, ,,,;,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,(,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,, ,,,,;, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ;,,,,，,,, ,,, ;,,,,, ,,,,,,,,,,,,; ;,,,,;,,,,,,,;, ,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,,;,,,,,,,,, ,,,,:,,,;,,, ,,,,,,; ;,,,，, ,，,一,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,,,, ,,;,,,。,,,, ,,,;,,,,,,,,, ,,,, 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名: 时间: 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 时间: 年 月 日 导师签名 时间: 年 月 日 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 ,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, 牛向清白赁向 ,,,, ,,一,,, ;,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,结合蛋白 ,, ,,,,,,,,,, 分化群 ,，, ;,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, 牛小肠碱性磷酸酶 ,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,, 巨细胞病毒 ;,,,,,,,,, ,,;,,,,, , 补体受体, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,, 补体调节因子 ,,,, ,,,,, ,,;,,, 服镜蛇毒因子 ,,,,,,, ,,,,; ,,,,, ,,,,;,,,, 延迟性异种排斥反应 ,,,,;,,,, 半乳糖 ,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,, 绿色荧光蛋白 ,,,,,,;,,, ,,,,;,,,, 超急性排斥反应 ,;,,, ,,,;,,,, ,,,,;,,,, 急性血管性排斥反应 ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, 延缓性异种移植排斥 ,,,,,,,, ,,,,;,,,, 细胞性排斥反应 ,,,,,,,,,,, ;,,,, 血管内皮细胞 , ,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,, , ,，,一半乳糖基转移酶 ,,,,,,,, ;,,,;,,, ,,,,,,, 膜蛋白辅助因子 ,,;,,—,;;,,,,,,,,, ,,;,,, 促衰变因子 ,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,, ,,;,,, 同源限制因子洲?,,至狮眦 种,肌啉傩„,刍叽脚晰,暮撇 ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ;,,, 抗体依赖性细胞毒性介导效应 ,,,,,,,, ;,,,,,,,;, ,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,, 细胞间粘附分子 ，,,,,,,,,,,,,,;,,;, 免疫荧光法 ,,,,,,,,,,, 白细胞介素 ,,,,,,,, ,,,,;, ;,,,,,, 膜攻击复合物四球儿眦四 ,,,,,,,,, ,,,,;, ;,,,,,, 膜攻击复合物抑制因子 ,,,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,, ;,,,;,,, ,,,,,,, 膜辅助蛋白卿四 ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,;,,,, 膜反应性溶破抑制物 ,,,,, ,,,,,,,, ,;,,,,,,,, ,,;,,, 血小板激活吲子 ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,;, ,,, 聚合酶链反应 ,,,,,,,,,,,, ,,,;,, 聚乙二醇，壹眦呲枞 ,,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,, 补 体激活调节因子 ,;,,,,,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,,, ,,;,,,,, , 可溶性补体受体,四啷 ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, 十二烷基磺酸钠, ,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,, 绑织…子路径抑制物, ,,,;,,,, ;,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,, 血管细胞朴附分子, ,,,,,,,,,,,, ,, 异种抗体, ,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, 异种反应天然抗体, ,,,;,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 猪内源性逆转录病毒, ,,,,,;;, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 改良的必需培养基, ,,,,, ,,,,,, ,,,,, 脯牛血消, ……挑,洲删瞵吖 ,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, 睾丸决定因子 ,,, ;,,,,,,,,,中困农业人举硕,,学位论艾 笫一章文献综述 第一章文献综述,，,异种器官移植 随着免疫学?姆伤俜?埂,约肮δ芮看蟮拿庖咭种埔?锏牟欢嫌肯郑 鞴僖浦材壳凹罕蝗衔 切矶嘀漳? 说淖钣行У某晒Φ闹瘟剖侄巍,档土嘶颊呃Уヒ换蛏偈 鞴傺现厥芩谄鞴偎ソ卟? 穑 スδ芏 贾滤劳龅奈,招裕 ?晒Φ匮映せ颊叩纳 岣吡嘶颊叩纳 钪柿俊, 牵 壳叭死嗥鞴俟?宥倘毖现叵拗屏似涓 惴旱挠τ谩 ,梢浦财鞴俚墓?罅坎畈欢显龃螅 萜鞴芤浦补蚕砹 臣疲 拦 加校叮常 埃埃懊 ?嗽诘却 恢掷嘈偷钠鞴伲 ?艺飧鍪 秩栽诓欢显黾印,矶嗷加行脑唷?卧唷?鲈嗉 踔粱加猩窬 ト酰 窬 У鞯燃膊〉幕颊叨枷, 芡ü 鞴僖膊?约疤悄虿〉幕颊撸 浦不蛳赴 浦驳靡灾斡 保薄,庵盅现氐墓?迤鞴俣倘钡木置妫 蟠蟠俳 嗣嵌苑侨嗽雌鞴俚目梢浦残缘难芯俊,保 保 币熘忠浦玻保 桑 保 备拍罴胺掷?异种移植(,,,,,,,(屯,,,,,,黜,,,,,,,,,,)指不同种属动物之间组织或器官的转移。,。由于不同种属动物遗传背景不同(器官移植后产生的反应不同。,,,,年;,,,,“,首次将异种器官移植分为两类:一、协同性异种移植(,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,):指供受体双方进化关系较近(如人和猩猩、大鼠和小鼠)，在进行器官移植时不产生超急性排斥反应，供体器官存活时间以日计，类似于第一次同种移植的排斥反应。二、非协同性异种移植(,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,):指供受体双方进化关系较远(如猪和人、猪和灵长目动物)(在器官移植中，移植物存活仅数分钟或数小时，类似于第二次接触抗原的同种捧斥反应。这种分类具有一定的科学性和实用性，对科研和临床有着双重价值。,(,(,(,异种移植历史 早在,,,,，法圈的,,,,;,,,,,进行了世界首例临床异种器官移植“,。他将兔的肾脏移植给一位患有尿毒症的病人体内。以后陆续有心脏、肾脏等异种移植报道。但植入的脏器在术后不久均丧失功能，直到,,年代，异种移植才取得一些进展(,,年代中期用完整的猪肝体外灌注作为急性肝衰竭病人的临时治疗措施，大约治疗了,,,余例病人…。用猪肝碎片移植到肝衰小鼠的大网膜，比对照组存活时问延长”?。,,,,,,,,与其同事报道了,例成功将黑猩猩的肾脏移植于人的手术”,。在免疫抑制剂的配合使用下，患者最长的生存了,个月，后经病理分析是由于细胞排斥反应引起炎症而最终导致移植器官衰竭死亡。,,,,年,,, ,,,及其同事完成了一例狒狒心脏移植于人的手术，患者生存了,,多天“?。,(,(,(,异种供体的优点 异种器官移植不仅可以解决人体器官 的严重短缺(而且还具有以下一些独特的优越性。(,)人们可根据需要对供体进行改造(动物供体可通过遗传或生化操作降低排斥反应的危险(进一步 ?扣?收业凡学,,～,,,。学位论义 辩一章文献综述满足患者需要。目前，可以通过基因方法进行基冈敲除(或采,,,,反义,,,技术改变供体脏器细胞表面的异种抗原，以及通过转基冈技术等措施抑制鼻种移植超急性排斥反应的发生(见 ,(,(,(卜,，述)。(,)疾病病原体多数有种属特异性，异种移植可避免同种移植间疾病复发的可能。 (,)异种供体可为先天性疾病患儿提供大小合适的脏器。(,)异种供体来源充足，完全可满足 移植需要。 ,(,(,(,异种动物供体的选择 考虑到免疫相容性，选择与人种属相近的灵长类动物作为供体，移植排斥反应较轻，易于成 功，但应用于,临床异种移植，选择灵长类动物存在许多的不利因素。(,)大量伦理问题的存在。 (,)与成年人体脏器相匹配的动物器官只能源于濒危物种。(,)相对于家畜而言，饲养困难(繁殖周期长且价格昂贵。(,)和肿瘤的发生有关且存在传播各种病毒性疾病的可能和逆转录病毒的危险“…。目前(更多研究选择与人种属关系较远的猪作为异种移植的供体动物(猪是与人类密切生活了数百年的高等动物，容易饲养。成熟快，繁殖快，价格便宜，且其器官与人的器官大小相仿，心血管解剖、器官生理功能与人相似””。猪又是非灵长类动物，引起的伦理道德及安全问题少于狒狒等灵长类动物。更有利的是，随着基因工程技术的不断完善，人们可以对猪的基因组进行改造。随着,,,,年世界首例转基因动物模型的建立““，转基因动物技术已广泛应?糜谏 镅У母鞲隽煊颍 参 熘制鞴僖浦惭芯靠 倭诵碌奶斓于,梢酝ü 耘嘌 南赴 行奘危 偻ü 寺〖际跎 龈 屎弦浦驳墓?逯怼,拦 模希睿椋螅瑁榈壤 孟晕??涞姆椒ń 硖ザ 上宋 赴 俗?涞饺ズ寺涯赶赴 校 ?? 尚?磲獭啊 ,保梗梗的暧? ,糯笱Ы 耍茫模担祷 虻既胫砟诓? 兄硪烩ê镄脑嘁浦病,褂妹庖咭种萍潦故芴迤骄 婊睿担 商臁啊埃 保梗梗的辏祝瑁椋簦宥灾砘 蜃榻 懈脑焓怪砥鞴俑 玫啬褪苡谌恕啊薄,玻埃埃澳辏吃拢 ? 校校坦 拘 迹 怯弥沓赡晏逑赴 ü 艘浦布际酰 觯抵豢寺??恚 庑?肿由 镅Ъ际醯娜照橥昝馈,怪硪蝗艘熘忠浦蚕蚴迪种鸩娇拷 ,桑 保 惨熘忠浦舱习?异种移植应用于临床主要面临兰大障碍(,)免疫学障碍，即免疫捧斥反应:(,)移植物的生理功能;(,)病原微生物的感染，包括内源性病毒，寄生虫等。,(,(,(,免疫排斥障碍 猪一人器官移植属于非协同性异种移植，要将其应用于临床，首先必须跨越免疫的屏障。即宿主对异种移植物的免疫排斥反应。目前认为异种移植的免疫排斥反应，包括超急性排斥反应 (,,,,,,;,,, ,,,,;,,,,，,,,)，急性血管性排斥反应(,;,,, ,,,;,,,, ,,,,;,,,,，,,,)，有时也称延缓性异种移植排斥(,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,)，细胞性排斥反应(,,, ,,,,,,,,,;,,,,，,,)，慢性排斥反应(,,,,,,; ,,,,;,,,,)“„”,。下面是将异种移植中宿主免疫系统所引起的免疫排斥反应类型归纳于下表卜,:,中困农业大学硕士学位论文 第一章史献综述表,,,异种移植排斥反应中的免疫组分,,,,, ，,， ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,,,(,(,(,(,超急性排斥反应(,,,) ,,,发生于非协同性异种移植中， 而协同性异种移植中人体内不存在针对对方组织的天然抗体，所以一般不发生,,,。因此,，,,成为猪与人之间器官移植的第一道屏障。 ,,,是指异种器官与受者血管吻合后，在移植体尚未发挥功能时，由受者体内存在的异种天然抗体(,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,。,,,)和移植物血管内皮细胞(,,,,,,,,,,, ;,,,,。,,,)表面抗原结合，通过经典途径或旁路途径激活补体。通常在数分钟至数小时内发生的排斥反应“…。其典型的病理表现为问质组织出血，水肿。梗塞，异种移植器官血管内血栓形成。使移植器官或组织缺血坏死“““(这与人,,,血型不同引起的捧斥反应类似。“。这些“天然抗体”普遍存在于高等哺乳动物体内，是自然免疫的结果，在人体内以相对固定的浓度存在。但它与,,,血型抗体不同，是一种异种天然抗体(,,,)。在出生时并不存在，而是在出生后对胃肠道微生物表达的特殊的碳水化合物表面分子产生应答而很快出现”“。尽管因,,,不相容导致的器官移植排斥反应在免疫病理分析中与,，,,现象极为相似，但引起,,,的异种抗原与,,,疵型抗原不同，这种抗原是一种结合于细胞表面的糖缀合物,一,，,,半乳糖(,,,, ,(,,,,)”„““(图,,,)。 在人体内(,,，主要为，,,，其中,,为抗,,, ,(,(,),,,的,,,(它是由不依赖于,细胞的,,,，,淋巴细胞产生，可以清除体内受损伤细胞，但最重要的作用是防止环境中的细菌入侵，此外还有其它类型的,,,。如抗,,, ,(，，,),,,的，,,型,,,，但只有，,,型抗,,, ,(,，,),,,的,,,才能引起,，,,。而，,,型,,,可抑制，,,型,,,与,,,,(,，,),,,结合。故有一定抑制,,,的作用“,。,),,, ,(,，,),,,表位 ,,, ,(,，,),,,表位是一种存在于除人类(猿和旧世纪猴以外的哺乳动物体内的糖缀合物 (图，,,)，它与血管内皮细胞表面的,,,血型抗原有相似之处(圈卜,),,,〕，在异种器官移植中是引起，,,,的主要因素，因而成为器官移植领域研究的热点。 通过植物凝集素免疫荧光技术。发现猪内皮细胞表面存在三种不同的碳水化合物位点““:,,,,,—, , ,,;,,;卜,，, ,,,卜,,, ,,,,—, , ,,;,,;卜,(简称, ,,,)，, ,,,,;,,, ,, ,,,卜, , ,,,,,;,—,。而人类不具有, ,,,卜, , ,,,卜, , ,，;,,;，,,。连接, ,,,有,种类型的糖链(图卜,)。不同物种细胞表面, ,,,表位分布不同，有袋动物和胎盘哺乳动物如袋鼠、海豚、兔、猪、牛、马、猫、狗以及新世纪猴(南美)细胞表面约有,×,,,,,,×,旷个位 中，司爪、?人学坝，学位论艾 辩,章史献练述 点分布。人血清中直接与, ,,,表位结合的天然抗体火约,， ,,总培的,,”“，而旧,廿,纪猴(?、 ,,)、猿,,,人体内缺乏这种表位，但却存在大鼙犬然抗半乳糖基抗体。“““。 , ,,,表伉是由, ,，,,、,乳糖基转移酶(, ,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,, ,，,,,)催化, 乙酰半乳糖胺末端连上一个,,,,,形成，其催化反应如,卜: ,,,， ,,,—,,,，,,, , ,，, ,,;,,;—,————斗,,, , ,，,,,, ,, ,。,,,;,,;—,，,,, , ,，,,, ,为糖脂或糖蛋白”” 无论糖脂或糖蛋白连接的, ,,,都可以作为, ,，,,,底物，但, ,，,,,不能转移岩藻糖基，因 此不能产生血型,抗原的末端(图,,,)。 ,,, ,,, ?, ,。, , ?, ,， , ,, ,,;,,; ,,;,,; ?, ,，, ，, ,,, ,,, ,,, ,, , ,，, ,,, ,，,(,,:，,, ?, ,，, ,,, ,,;,,; ?,，(, ,, , ,，, ,,;,,; ,,, ,, , ,，, ，, ,，, ,,;,,; ,,; .