水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用

水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用 for polyphenol oxidase in the castant temperature vibration of 30 ? and 110r/ min ,the maxmum enzyme activity of the former was 395 . 6u and the later was 549 . 0u. The optimum temperature and p Hwere 25 ?, 2 + + were activators for laccase and Zn4 . 6 for laccase and 30 ?, 5 . 0 for polyphenol oxidase , Kand 2 + 2 + 2 + 3 + + Mn,Ba,Mgfor polyphenol oxidase ,whereas Feand Ag were inbhited for both of them. Key words : Corilus versicolor ; laccase ;polyphenol oxidase + () 中图分类号 :Q81311 1 文章编号 :1004 - 311X200006 - 0018 - 03 文献标识码 :A 水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用 梅兴国 ,张舟宁 ,苏湘鄂 ,龚伟 () 华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉 430074 ( ) ( ) 摘 要 :通过添加不同浓度的水杨酸 SA,比较了它们对红豆杉细胞过氧化物酶 POD、苯丙氨酸解氨 ( ) ( ) 酶 PAL、过氧化氢 HO含量及对细胞生长和紫杉醇含量的影响 ,结果表明 ,SA 可提高 POD 及 PAL 的 22 活性 ,促进细胞内 HO含量的上升并有利于紫杉醇的合成 ,其中 20mg/ L SA 对紫杉醇合成的促进效果 22 最明显 ,紫杉醇含量可达对照组的 13 倍 。 关键词 :紫杉醇 ;水杨酸 ( ) Taxus Chinensis 愈伤组织 ,经多次国红豆杉 植 物 在 受 到 外 界 刺 激 时 会 发 生 防 御 反 筛选继代 。由本实验室提供 ,代号为 C,培应 ,表达病原相关蛋白质并合成抗毒素 。植 42 # 物抗毒素是植物细胞次生代谢产物 ,在细胞 养基为 62 。 内的含量很低 ,甚至一般情况下不合成 ,通过 112 诱导处理 : 实验采用 250ml 三角瓶 , 每 优化培养基成分和调控培养条件往往不能有 瓶分装 100ml 液体培养基 , 接种抽滤后的鲜 效提高其产量 。于是人们根据植物自身的防 ( ) 细胞 10g ,25 ?摇床培养 120r/ min。水杨酸 御反应 ,利用生物和非生物诱导剂胁迫植物 ( ) 于悬浮培养的第 14d 0h加 入 , 添 加 的 终 浓 细胞合成并积累次生代谢物 。已知许多真菌 度分别为 5mg/ L 、10mg/ L 、20mg/ L 、50mg/ L 。 或病毒均能诱导植物产生抗性 ,另外有些小 ( 113 测定方法 : 将抽滤干的细胞按 1?1 W/ 分子化合物如乙烯 、水杨酸 、茉莉酸甲酯 、寡 ) () V加入磷酸盐缓冲液 p H710 ,10mmol/ L,冰 糖素等也可作为诱导子 。许多生物诱导子是 浴中 匀 浆 , 10 , 000r/ min , 冷 冻 离 心 10min , 取 不同化合物组成的粗提物 ,既有活性成分又 上清液作为粗酶液 。 2 有拮抗成分 ,造成实验重复性差 ,而直接利用 11311 POD 活 力 的 测 定 : 按 文 献方 法 测 信号分子进行诱导 ,则可避免这种情况 。 定 ,以光密度变化 011/ min. mg 蛋白为 1 个活 ( ) 水杨酸 salicylic acid , SA是一种广泛存 力单位 ,用 A表示 。 POD3 在于植物体内的酚类物质 ,不仅参与许多生 11312 PAL 活 力 的 测 定 : 按 文 献方 法 测 理过程 ,还与植物抗病反应密切相关 。近来 , 定 ,以光密度变化 011/ h. mg 蛋白为 1 个活力 SA 作为植物系统获得性抗性所必需的信号 单位 ,用 A表示 。 PAL 分子而受到广泛的关注 ,并被认为是一种新 11313 HO含 量 的 测 定 : 取 适 量 抽 滤 后 的 22 1 的植物激素。本文考察了水杨酸对红豆杉 () 细胞 300mg - 400mg加 预 冷 的 丙 酮 1ml , 冰 ( ) 细胞过氧化物酶 POD活力 、苯丙氨酸解氨 浴中 匀 浆 , 10 , 000r/ min , 冷 冻 离 心 10min , 取 4 ( ) ( ) 酶 PAL活力 、过氧化氢 HO含量 、细胞活 22 上清液按文献方法测定 ,以 01001 光密度/ () 力和紫杉醇 taxol含量的影响 。 mg 细胞为 1 个单位 ,以 A表示 。 H O 2 2 511314 蛋白质含量的测定 : 用 Bradford 法 1 材料与方法 测蛋白质含量 ,以牛血清白蛋白作 。 11315 红豆杉细胞活力的测定 : 取 100mg 抽 111 实验材料 :试验用红豆杉细胞株来自中 ( 滤 后 的 细 胞 , 加 215ml 的 磷 酸 盐 p H710 , ) 011mol/ L缓冲液和 215ml 0 . 4 %TTC ,25 ?暗 收稿日期 :2000 - 01 - 10 处 反 应 13h , 用 蒸 馏 水 洗 涤 3 次 后 , 加 5ml95 %乙醇 ,60 ?水浴 30min ,485nm 测吸光 值 ,以 95 %乙醇作参比 。 11316 紫杉醇含量的测定 :准确称取冷冻干 燥后细胞 100mg ,充分研磨 ,每次加入 3ml 甲 醇重复浸提 ,合并浸提液并减压抽干 ,加入氯 仿和水萃取 ,取氯仿相 ,减压除去氯仿 ,浸膏 用 1ml 甲醇定容 , HPLC 测定紫杉醇含量 。 2 结果与 211 水杨酸对红豆杉细胞 POD 活性的影响 图 3 水杨酸对红豆杉细胞 H O 的影响 2 2 由图 1 可见 ,不同浓度的水杨酸对红豆 杉细 胞的 POD 活力均具有诱导作用且 POD 的活图 3 显示了不同浓度的水杨酸对 HO 22性随 SA 浓度的增加和时间的延迟而增 含量的影响 ,结果表明添加水杨酸后 ,细胞内 高 ,20mg/ L 和 50mg/ L 的 水 杨 酸 的 诱 导 效 果 HO的含量均有不同程度的提高 ,其中以浓 22 均比较显著 。 度为 20mg/ L 时 诱 导 效 果 最 佳 , 在 添 加 后 的 24h 后均维持在较高的水平 。 214 水杨酸对红豆杉细胞活力和紫杉醇合 成的影响 表 1 SA 对细胞活力和紫杉醇含量的影响 比 生 活 力 比 生 活 力 含 量Taxol SA 添加浓 ( ( 添 加 后 添 加 后 μ(g/ g 细 ()度 mg/ L ))第 2d 第 7d ) 胞 10 110 411 1空白对照 5 0. 935 0. 906 4. 8 0. 912 0. 87 12. 57 10 20 0. 886 0. 832 56. 2 50 0. 67 0. 558 15. 41 图 1 水杨酸对红豆杉细胞 POD 活性的影响 表 1 显示了水杨酸对细胞活力的影响 , 添加的浓度越高 ,细胞活力下降越显著 ,添加 的浓 度 为 50mg/ L 时 , 24h 后 细 胞 即 开 始 褐 化 ,继续培养 2d , 3d , 发 现 培 养 液 中 有 红 色 分泌物 ,并有死细胞团出现 。一般而言 ,诱导 子对细胞生长有抑制作用 ,因为它诱导产生 的抗毒素对细胞自身多具有毒性 ,因而添加 的浓度需严格控制 ,使之既能在一定程度上 刺激细胞发生过敏反应合成次生代谢物 ,又 不严重影响细胞的生长 。 在实验的浓度范围内 ,水杨酸添加不同 程 度 上 均 有 利 于 紫 杉 醇 的 积 累 , 浓 度 为 图 2 水杨酸对红豆杉细胞 PAL 活力的影响 20mg/ L 时 , 对 紫 杉 醇 合 成 的 诱 导 效 应 最 显 212 水杨酸对红豆杉细胞 PAL 活性的影响 :著 ,约为对照组的 13 倍 。 由图 2 可见 ,在添加的浓度范围内 ,水杨酸在 24h 内 即 不 同 程 度 地 提 高 了 细 胞 的 PAL 活 3 讨论 力 , 且 强 度 与 添 加 浓 度 正 相 关 ; 但 24h 后 50mg/ L 处理组的 PAL 活力急剧下降 ,这可能 水杨酸在植物抗病中起着重要作用 ,它 与细胞受到的刺激过强发生死亡有关 ,其余 可诱导植物合成相关的抗病蛋白和抗毒素 , 3 组活力变化的趋势相似 , 最高峰出现在添 引起植物发生过敏反应并诱发系统获得性抗 加后的第 24h ,然后活力下降并趋于平缓 。 性 ,水杨酸的主要作用即是将病害和创伤信 213 水杨酸对红豆杉细胞 HO含量的影响 22 号传递到植物的其它部分 。 实验结果表明 ,水杨酸提高了红豆杉细是通过抑制细胞过氧化物酶的活性 ,使植物 胞 POD 和 PAL 的活性 。POD 同植物抗胁迫 体内 HO水平上升 ,从而诱导或加强抗病反 22 密切相关 ; PAL 则是苯丙烷类代谢途径的限 应 ,同时 , HO或源于它的 其 它 活 性 氧 还 可 22 速酶 ,而与此途径有关的次生代谢物多与植 作为第二信使 ,激活抗病途径中的防御相关 物的抗病性有关 ,它也是连接初生代谢和次 基因 。事实上 ,活性氧的产生与植保素的形 9 成确实存在对应的关系。尽管对于活性氧 生代谢的关键酶 ,最近的研究结果表明 PAL 6 是否即是启动细胞防卫机制的信号分子仍有 还是植物 SAR 的 调 节 酶。POD 和 PAL 活 争议 ,但它在植物防卫反应中的作用是毋庸 性的增高在一定程度上表征了细胞次生代谢 置疑的 。 的增强 ,有利于抗毒素的合成和积累 。紫杉 水杨酸的单独作用有时并不能有效地诱 醇是一种次生代谢物 ,细胞在正常情况下不 导植物防御反应 ,但它可极大地增强其它诱 会大量 合 成 。水 杨 酸 诱 导 细 胞 产 生 过 敏 反 导子的诱导效应 ,因而可利用水杨酸和其它 应 ,提高与次生代谢物合成相关的酶的活性 诱导子的协同作用 ,进一步提高紫杉醇的产 从而促进细胞积累紫杉醇 。但过高浓度的水 量 。 杨酸会严重影响细胞的生长 ,反而使紫杉醇 的含量下降 ,因而需选择合适的水杨酸添加 参考文献 : 剂量 。 实验结果显示 ,水杨酸的适量添加 ,使得 1 林忠平 ,胡鸢雷 1 植物学报J ,1997 ,39 :185 ,1881 红豆杉细胞中的 HO能在较长的时间内维 22 2 张龙翔 ,张庭芳 ,李令媛 1 生化实验方法和技术 M 1 北 持在较高的水平 ,这可能有利于紫杉醇的合 京 :高等教育出版社 ,1981 ,182,1851 成 。水杨酸在植物抗病反应中的作用已被证 () 3 王敬文 ,薛应龙 1 植物生理学报J ,1982 ,8 1:35,431 7 实 ,但它的作用途径则不甚清楚 。Chen等 4 林植芳 ,李双顺 , 林桂珠 , 等 1 植物生理学报 J , 1988 , ( ) 在烟草中发现水杨酸的结合蛋白 SABP是 14 :16,221 一种过氧化氢酶 ,且在离体条件下水杨酸可 5 Bradford M M. ,Anal . Biol . ChemJ ,1976 ,72 :248 ,2511 抑制过氧化氢酶的活性 。水杨酸预处理的欧 6 Smith - Becker J , et al . Plant Physiol J ,1998 ,116 : 231 , 芹悬浮 细 胞 在 激 发 子 作 用 下 可 产 生 更 多 的 238 . 8 7 Chen ,Z. X. , et al . Proc . Natl . Aca d. Sci. USAJ ,1991 , HO。因而水杨酸一条可能的作用途径即 22 88 :8179,8183 . 8 Kauss ,JeblickW. Plant Physiol J ,1995 ,108 :1171 ,1178 . Effect of salicylic acid on the cell 9 Baker , Orlandi EW , Annu. Rev Phytopathol J , 1995 , 33 : 299,321 . suspensions of Ta xus Chi ne nsis MEI Xing - guo ,ZHANG Zhou - ning ,SU Xiang - e , GONG Wei ( School of Life Science & Technology , Huazhong University )of Science & Technology ,Wuhan 430074 ,China ( ) ( ) Abstract :The activity of peroxidase POD,phenylalanine ammonia - lysae PAL,the content of hydro2 ) ( gen peroxide HOand the biosynthesis of taxol in Taxus Chinensis suspension culture exposed to vari2 22 ous concentrations of salicylic acid was investigated. The results indicated that the addition of SA was fol2 lowed by an increase in POD 、PAL activity and it also promoted the content of HOand taxol . Taxol pro2 22 ductivity increased 13 - fold when the cultures were exposed to 20mg/ L SA. It suggested that SA could be used as an elicitor to improve the taxol yield in taxus cell culture . Key words :taxol ,salicylic acid + () 中图分类号 :Q539 13 文章编号 :1004 - 311X200006 - 0020 - 03 文献标识码 :A 巴氏醋酸杆菌纤维素合成条件初探 周媛 ,邵伟 ,涂志英 ,黎姝华 ()三峡大学生物研究所 ,湖北 宜昌 443003 摘 要 :通过试验探索出巴氏醋酸杆菌在蛋白胨 110 % 、 收稿日期 :2000 - 07 - 20