高铁肌红蛋白还原酶活力与肉色稳定性关系的研究

高铁肌红蛋白还原酶活力与肉色稳定性关系的研究 高铁肌红蛋白还原酶活力与肉色稳定性关 系的研究 定性之间的关系,并研究了不同实验条件下高铁肌红蛋白还原酶的特性. 结果明:高铁肌红蛋白还原酶在宰后2周内仍然存在较高活性,其活性作用可使肉中的高 铁肌红 蛋白含量持续下降,对肉的色泽稳定起着重要的作用;在pH6.5,酶的活性最大,温度10.C时, 该 酶活性依然很好,可通过创造无氧,pH6.5左右的环境,使该酶发挥活性来调节肉的颜色. 关键词:冷却肉;肉色;高铁肌红蛋白;还原酶 CorrelationActivityofMetmyoglobinReductase WANGYonglin一,ZHAOJiansheng (1.CollegeofFoodScience,NorthwestA&FUniversity,YanglingShanxi712100 2.ShuanghuiFoodIndustryCo.Ltd.LuoheHenan462000) Abstract:ThispaperstudytherelationshipbetweentheactivityofMetmyoglobinreductaseandcolor stabilitybasedonchilledmeatpackagedinCOpackagingandvacuumpackagingstoredin1?1.C.and discussedthecharacteristicofmetmyoglobinreductaseindifferentexperimentcondition.Theresults showedthatMetmyoglobinreductasecouldmaintainahighactivityfortwoweeksafterslaughtering, MetmyoglobinreductasecanreducethecontentofMetmyoglobincontinuouslyandhadamajoreffecton stablingmeatcolour.MetmyoglobinreductasehadthehighestactivityatpH6.5.itsactivitystillgoodat 10.C,couldregulatetheactivityoftheenzymetogetthebettermeatcolorbycreatingnon—O2andpH6.5 packageingtenvironment. Keywords:chilledmeat;meatcolor;metmyoglobin;reductase 中图分类号:TS201.1文献标识码:A文章编号:1001—8123(2010)03—002l一05 0前言 肉的颜色主要是由肉中肌红蛋白的三种不 同化学形式的含量和分布决定的,分别是脱氧肌 收稿日期:2010020 红蛋白(Mb,deoxymyoglobin)氧合肌红蛋白 (MbO2,oxymyoglobin)和高铁肌红蛋白(MMb, metmyoglobin),三种形式之间在一定条件下可以相 2070耳第3期总第133期—— 21 y .??? b a r’S r 0 ????0 C .??a eM h . 【 W 互转化,从而使肉呈现出暗紫色,鲜红色和褐色等 不同的颜色….MMb的还原作用以酶促还原反应为 主’.研究人员已经从一些鱼类和哺乳动物的心肌和 骨骼肌分离出了高铁肌红蛋白还原酶,它们的部分生 理生化特性已被阐明.有关高铁肌红蛋白还原酶活 力与肉色稳定性之间关系的研究是现在的热点问题, 但是结果却不一致,Chiou等’认为高铁肌红蛋白还 原酶活力有利于肉色的稳定性,而Bekhit等认为高 铁肌红蛋白还原酶活力与肉色稳定性没有相关性.本 实验研究了采用CO气调包装和真空包装的冷却肉在贮 藏期间肉中MMb含量变化规律和MMb还原酶还原作 用的大小变化进行评价,并对色泽稳定性不同的肌肉 高铁肌红蛋白还原酶活性进行比较,以找到高铁肌红 蛋白还原酶的活性与肉的色泽稳定性之间的关系,并 控制肉色提供新的途径. 1材料与方法 1.1材料与设备 猪背最长肌;PA/CPP复合塑料袋,透氧度 oO.953×10—6m/m?pa?d;由双汇集团提供. 包装气体:CO,纯度>99.9%,N,纯度>99.9%, LO纯度>99.9%,购于河南气体公司,充气容量 10.0Mpa. 试剂:NADH,purity98%,购于Amresco公 司;马心肌肌红蛋白,purity>95%,购于Sigma公 司;其他所用试剂均为国产化学纯或纯. DZ600/2S真空包装机(上海人民包装股份有限 公司);ZWX-900多功能薄膜封口机(浙江省温州 市鹿城新达包装机);Spectrumlab54紫外可见分光 光度计(上海棱光技术有限公司). 1.2原料肉处理 原料肉为屠宰后24小时,经1?l?,相对湿度 90%,95%下成熟的猪背最长肌.为了减少微生物造 成的变色,所有与肉接触的刀具,仪器和手都用70% 的酒精消毒.将通脊垂直于肌纤维方向切成约1cm 厚大小,用真空包装袋包装后,抽真空.CO包装 组采用同样的方法,用真空包装袋包装后,充入2% CO+CO2+N2混合气.样品包装好后,立即放入4?1? 的冰箱内贮藏,每两天取样,测定肉表面的高铁肌红蛋 白还原酶活性,高铁肌红蛋白百分含量,TBA值. 设计不同实验条件的肌肉提取液(肌肉提取 液,MMb,KFe(CN)甲基蓝,NADH五个因 素),共7组,测定其高铁肌红蛋白还原酶的活性. 另外设计添加不同量的亚铁氰化钾和肌肉提取液, 不同温度和pH条件下,高铁肌红蛋白还原酶的活性 变化. 叠 1.3测定方法 高铁肌红蛋白还原酶活力分析:原理是根据高铁 肌红蛋白溶液在加入肌肉提取液后,580nm下吸收值 的变化.由于实验在有氧环境中进行,因此如果肌肉 提取液中存在高铁肌红蛋白还原酶活性,则反应溶液 在加入肌肉提取液后,其在580nm下的吸光值应该在 短时间内有一个上升.根据吸光值的变化量确定酶的 活性大小. 高铁肌红蛋白含量测定:采用紫外分光光度法. 取5g肉样与lOmL0.04M,pH6.8的磷酸缓冲液,匀 浆60,90s,匀浆液在12,O00g下离&,20min.得到肉 样粗提溶液,测量该溶液在525nm,572nm~H700nm 下的吸光值,计算公式如下: MMb%=I.395一(A572--A700)/(A525--A700) TBA值测定,参照witte等的方法测定,结果表 示,每千克肉中丙二醛的毫克数. 3结果与分析 3.1冷却肉贮藏过程中高铁肌红蛋白还原酶活性 的变化规律 3.1.1冷却肉贮藏期间高铁肌红蛋白还原酶活性变化 CO气调包装和真空包装冷却肉在贮藏期间高铁 肌红蛋白还原酶活性变化,如图1所示. 02468l0l2l4l6l8 贮藏时间/d 图1冷却肉贮藏期间高铁肌红蛋白还原酶活性变化 Fig1.ThechangeofMetmyoglobinreductaseactivityon chilledmeatinstorage 从图l的结果可以看出,真空和CO气调包装冷 却肉在贮藏期间的高铁肌红蛋白还原酶的活性一直保 持较好的稳定性,并且都有所升高.在贮藏的前7d, 真空,nco气调包装冷却肉的酶活性基本相当,在随 后的贮藏期间,CO组的酶活性低于真空组.但从12d 开始,种包装组的酶活性都有显着增加,原因可能 是提取的高铁肌红蛋白还原酶溶液只是粗提液,肌肉 中也存在其他一些还原系统(如细胞色素b5还原系 统等),这些还原系统在无氧的条件下可发挥还原作 用,将肉中的高铁肌红蛋白还原成二价肌红蛋白. 20f0牟第3期蕊鐾7jj期 65432?0 ;}l 0O00O00 OO0O0O0 _【IIJ《\螟避 肉类研究i 3.1.2冷却猪肉贮藏期间MMb含量变化 CO气调包装和真空包装冷却猪肉在贮藏期间 高铁肌红蛋白含量的分析表明(见图2),真空包装 和含CO包装的冷却肉在贮藏期间其肉中MMb的含 量一直下降,由开始的35%左右,下降到第l8d时的 25%左右,贮藏初期(0,6d)下降很快,贮藏后期 (8,14d)下降缓慢,维持在较低的水平(15%左 右),贮藏前后差异显着.这也说明了肉中确实存在 着高铁肌红蛋白还原系统,该还原系统的存在,使三 价铁被不断还原,高铁肌红蛋白的含量也不断减少. 在后期,由于产物(肌红蛋白)浓度变高(>85%), 反应物浓度降低,还原反应减慢.高铁肌红蛋白还原 系统的存在,使肉色的稳定性大大提高,贮藏末期肉 中MMb%--直保持在较低的水平. 40% 35% 30% 如 里25% 20% 15% 024681012l4l6l8 贮藏时间/d 图2冷却猪肉贮藏期间MMb含量变化 Fig2.ThechangeofMetmyoglobinonchilledmeatin storage 3.1.3冷却肉在贮藏期间TBA值变化 为了确定肉中确实存在还原活性,对肉的脂肪氧 化程度(TBA)进行了测定,结果如图3. O.15 0.14 0.13 O.12 0.1l O.10 0.09 O.O8 02468l0l2l4 贮藏时间/d 图3冷却内在贮藏期间TBA值变化 Fig3.ThechangeofTBAonchilledmeatinstorage 脂肪氧化程度的TBA值,在贮藏初期(0,6d) 有一定程度的上升,在贮藏后期(8,14d)缓慢下 降,维持在较低的水平(0.12左右).在贮藏后期 TBA与MMB%的变化趋势是一致的,两者相关性为 0.625,这也间接说明肉中具有还原活性存在,当高铁 肌红蛋白被部分还原后,无氧包装除可保持肉中肌红 蛋白处于还原状态外,无氧环境也在一定程度上抑制 了肉中脂肪氧化,使检测到的TBA值有下降的趋势. 3.2高铁肌红蛋白还原酶特性的研究 对不同的实验条件下肌肉提取液中高铁肌红蛋白 还原酶的还原活性情况进行研究,结果如表l所示. 表1不同实验条件下肌肉提取液中高铁肌红蛋白还原 酶的活性 组别肌肉提取液MMbKFe(CN)甲基蓝NADH酶活性(?A变化 1+ 2— 3加热 4+ 5+ 6+ 7+ 注:”+”表示加入;”一”表示不加. 从表1中可以看出,当反应液中不加肌肉提取液 时,或将肌肉提取液在沸水中加热1Omin后加入,则 都检测不到吸收值的变化.当反应液中不~[INADH或 亚铁氰化钾时,也检测不到吸收值的变化,说明肌肉 提取液的还原活性的发挥必须有NADH或亚铁氰化钾 参与.随着肌肉提取液的增加,酶的活性也随之增大 (表现为反应液吸收值的增加),但其增加的趋势并 不呈直线关系,当反应液中不加亚铁氰化钾时,反应 液在580nm处的吸收值并不发生变化.随着亚铁氰化 钾量的增加,吸收值的变化增大,当亚铁氰化钾/肌 肉提取液为2:l时,吸收值的变化达到最大值,继续 增加亚铁氰化钾的用量,吸收值的变化反而降低.在 不同的pH下观察酶活性变化时,发现当pH6.5时, 酶的活性最大,大于或小于这,pH,酶活性均降低, 而且在4?,I125?下其趋势相同.同时,酶的活性在 25?之前,随着温度的升高而升高,在25?之后,随 着温度的升高,酶的活性下降.. O?l O.08 0.06 《 司O?O4 0.02 0 ,11,?,13\15,1 亚铁氰化钾液/肌肉提取液 图4添加不同量的亚铁氰化钾时反应溶液在580nm处 吸收值的变化 Fig4.Thechangeofabsorptionvalueofreactionsolufonon58(him 20fo耳第j期总第33期互照 北” 2O0OOlO M ++++++M 马 当反应液中不加亚铁氰化钾时,反应液在580nm 处的吸收值并不发生变化(图4).随着亚铁氰化钾量 的增加,吸收值的变化增大,当亚铁氰化钾/肌肉提 取液为2:1时,吸收值的变化达到最大值,继续增加 亚铁氰化钾的用量,吸收值的变化反而降低. O?5 O.4 0.3 < q0?2 0.1 0 66.5 PH 图5高铁肌红蛋白还原酶在不NpHTN}f-~性的变化 Fig5.ThechangeofMetmyoglobinreductaseactivityon differentpHcondition 0?40 O?3O \ 《0.20 司 O?l0 0.0O 5?lO?15?20?25?30? 温度 图6高铁肌红蛋白还原酶在不同温度下酶活性的变化 Fig6.ThechangeofMetmyoglobinreductaseactivityon differenttemperature 在不同的pH下观察酶活性变化时,发现当pH 6.5N,酶的活性最大,大于或小于这一pH,酶活性 均降低(图5),而且在4?和25?下其趋势相同. 同时,酶的活性在25?之前,随着温度的升高而升 高,在25?之后,随着温度的升高,酶的活性下降 (图6).在5?,10?之间,pH为6.0左右时,肌肉 提取液也有相当的还原高铁肌红蛋白的能力,而这种 条件正是肉类在零售时常处的温度,也就是说,肉类 在零售时的温度,pH条件仍然可以使肌肉本身含有的 高铁肌红蛋白还原酶发挥其还原作用,使已形成的高 铁肌红蛋白被还原,从而尽可能地使冷却肉保持鲜艳 的红色. 当在反应液中加入不同量的肌肉提取液作为酶的 来源时,反应系统中吸收值的变化如图7所示.随着 肌肉提取液的增加,酶的活性也随之增大(表现为反 应液吸收值的增加),但其增加的趋势并不呈直线关 系,分析原因可能是因为使用的是肌肉提取液而不是 纯化后的高铁肌红蛋白还原酶.由于肌肉提取液中含 匿 有亚铁氰化钾一高铁肌红蛋白的复合物,因此,增加 肌肉提取液的用量,不仅增加了酶的量,同时也增加 了底物的用量,因此,得到的不是一条直线. 0.12 0.10 0.08 \ 《0.06 司0 .04 O?02 0.00 00.25U.50.,5l1.25 肌肉提取液量(m1) 图7添加不同量的肌肉提取液时反应溶液在580nm处吸 收值的变化 Fig7.ThechangeofabsorptionValueofreactionsolution on580nm 4结论 实验结果表明:0-4~C条件下,真空包装和含微 量CO包装的冷却肉,贮藏期间肉中一直存在高铁肌 红蛋白还原酶活性,可以持续地将高铁肌红蛋白还原 为二价的肌红蛋白,使肉的色泽保持稳定性;对高铁 肌红蛋白还原酶的特性分析表明:在pH6.5,温度4”C (冷却肉的一般贮藏和销售温度)条件下,肉中高铁 肌红蛋白依然具有比较高的活性,可以将高铁肌红蛋 白还原为二价肌红蛋白;在实际生产中,可以在宰后 进行成熟过程,使肉的pH尽可能接近6.5,同时调节 贮藏和运输温度到15?左右,发挥还原酶的作用,保 持肉色稳定. MMb的积累速率取决于Mb和MbO的自动氧化速 率和MMb的还原速率.高铁肌红蛋白还原酶是MMb 酶促还原反应中的关键酶,在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)的存在下,它可以有效地将MMb(F)还原 成二价(Fe)状态.研究表明:MMb可以在有酶参 与下也可在无酶参与下被还原,但是非酶促还原反 应要比酶促还原反应速率低得多;NADH是还原反 应所必需的;亚铁氰化物对高铁肌红蛋白还原酶活 力的完全表达是必要的作为一个激活因子提高了电 子转移的速率,加,”. 以前很多研究都表明,肉中高铁肌红蛋白还原 酶在宰后一定时间内,其活性逐渐下降直至消失,但 我们的研究却发现,贮藏期间其高铁肌红蛋白还原酶 粗提液中,还原活性不仅没有下降,而且还有上升的 趋势,分析其原因可能有以下几点:一是采用的两种 包装方法都处于基本无氧的状态,高铁肌红蛋白还原 酶正好可发挥其作用,将形成的高铁肌红蛋白还原成 二价的肌红蛋白;二是提取的高铁肌红蛋白还原酶溶 2070耳第;期总第133期 液只是粗提液,肌肉中也存在其他一些还原系统,并 将肉中的高铁肌红蛋白还原成二价肌红蛋白. 在本实验中,采用冷却猪肉的提取液,发现高 铁肌红蛋白还原酶在pH为6.O左右时,肌肉提取液 也有相当的还原高铁肌红蛋白的能力,这种还原作 用在0?,25?间随着温度的升高而增强,但其在 5?,10?之间也有相当的活性.也就是说,肉类在 零售时的温度,pH条件仍然可以使肌肉本身含有的 高铁肌红蛋白还原酶发挥其还原作用,使已形成的高 铁肌红蛋白被还原,从而尽可能地使冷却肉保持鲜艳 的红色. [1] [2】 [3】 【4] 参考文献 JayasinghP,CornforthDP,CarpenterCE,eta1. Evaluationofcarbonmonoxidetreatmentinmodified atmospherepackingorvacuulilpackagingtoincrease COlOrstabilityoffreshbeefIJ】.MeatScience,2001, 59:317-324. 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