利福霉素B发酵过程中巴比妥钠加量优化

利福霉素B发酵过程中巴比妥钠加量优化 摘要,目的优化利福霉素发酵摇瓶中巴比妥钠的添加量及 添加策略,以提高发酵产量。方法采用摇瓶发酵,优化巴比 妥钠初始含量及中间补加策略,通过测定发酵液中利福霉素 B的效价及菌体浓度来确定合适的发酵。结果巴比妥钠 添加的优化策略为,初始浓度0.05,,72 h补加至0.1,, 120 h补加至0.15,。结论优化工艺使发酵单位显著提高, 比不加巴比妥钠提高17%,比目前生产水平提高10,以上。 关键词,利福霉素,地中海拟无枝酸菌,巴比妥,发酵 优化 中图分类号,R978.1+5文献标识码,A文章编号, 1672-979X(2007)02-0011-03 Optimization of Barbital Sodium Content during Fermentation of Rifamycin B WANG Jun-feng1, DU Ji-quan2 (1.Shenyang Tonglian Pharmacy Group, Institute of Biological Technology of Shanghai, Shanghai 200237, China; 2. Management Committee of Jinan High & New Technology Developing Zone, Jinan 250002, China) Abstract,Objective To optimize the content and feeding 1 strategy of barbital sodium during the fermentation of rifamycin B in order to improve the yield. Methods In shaken flask culture, the content and feeding strategy of barbital sodium during the fermentation of rifamycin B was optimized and the suitable fermentation technology was also defined by determining the potency of rifamycin B and PMV of mycelia in fermentation broth. ResultsThe optimal feeding strategy of barbital sodium was obtained, which was that the incipient concentration of barbital sodium was 0.05% in base medium and was added to 0.1% at 72 h, 0.15% at 120 h. Conclusion The yield of rifamycin B is raised significantly with the technology optimized. The productivity of rifamycin B is increased by 17% than that without barbital sodium and 10% more than that produced at the present level. Key words,rifamycin B; Amycolatopsis mediterranei; barbital; fermentation optimization 利福霉素,rifamycin,是地中海拟无枝酸菌 ,Amycolatopsis mediterranei,产生的一类安莎 ,ansamycin,大环内酯抗生素,广泛用于治疗革兰阳性菌 ,G+,、结核病、麻风病以及与艾滋病有关的分枝杆菌感染 [1]。近年分枝杆菌引起的肺结核患者数量呈上升趋势,因此 2 研究利福霉素及其产生菌有重要意义。 从地中海拟无枝酸菌培养液中得到的利福霉素有A,B,C,D,E5种组分,其中主要为B。后来在不同菌种的发酵液中又发现了O,S,SV组分[2, 3]。 利福霉素B只有微弱的抑菌活性,但是,它可以通过化学修饰、酶催化或生物转化成为抑菌活性较高的SV。SV是首个临床应用的利福霉素类抗生素。SV是B生物合成的前体,阻断B合成的菌株可导致SV积累,此已经成功地实施[4],但是经过处理的菌株产量较低。目前商业应用大多先生产B,然后将其转化为O,S及SV,转化关系如图1所示[5]。 图1 利福霉素B转化为利福霉素SV和其他临床应用的类似物 巴比妥,barbital,能够刺激A. mediterranei合成利福霉素,一般认为,它对B的生物合成有诱导作用,在发酵前期增加巴比妥将促进生物代谢定向合成B。最近Mejia 等[6]报告,低通气量时,巴比妥对 A. mediterranei的作用更为明显。在此条件下,含有巴比妥的培养物和对照,不含巴比妥,在CO2生成量上相似,但是,前者O2摄取高于后者,多出的O2被用于增加利福霉素的合成。实验证明,巴比妥是通过激活细胞色素P450型的单加氧酶起作用的。此外,巴比妥有一定的毒性,这与B的生物合成有关[7]。文献报道 3 的巴比妥添加浓度很不一致,因此有必要对此进行考察。 1材料 1.1出发菌株 地中海拟无枝酸菌X-1# ,同联制药集团上海生物技术有限公司,。 1.2培养基 一级种子培养基,g/L,,葡萄糖20,酵母粉4,蛋白胨4,水解酪素4,氯化钠1.5, 二级种子培养基[8],g/L,,葡萄糖40,黄豆饼粉25,(NH4)2SO4 2,KH2PO4 1,Mg SO4 1,CaCO3 12, CuSO4 0.0033, FeSO4 0.01, MnSO4 0.004, ZnSO4 0.05, CoCl2 0.002,钼酸铵 0.001, 摇瓶发酵培养基,g/L,,葡萄糖90,黄豆饼粉25,(NH4)2SO4 2,KH2PO4 1,Mg SO4 1,CaCO3 12,CuSO4 0.0033, FeSO4 0.01, MnSO4 0.004, ZnSO4 0.05, CoCl2 0.002, 钼酸铵 0.001,巴比妥钠 1.5, 发酵罐培养基,g/L,,葡萄糖90,黄豆饼粉55,(NH4)2SO4 2,KH2PO4 1,Mg SO4 1,CaCO3 12,CuSO4 0.0033, FeSO4 0.01, MnSO4 0.004, ZnSO4 0.05, CoCl2 0.002, 钼酸铵 0.001, 巴比妥钠 1.5,消沫剂0.02%。 2方法 4 2.1菌浓和化学效价测定 菌浓,PMV,用离心体积法测定,化学效价用分光光度法测定[9]。 2.2 基础培养基中巴比妥钠含量的优化 将基础培养基中巴比妥钠的含量设定为0.00%,0.15%,0.30%,0.50%及0.70% 5 个水平,培养8 d后测量发酵单位。根据实验结果,在巴比妥钠浓度较低时,进行第2次单因素考察实验。 2.3巴比妥钠补加策略优化 在巴比妥钠不同初始含量的基础上,于发酵后72 h和120 h分别增加巴比妥钠的量,使其浓度分别达到0.1%,0.15%,测定巴比妥钠不同浓度对发酵的影响。 3结果与讨论 3.1基础培养基中巴比妥钠含量优化的结果 巴比妥钠浓度增加到一定水平后,对菌体生长和利福霉素B的合成都产生了明显的抑制作用,并且产率,产量/菌浓,在巴比妥钠浓度为0.15%时最高,此后随着巴比妥钠浓度增 5 高而下降。见1。 表1不同巴比妥钠加量摇瓶实验结果 *相对值 根据这一结果,降低巴比妥钠浓度,分别为0.00%,0.05%,0.10%,0.15%及0.20%,用水平1,2,3,4,5表示,,进行第2次单因素考查实验,结果见图2。 P,1,5,效价,PMV,1,5,菌浓 图2巴比妥钠初始浓度对利福霉素B发酵的影响 当巴比妥钠浓度低于0.2%时,对菌体生长的影响较小,此实验结果与表1一致。此时巴比妥钠的主要作用是刺激菌体合成B,而且巴比妥钠在基础培养基中的初始浓度不同,对B生产能力的影响程度也不同。起始浓度为0.1%时,最终发酵单位最高,浓度为0.05%时,120 h B的发酵单位最高,浓度为0.15% 时,120 h之后效价增长最快。由此推测,逐次提高发酵培养基中的巴比妥钠浓度可能有利于利福霉素B的产生。 3.2发酵过程中巴比妥钠补加策略优化 结果见表2。与对照组相比,增加巴比妥钠的1~9组发酵单位提高,进一步说明巴比妥钠对生产利福霉素B有促进作用。其中第8组效果最好,即巴比妥钠起始浓度为0.05%,72 h补加至0.1%,120 h再补加至0.15,发酵单位比不加巴比妥钠提高17%,比目前生产配方提高10%以上。比较1, 6 4和9还可知,起始浓度为0.1%较合适,这与图2所示的一致。由表2还可见,72 h巴比妥钠的浓度不宜太高,否则会影响产量,可能是因此时菌株还不能够适应这一浓度,而到后期适应性会越来越强。 实验中向利福霉素SV的培养基中添加巴比妥钠没有起到促进作用,结果未给出,Murali[10]也曾在利福霉素添加了巴比妥,发酵单位只比不加巴比妥的提高1.2%,,说明巴比妥钠的作用可能发生在利福霉素SV合成之后,这一结果支持巴比妥促进定向合成B的观点。 表2不同时间补加巴比妥钠的实验结果 4结论 巴比妥钠具有刺激菌株产利福霉素B的作用,但是发酵培养基中巴比妥钠的浓度不应高于0.2%,浓度较高对菌体生长和利福霉素B合成都有明显的抑制作用。通过实验筛选出了补加巴比妥钠的优化策略,即初始浓度0.05,,72 h补加至0.1,,120 h补加至0.15,。使用该策略可使发酵单位比不加巴比妥钠提高17%,同时比目前生产水平提高10,以上。 参考文献 [1]Griffith D E, Wallace R J. New developments in the treatment of nontuberculous mycobacterial (NTM) disease [J]. Semin Respir Infect, 1996, 11 (4): 301-310. 7 [2]Sensi P, Greco A M, Ballotta R. Rifomycin. I. Isolation and properties of rifomycin B and rifomycin complex [J]. Antibiot Annu, 1959, 7: 262-270. [3]Sensi P, Margalith P. Rifamycin, a new antibiotic [J]. Farmaco Ed Sci, 1959, 14 (2): 146-147. [4]Lancini G, Hengeller C. Isolation of rifamycin SV from a mutant Streptomyces mediterranei strain [J]. J Antibiot (Tokyo), 1969, 22 (12): 637-638. [5]Floss H G, Yu T W. Rifamycins mode of action, resistance, and biosynthesis [J]. Chem Rev, 2005, 105: 621-632. [6]Virgii A, Marcelli I E, Agrimino A. Aeration-agitation studies on the rifamycin fermentation [J]. Biotechnol Bioeng, 1964, (6): 271-283. [7]Mejia A, Barrios J, Viniegra G. Overproduction of rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei and its relationship with the toxic effect of barbital on growth[J]. J Antibiot, 1998, 51 (1): 58-63. [8]赵成建, 张定丰,金志华. 利福霉素B发酵放大?从摇 瓶到15L发酵罐的发酵放大 [J]. 中国抗生素杂志,2002, 27,7,,398-402. [9]孟根水. 利福霉素B产生菌的推理选育及发酵工艺的 8 优化 [D]. 杭州,浙江工业大学,2002-04-01. [10] Murali P S, Venkateswarlu G, Venkateswar L. Effect of uracil on rifamycin SV production by Amycolatopsis mediterranei MV35R[J]. Lett Appl Microbiol, 2000, 31 (1): 73-76. 注,“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF 阅读原文。” 9