PCR-RFLP和MLPA基因诊断脊肌萎缩症研究(可编辑)

PCR-RFLP和MLPA基因诊断脊肌萎缩症研究(可编辑) PCR-RFLP和MLPA基因诊断脊肌萎缩症研究 天津医科大学 硕士学位论文 PCR--RFLP和MLPA基因诊断脊肌萎缩症的研究 姓名:陈红苓 申请学位级别:硕士 专业:临床医学;儿科学 指导教师:宋力 2012-05天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的 脊肌萎缩症 ,是一种以脊髓前角退行性变为 特征的常染色体隐性遗传病,表现为下运动元性、进行性、对称性肌无力和萎 缩,近端重于远端,下肢重于上肢。人群中发病率约为/,突变基因携带 频率为/./? 居致死性常染色体隐性遗传病第二位,仅次于囊性纤维变。 目前尚没有有效的治疗方法,因此先证者的基因检查和群体中携带者的筛查工 作对于遗传咨询、指导生育具有重要的作用。该病的致病基因为运动神经元存活基因 ,,位于.~.。基因有个拷贝,即和。 和高度同源,二者仅有个碱基的差别。一般认为为该病的主 要致病基因,属调节基因,与疾病的严重性呈反比。研究认为,约%的 患者存在第和或第外显子的纯合缺失和转变为, 而约%的患者是由基因突变引起的。因此,基因第、外显子缺 失成为诊断该病的主攻方向。 本研究分别采用以往应用最广泛的检测基因的聚合酶链式限制性片 段长度多态性分析.方法和最新的多重连接依赖式探针扩增 技术对例临床疑似患儿及其父母进行基因诊断,并对两种方法进行比 较,分析两种方法对各类基因缺失先证者诊断的一致性,评估方法 对携带者检出的准确度。 方法 本研究采用盐析方法提取所有受试者外周血,的纯度和浓度均经 核酸定量仪 测定。常规.方法扩增 、 外显子,用 和 酶切产物,%琼脂糖凝胶电泳检测及酶 切产物,凝胶成像系统记录结果。同时利用试剂盒 方法进行验证比 较,计算黝研拷贝数,并对病人组、携带者组与正常对照组拷贝数 进行 比较,采用 统计分析。 结果天津医科大学硕士学位论文 根据实验结果共确诊例为病人,即例岛舢第号外显子纯 合缺失患儿和例纯合缺失,两种方法结果一致。回顾分析临床表 现,发 病年龄,疾病进展等临床资料,确定型例,型例,?型例。其余 例.方法未见异常家系中经方法分析发现例患儿和例母亲 为外显子、杂合缺失携带者;方法还在家系中发现例“” 型携带者。方法共分析检出例携带者和例正常者。结果发现 拷贝数在患者中以、为主、携带者以、为主、正常人以、多见, 其各拷贝数的频率分布在病人组与携带者组.、病人组与正常人 组 .中.,而在携带者与正常人组..。 结论 与.相比,更加简单、准确、高效,仅需要少量的模 板就能快速准确的定量、僦还有助于区分表型和筛查携带者,是 一种 高效的遗传病基因诊断方法,能为遗传咨询提供可靠的信息,相 信以后会在临 床广泛应用。 . 关键词:脊肌萎缩症 基基因诊断天津医科大学硕士学位论文 .,. .: /?/. . .., ,,.? ..,.. % /讧. % . 副沥 ?【. . ’. . ‘.? . .% ..,. . . ?, ,. . ., ,.. . “” .. , ... ?.. ... ?. ... , , . . : ,? , 天津医科大学硕士学位论文 ??????????????????????????????????????????????????????? ??一一 缩略语/符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 ‘。叫‘。 扩增阻滞系统 ’’’。‘ 基本转录因子 , 变性高效液相色谱分析 法 . 全长基因产物 高分辨率的溶解分析 ‘ 。 ‘粤 多重连接依赖性探 /’‘?????。’?’’??。’ 神经元凋亡抑制蛋白基 因 ?限制性片段长度多态性 . 分析聚合酶链一单链构象多态 . 性分析 产前植入诊断 特异性等位基因扩增 脊髓性肌萎缩症 运动元存活基因 天津医科大学硕士学位论文 核小分子核糖蛋白 天津医科大学硕士学位论文 刖吾 研究现状、成果 脊肌萎缩症 ,属于常染色体隐性遗传病,其 发病率在新生儿为:.,居致死性常染色体遗传病的第二位,仅次 于囊 性纤维变【。该病以脊髓前角运动细胞变性为特征,也可累及脑 干神经元。其临 床主要表现为下运动元性、对称性、进行性肌无力或肌萎缩,近端重于远端, 下肢重于上肢。根据发病年龄和病程临床最新的分类方法主要分为四型,型脊 肌萎缩症 又称争坩病,患儿于出生后个月内发病, 表现为严重的全身肌无力和肌张力不全,不能独坐或行走,多于岁内死于呼 吸肌麻痹;型也称为中间型,出生后?个月间发病,患儿可独坐, 但不能独立站立和行走,大多能存活年以上;?型又称. 病,为轻型,个月后发病,多数仅表现有肌力弱,可以保持独立行走和 站立,一般在成年后死亡。工型症状很像?型,但一般在岁以后发病,这 种成年发病形式可以有一个正常的生存期限【】。 的致病基因定位于人类第号染色体长臂区带亚带到区带 亚带...区域。目前在该区发现个与相关的候选基因,分别是运动神经元存活基因 ,、神经细胞凋亡抑制 蛋白基因,、基本转录因子 ,和。与该病关系最为密切的为运动神 经元存活基因,而其他的为修饰基因。基因有个拷贝,即和 ,一般认为为该病的主要致病基因,属调节基因,与疾病的 严重性呈反比。和高度同源,二者仅有个碱基的差别 研究认 为,约%的患者存在第和或第外显子的纯合缺失,或 转变为,因此检测基因第、外显子缺失成为诊断该病的主攻方 向。约%的患者是由基因突变引起的,如果对于临床症状比较典型, 而未能检 测出 、外显子的纯合缺失的患儿,应当考虑有基因突变的可能。 目前有多种方法用于的诊断,如聚合酶链一单链构象多态性分 析 , ,限制性片段长度多态性分析 天津医科大学硕士学位论文 ,.,变性高效液相色谱法 ? .,扩增阻滞突变系统,高分辨率的 溶解分析,荧光实时定量,多重连接依赖性探针扩增 ? ,等。其中限制性片段长度多态性 分析.为目前应用最广泛的一种,但是该法无法检测的杂合缺 失,亦不能检测、的拷贝数,因此无法区分正常人和携带者,而且 还可能存在因为酶切不完全、酶易失效和扩增时产生的异源双链 不能酶切产生 的假阴性及引物序列的点突变所致假阳性结果等问题嵋。 近年来亦有文献凹。?报道用荧光定量技术检测的拷贝数,以进 行杂合缺失或携带者筛查的目的。但是该方法程序复杂,检测成 本高, 结果分析难度大等原因而难以在临床上推广使用。变性高效液相色谱分析法 也可用于缺失的筛查方法【 。但是该法仅通过洗脱峰来判断是 否存在碱基差异的不同拷贝,仍需结合测序判断是否存在的缺失; 还未开发出现成的软件工具进行客观计算,峰型诊断较为困难;对于拷 贝数为的携带者,难以作出正确判断。 年?等发明了一项新的能用于检测基因缺失和重复的定量分 子诊断技术??多重连接依赖式探针扩增,它仅需少量的即可通 过变性、杂交、连接、扩增及毛细管电泳步骤,在一个反应管中对几十个 不同的靶基因进行检测和定量分析。在诊断患者及携带者上不仅能够精确 定量、,而且因其方法简单、耗资少、结果准确、高效等而备受推 尝【 不 。 另外还存在一类特殊的携带者,即“’’型。即一条染色体上有 个拷贝,而另一条染色体上基因缺失。这类携带者人群携带率为 %,生育过患儿的夫妇,其再发率为/。但是该携带者通过分析 其拷贝数为正常。因此该类携带者需要通过家系分析并结合其他的方法 予以综合分析,以提高诊断率。 本研究采用对临床个疑似患儿及其父母进行基因拷贝 数判定,并与.结果进行对比,对基因缺失、重复等情况进行评天津医科大学硕士学位论文 价。 天津医科大学硕士学位论文 研究目的、方法 本课题以例无亲缘关系的临床疑似核心家系为研究对象。对 基因外显子、通过.和方法分别进行检测,并对两种方法进 行比较,以评价两种方法的优缺点,为以后遗传咨询提供更加简便快捷准确的 方法。 本研究分别采用.和对基因进行基因诊断。 .采用盐析方法提取,保证质量满足后续实验的要求。 .设计引物扩增基因外显子、,%琼脂糖凝胶电泳观察扩增效果。 .分别采用、酶对外显子、酶切位点酶切小时分钟,%琼 脂糖凝胶电泳观察酶切效果,并进行结果判断分析。 .根据.结果,采用进行验证。 .按试剂盒要求对所研究样本进行变性,连接,杂交,反应,毛细管电泳 等反应。 .通过软件分析毛细管电泳结果,计算拷贝数并进行结果判断分 析。 .对比以上两种方法结果,进行数据统计分析。 兰垦:壁兰塑些坠茎里垒堑坚垒塑婴壅一 天津医科大学硕主堂垡笙奎 ?????????????????????????一。?? ?和基因诊断脊肌萎缩症的研究 、驯的分析 等建立,即通 目前广泛采用错配.法,该技术为 过反向错配引物,在差异碱基相邻处引入错配位点,从而将,区别 开。如和删在第号外显子存在碱基.的差异,根据这一差别在 反向引物’端第二个碱基上引入错配碱基,使其有意义链上碱基 变为, 从而在第外显子形成 酶切位点‘,因无该位点而 , 不能被酶切。因此,和第外显子正常或杂合产生 和三条带;如果纯合缺失则仅产生和两条带。和 在第外显子存在碱基.的差异,但恰在第号外显子这个位 点存在酶切位点‘,而第号外显子没有此酶切位点, 所以和第外显子正常或杂合产生,和三条带; 如果纯合缺失,则仅产生和两条带。 .对象和方法 ..研究对象 例无亲缘关系的临床疑似核心家系,先证者中男例,女例, 就诊年龄月岁。其父母共例表型均正常。另选择与患者无血缘关 系、 无遗传病家族史的健康体检者名作为正常对照组。 以上家系在分子诊断之前均接受我院遗传咨询,并签署知情同意 书。 ..实验材料 所用引物参考文献序列如下:’订 .’ ’’’.’ ’.’ 上述引物均由宝生物工程大连有限公司合成。 主要试剂 宝生物工程大连有限公司 宝生物工程大连有限公司天津医科大学硕士学位论文.和基 的研壅一 宝生物工程大连有限公司 眦出, 琼脂糖 宝生物工程大连有限公司 / 宝生物工程大连有限公司 限制性内切酶 宝生物工程大连有限公司 色 天津市北方天医化学试剂厂 异丙醇 天津市北方天医化学试剂厂 无水乙醇 宝生物工程大连有限公司 蛋白酶电泳缓冲液的配置: 碱 硼酸 . ./. 加水到,调值至. 液配置: . . . .、. 加水定容至,高压灭菌。 裂解液的配置: . . % 加水至,充分混匀,高压灭菌,保存。 溶血素的配置: . .. .“ 将上述化学试剂混合,加蒸馏水至,充分混匀,高压灭菌,?保存。 ..主要仪器 ?型低温高速离心机:美国贝克曼公司 。颠倒数次,使团块在酒糟审吝让 一~“墨心里少 心分钟,弃上清液:如此重争次:最后恳县收魁占。二二.”哪恤茼 将 管敞开室温放置,直至环到酒糟嗪骱市丛”一。旧月吸 加入.液,?水浴过,位高 。沿::“刀钾。 ?埔提取好的脯使用核酸定敏。谳氯熄并最终稀 焉;橥?一喜天津医科大堂堡主堂垡笙塞 兰垦:堕望塑塑生坠茎 里笙堑坚垒塑堑壅 ???。。。。。。。。?。。。。。。。’’?????????????????一 . 释至‖“,以便后续实验使用 .. 引物扩增 取消毒管标记,按下列顺序依次加入 反应体系 .“ . . ?上游引物 . 下游引物 . .“ 酶 反应体系,加入模板斗,混匀。 . 反应体系. .. 引物 .斗 . 酶 反应体系.,加入模板,混匀。 将混合物至于仪上扩增,设置条件为 ?预变性 ?变性 ?退火 ?延伸 共个循环 ?延伸 分钟 取出后保存。 .. 扩增产物的酶切 反应体系 酶切体系 “山 “ 产物 “ 反应体系,酶切小时分钟。 酶切体系 . 天津医科大学硕士学位论文。和基因诊断的研究“ . 产物 反应体系,酶切小时分钟。 .. 扩增及酶切产物鉴定 取 产物加“上样缓冲液含溴酚蓝,分子量标准采用的 ,%的琼脂糖凝胶电泳,,。用紫外线投射分析 仪观察产物的电泳条带,并用凝胶成像系统照相,判断检测结果。 取山酶切产物加?缓冲液含溴酚蓝,采用的 ,%琼脂糖凝胶电泳,,。紫外投射分析仪观察酶切产物条 带,凝胶成像系统照相,判断酶切结果。 .结果 .. 质量的测定 所有标本提取后在核酸定量仪 上测定,浓 度在.../之间,/比均在.?.之间,足以满足后续实 验的质量要求。 .. 产物鉴定 扩增产物进行%琼脂糖凝胶 对所有样本的外显子、 电泳检测,均可见清晰的片段大小约为和的条带图,。 誓.: 毡 ;扩增产物图 外显子 :分子量标准;、为携带者;为病人;为正常人鲞鲨垦型奎堂硕士学 位论文.和基因诊断的研究 外显子 扩增产物电泳图 :分子量标准;、为携带者;为病人;为正常人 图 外显子、 扩增产物图 .. 结果分析 正常个体外显子扩增产物经酶切后产物产生、 和三条带,外显子经酶切产生、和三条带。而 第外显子纯合缺失的患者产生、两条带条带, 因为分子量小,泳动速度快,有时会跑出胶外,外显子纯合缺失患 者只产生 和两条带。携带者由于其杂合缺失基因,即含一条正常等位 基因和一条缺失型等位基因,因此产生与正常人相同的条酶切 带。图 一 :: ?: 三. ; ?一 酶切产物电泳分析图 图常规 外显子 :分子量标准;、分别为携带者;、为病人。天津医科大学硕士学 位论文.和基因诊断的研究? 图常规 外显子 酶切产物电泳分析图 :分子量标准;、分别为病人;、分别为携带者;为正常人。 本研究例家系先证者经.方法检测, 例基因外显子 酶切后电泳显示和两条带,外显子酶切后显示为和 两条带,符合外显子纯合缺失;例仅显示外显子酶切后和 两条带,外显子酶切后产生,和三条带,符合外显子纯 合缺失;例未见外显子或纯合缺失,其带型与相对应的例父母和例 正常对照一致均为三条带。具体结果见表。 、的分析 , 多重连接依赖式探针扩增其原理是通过探针设计、探针与变性标本的杂交、探针的连接、 扩增及毛细管电泳来达到基因诊断的目的。 具体反应可分为三部分:、针对每一待测的靶序列均有一对探针, 分长短两段。短探针包括人工合成的位于其’端与靶序列完全互补的杂交序列 .和位于其’末端的共同序列,该共同序列与标记的引物 相同。长探针由噬菌体衍生而来,包括位于其’端并与靶序列完全互补的 杂交序列.,位于其’末端的共同序列和位于两序列之间的长度 特异性的填充片段.,该共同序列与未标记的引物互补。该填充天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 片段长度各异,从而使连接后的探针长度不同,其扩增片段亦不相同, 一般在.之间。一般相邻两产物的长度差,因此可同时检查基因 组多达种不同靶基因。、将设计好的探针与标本中含有靶基因的特定 区域杂交,形成探针.复合物。加入连接酶将长短探针连接。如果待测核苷 酸中含有靶基因,且靶序列完整,则两个探针与待测核苷酸互补良好,长短探 针并可连接成一条完整的核酸单链;反之,如果靶基因不完整、或缺失,则探 针的序列与靶序列不能完全互补,使连接反应无法进行。、针对连接完整的 探针进行扩增、毛细管电泳。如下图。 ,嘲胂州巳 『. ,,嘣??柏乜 : 仟 转虻 瞻 ‖一 ? 重 舯鲥 ;.矗:. ? . .和基因诊断的研究 天津医科大学硕士学位论文 图 反应原理 表示长探针,表示短探针 .对象和方法 ..研究对象 同.. ..实验材料 ? 荷兰.公司 毛细管电泳内标 美国公司 去离子甲酰胺 美国公司 美国公司 其他主要试剂同.. ..主要仪器 毛细管电泳仪:美国公司 热循环仪:美国公司 其他主要仪器同.. ..血液基因组提取 同.. .。 反应 根据试剂盒要求所有的反应均在热循环仪上进行。具体 操作过程如下: ,加入 补水至 变性用稀释的/的基因组 .的管中。。变性,?维持。 与 探针杂交在反应温度?时加入探针混合液 ,?杂 于室温下充分混匀。。 . . 交小时,后仪降温至。。 探针连接反应 当反应温度稳定在。时加入 一连接酶混合 液 一后?保持。 一进行连接反应。继续。反应,反应 斗 于新的管中加入 天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 和 连接产物,充分混匀后备用。当反应温度至 。将上述管放入仪,。维持同时加入提前准备好的 聚合酶混合液 ?斗.. . ,.?保存,充分 , ,。 ,共反应 混匀,立即进行反应: 个循环,后?延伸,?保持。 ,加入去离子甲酰胺和内标 毛细管电泳取扩增产物 共 混合后,加样于孔测序板,。变性后经 型测序仪进行毛细管电泳胶,观察扩增 所得产物电泳后峰型图,用软件计算产物峰面积, 软件进行数据分析。 根据说明书的要求进行第、外显子的拷贝数分析。 ..统计学方法计数资料采用统计软件 .进行卡方检验,值 .判断为有统计学意义。 .结果 .. 质量测定 同.. ..毛细管电泳结果 其中代表外显子,代表外显子;代表 外显子,代表外显子。见图?。 天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 . . .. . . . . . ... . 图正常毛细管电泳图 纵坐标表示探针的信号,横坐标代表大小不同的扩增片段位置 . . . . . . .四 . 。 . .. 图 外显子、联合缺失毛细管电泳图 天津医科大学硕士学位论文和基因诊断的研究 . . ... . . . . . . . . 图 外显子缺失毛细管电泳图 .. 数据分析 软件收集数据,...提供的软 件进行数据分析。 样本中每个扩增产物峰的相对峰面积为该峰的绝对峰面积 与该样本中所有参考探针扩增产物的绝对峰面积总和之比。根据 试剂盒说明书 检测比值...为拷贝,~.之间为拷贝数,~.之间为拷贝,~ .为拷贝,.为拷贝。正常人为拷贝或以上,纯合缺失者拷 贝,杂合缺失为拷贝。见图.。 天津医科大学硕士学位论文?和基因诊断的研究 : . 。毒 . . ?? ? 一 .:: 一六.二 邕.;:?.“ :??., ~.三,?一 。嚣,嚣 .~.毫 ” ~一曾~?々 . 女范晓删 .蜘侧”显子、和删外显子、拷贝数各为 】. . 【 . ?.?“ : :》” 图 未见缺失 外显子、各拷贝为,外显子、各拷贝数为 】 .暑 ?。 . . , 图 未见缺失 外显子、各拷贝数为,外显子、拷贝数均为 图 纯合缺失丕津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 外显子、拷贝各为,外显子、拷贝各为。 . . . 。 三 稆 咄. .苫? ?工叩鬲 王?寸?? 兰?寸??曲 苫们凶 苫价卜。击 《日竹小 叱击帅。卜.帅口 卜?《叱卜??曲 .王?卜 避王价叶。卜。小 卜 链芏们竹。卜。曲 ““卜。寸。卜。小。 一工:上亨。卜。晴 一卜。寸。卜。访。 ? 图 纯合缺失 外显子、拷贝数均为;外显子、拷贝数各为 :。 ?: 一 ? ,一 ;? 滢 一 。 :膏” 二 ; ;?女 ::; ? 二 .霭 ; 一 薏懑 溷 薏 图 纯合缺失 天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 外显子、拷贝数均为,外显子、拷贝数各为 . 二 。 ?『嘲 囊 苗 世 蓦 ‘?『 誊 一 一 一 一 . 。: 瓣。 ? 器一 ;. .蕾 :;?』 ? 溷 图 纯合缺失 外显子、拷贝数均为,外显子、拷贝数各为 垂望匡料姆硕士学位论文?和基因诊断的研究 图 外显子、杂合缺失 外显子、拷贝数各为,外显子、拷贝数各为 图 外显子纯合缺失 外显子拷贝数为,外显子拷贝数为;外显子拷贝为,外显子拷贝 为 .. 结果 经.方法判断例第号外显子纯合缺失患儿的 、拷贝数均为,与酶切方法判断一致;例 纯合缺失家系患 儿其外显子拷贝数为,与酶切方法一致,但他们的外显子拷贝数 为;剩 余例疑似病例中例患儿第家系外显子、各为拷贝,符 合杂合缺失携带者,其余例外显子、拷贝数均为,未见纯合或杂 合缺失。见表。父亲 删杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 .肼,杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 办杂合缺失携带者 母亲 删杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 删杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 删杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 删杂合缺失携带者 母亲 删杂合缺失携带者先证者纯合缺失患者父亲 杂合缺失携带者 天津医科大学硕士学位论文 .和基因诊断的研究母亲 .铋?,杂 合缺失携带者 ?先证者 纯合缺失患者 父亲 删杂合缺失携带者 母亲杂合缺失携带者 先证者正常 正常 父亲 母亲 正常 纯合缺失患者 先证者 父亲 删杂合缺失携带者 母亲 .?杂合缺失携带者 纯合缺失患者 先证者 父亲 .蜘童?杂合缺失携带者母亲 杂合缺失携带者 先证者纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者母亲 删杂合缺失携带者正常 先证者 ,正常 父亲 母亲正常 纯合缺失患者 先证者 杂合缺失携带者 父亲 携带者 母亲 纯合缺失患者 先证者 杂合缺失携带者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 纯合缺失患者 先证者 删杂合缺失携带者 父亲 携带者 母亲 纯合缺失患者 先证者 杂合缺失携带者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 正常 】先证者 正常 父亲正常 母亲正常 先证者正常 父亲,正常 母亲 正常 先证者 正常父亲 .互杂合缺失携带者 母亲 先证者杂。顷?伤,巾?者 父亲正常 母亲 杂合缺失携带者先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲 杂合缺失携带者 先证者 纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲杂合缺失携带者先证者纯合缺失患者 父亲 杂合缺失携带者 母亲杂合缺失携带者 一 例外显子纯合缺失家系中有例其父母的外显子、 各为拷贝,提示其双亲均为外显子部分缺失携带者;例患儿双 亲一方是外显子和拷贝数各为的携带者,而另一方中例第、 家系其外显子、拷贝数各为,例第家系外显子拷贝 数为和外显子拷贝为,这例被推断为“”型携带者。例单纯 外显子纯合缺失家系第 、家系其父母一方为外显子和单拷贝携 带者,另一方为外显子拷贝数为和外显子拷贝数为的携带者。例 第 家系因 和各为单拷贝而被判断为携带者的患儿,其父母 和一方为正常拷贝,一方为外显子、各单拷贝携带者。剩余 例未见纯合或杂合缺失家系中,例双方和例单方父母共人,其 外显子和各为正常的拷贝,人第家系母亲外显子和 各为拷贝,人第家系母亲外显子和为各拷贝的携带者。 。 详见下图 天津医科大学硕士学位论文?和基因诊断的研究 第家系父亲为“”型携带者 第家系母亲为“”型携带者 ? 窈 母亲为“”型携带者 田 ? 田 田田 新删外显子缺失型患儿 ? 即卜靴即卜旬靴即卜 天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 第家系 母亲和患儿为外显子杂合缺失携带者 田 田一 图第、、、、 、、家系图谱 ~一 外显子 注: ?外显子 外显子外显子 外显子 根据实验结果共确诊例为病人,回顾分析临床表现,发病年龄, 疾病进展等,例中型例,型例,?型例。见表。另外共检出携 带者例含例“正常对照”,正常者例含例正常对照。 ... 结果 例外显子/纯合缺失的患者中,有例拷贝数为, 例拷贝数为,例拷贝数为,例拷贝数为。例携带者中,有人拷贝 数为,人拷贝数为,人拷贝数为,人为拷贝。有例患儿 例判 和例携带者其外显子、的拷贝数不等,见表、。 断为正常人的拷贝数见下表。各拷贝数小于个拷贝的归入 拷贝组,大于个拷贝的归入拷贝组的频率分布在病人组与携带者 组 .、病人组与正常人组.中.,而在携带者与正常 人组,..。 天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 表 拷贝数型 型 型 携带者正常人 讨论 是一种常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病,目前尚没有有效的 治疗方法【,因此先证者的基因检查和群体中携带者的筛查工作对于诊断遗传咨 询指导生育具有重要的作用。以往的临床诊断主要依赖肌肉活检和肌电图, 但是这些方法不仅有创,更重要的是对小婴儿有可能会带来不确定的结果引。 目前分子诊断对本病具有确诊价值。 . 的致病基因 年由法国研究学者 基因被认为是的主要致病基因, 等发现。该基因定位于...,全长约,它的两个同源拷贝 、高度同源,仅有个碱基的差别【。研究认为为致病基因, 属调节基因,与疾病的严重性呈反比。统计显示约%的患者存在 第和或第外显子的纯合缺失和转变为,而约%的患者 因 是由基因突变引起。迄今为止,在中国患者中杂合缺失很少有报道 此,对基因第、外显子缺失检测成为该病的主要检测手段,而、 基因拷贝数的分析对于遗传咨询和治疗都有重要的临床价值,为此建立稳 定、可靠的基因诊断技术尤为重要。 . 技术应用 。等建立的错配.技术,其原理是在差异碱基相邻 处引入错配位点,将、区别开,以鉴别对基因有无缺失。本天津医科大学硕士学位论文?和基因诊断的研究 研究采用该方法对例家系先证者进行分析,结果判断例为外显子纯 合缺失,例外显子纯合缺失,例未见纯合缺失者的带型与相对应的例 父母和例正常对照一致。 国内外多篇文献报道的外显子、联合缺失率各不相同,但是都在 %以上?屺?。本文显示例患儿中例外显子联合缺失,缺失率为.%, 与报道相符。另外例未见缺失的患儿,回顾分析患儿临床表现、疾病发展及 肌电图等检查排除了诊断,其具体情况尚有待于后续进一步研究。 尽管.对检测纯合缺失病人,其方法简单、快捷、特异、准确, 但无法检测的杂合缺失,亦不能检测、的拷贝数,因此无法 区分正常人和携带者,而且还可能存在因为酶切不完全、酶易失效和扩增时产 生的异源双链不能酶切产生的假阴性及引物序列的点突变所致假阳性结果等问 题另外,还存在如基因内转化,基因内突变,及其他部位缺失等现象, 这都将会增加诊断的困难,造成误诊眨?。因此为了能够进一步提高诊断的准确 性,需要结合其他方法对基因进行综合分析。 . 技术应用分析 多重连接依赖式探针扩增 , 是一项新的能用于检测基因缺失和重复的定量分子诊断技术,由 ?等于年发明。其原理是通过特异性探针与靶基因杂交、探针连接、 扩增、毛细管电泳等步骤,定量分析、拷贝数。本研究通过 技术对例疑似的病例中共检出例外显子、纯合缺 失和例仅外显子纯合缺失的患者,与.方法检测结果一致。但 方法在上述例外显子纯合缺失的先证者家族中发现例患者的父母为 外显子、杂合缺失,例患者的双亲一方为外显子、杂合缺失,另一方有 人外显子、各拷贝,人外显子为拷贝,外显子为拷贝,被判 断为“”型携带者。例仅外显子缺失的先证者家系中父母一方为 外显子、杂合缺失携带者,另一方为外显子杂合缺失而外显子不缺失的 携带者。 另外例经.检测未见缺失的患儿中,例患儿家系及父 母检测 、外显子均为拷贝,基因诊断未见异常,临床资料不 详,但该患儿其父母双方非近亲结婚,拷贝数均正常,考虑同时为突变携 带者的机率很低,所以我们推测该患儿可能为其他病因所致。例家系 天津医科大学硕士学位论文.和基因诊断的研究 患儿母亲 、拷贝数为,判断为杂合缺失携带者,患儿及父 亲拷贝数均为。由临床资料可知,该患儿月起病,走路需扶持,肌电图显 示为肌源性损伤,结合基因检查排除诊断。例家系患儿及母亲 、各为拷贝,判断为杂合缺失携带者,其父亲拷贝数为。复习 既往资料发现该患儿发病年龄较晚,岁时走路需经扶,其他资料 缺失,根据该 患儿的临床症状推测若为患者,可能其父亲的两条染色体上有一条 基因发生点突变,而患儿正好遗传了该突变的染色体,又可能因该突变位点的 性质而使临床症状比较轻,但是否存在点突变及突变的性质尚有待于通过测序 等方法验证。 研究表明,约%的患者存在基因的点突变。迄今为止共有约 种突变被发现 的新生突变发生率约为% 而大部分都是父源 性呓 呓指出,病情轻微的病人多与无义突变相关,而严重的型患者 多与移码突变有关系。曾健等眨”建立了包括利用、及克隆一 测序技术对先证者基因的拷贝数分析和点突变鉴定,以及针对点突变区域 的基因组.直接测序法的一套完整的点突变检测系统,相信这对于遗传 咨询是必要的。 本研究有例及其父母人检出显示外显子、拷贝数各为 ,另一母亲为拷贝均判断为正常。回顾分析患儿临床表现、疾病发展及肌电 图等检查排除了诊断。正常人的拷贝数一般为,研究发现约有% 等他们曾发现了一例拷贝数 的正常人群的拷贝数为 为的正常人。 .“”现象 本研究通过拷贝数及遗传分析推断出例“”型携带者。“” 型携带者,即基因的个拷贝均存在于一条染色体上,如第家系父亲 和第家系母亲外显子、各拷贝以及家系母亲外显子的个 拷贝,而另一条染色体为拷贝,患儿分别遗传了他们的一条无拷贝的染色体。 年等?应用体细胞杂交单体技术分离出人染色体单体,再应用剂量 分析法检测出染色体单体上拷贝数,确定例“”型个体。“”基因型 的携带者在正常群体中发生率约为%?,生育过的夫妇再次生育时 再发率为/,因此对于此类携带者的检出对遗传咨询很重要。传统的. 仅能用于基因纯合缺失检测,而不能区分正常纯合子、杂合缺失携带者天津医科大学硕士学位论文?和基因诊断的研究 和“”型携带者。虽然该方法通过先证者家系推断出“”型携带者,但 不能鉴别正常人群的“”者。对此例“”型携带者,其基因排列 的实 际情况尚有待于通过基因克隆等方法进一步研究确认。 . 与表型 基因被证实与疾病的表型及严重程度有关。文献报道所有 病人都至少有一个拷贝,一般有.个 对于大多数患者来 说,型患者一般有.个拷贝,型患者有个拷贝,? 型患者有.个拷贝且拷贝数越高,发病年龄亦相对晚。 报道例缺失且拷贝数为的患者,都未见明显临床症状。 但本研究中并没有发现此种规律,在例患儿中,我们共发现了例 拷贝数为的患儿,其中型例,?型例,?型例,均具有明显的临床 症状,其中有例在岁之内发病;例患儿拷贝数为,其中型例, 型例,且例型患儿均在月之内发病。本研究表显示例患 者不论分型,其拷贝数多集中于、、拷贝,占.%/。但因 缺少病情进展等相关临床资料的支持,不足以对其远期情况进行 评价。本研究 例携带者中,拷贝数多集中于、拷贝,正常人其拷贝数却集 中于、拷贝。仅发现例家系、的父亲携带者和例正常人其 拷贝数为,而眨”曾观察的例携带者中,未发现为拷贝者。 这可能与样本大小、或不同人群有关。在正常人群中,大约有% 的人 拷贝数为 在本研究中亦发现一例拷贝数为的正常人。本研究 拷贝数频率分布的统计显示病人组与携带者组,和病人组与正常人组有显著差 异.,.,而携带者与正常人组差异无统计学意义., .。 为常见的儿童致死性疾病,人群致病基因携带频率约为/?。在本 研究中的例对照中,就有一例为携带者。携带者出现频率之高,应当引 起我们的足够重视。一般来说一个完整的携带者筛查包括定量分析,连锁 分析和遗传风险评估。当然种族及地区间的差异也是评估携带者的一 个重要因素。目前该病尚没有有效的根治办法,做好携带者的筛查及遗传咨 询,避免患儿的出生,对于家庭和社会都是有利的。 . 的应用前景 技术以其操作简便,高效等优势,解决了常规.法无法检 天津医科大学硕士学位论文?和基因诊断的研究 测杂合缺失,以及测定基因拷贝数问题,而且检测到“”型和其 他类型携带者,是.所不能发现的。它仅需要少量的模板就能快 速准确的定量、,还有助于区分表型叫,筛查携带者,为遗传咨询 提供可靠的信息。本研究仅分析了基因,此外神经元凋亡抑制蛋白基因 、基本转录因子基因基因、等亦与该病有一定的关联口 ,试剂盒也能同时对进行检测,相信对的发病机制的研究会有更 过的帮助。 但也有其局限性,它无法检测正常人群中的“”型携带者,亦无法 检测基因内突变因此仍需要结合其他的方法予以综合分析,以提高 诊断率。当探针杂交部位发生突变时,也有可能妨碍探针与靶序列的杂交,出 现片段缺失的假阳性结果等。但是相信随着生物医学的不断发展,亦将日 益完善,而受到越来越多人的重视,其应用范围也将会日益广泛。 .展望 为不可治愈性疾病,因此做好产前诊断尤为重要。而检查外显 子的纯合缺失成为产前诊断的首选【 。分为有创性检查和非有创性检查。 羊膜腔穿刺和脐带穿刺虽然成功率很高,但是危险性也很高,对孕妇及胎儿不 利,而且很容易导致流产,因此现在更倾向于产前无创诊断。 采用从母体外周血液中的胎儿细胞或者母体血浆中或血清中胎儿进行 产前诊断为非创伤性产前诊断开辟了途径。等,使用从母亲外 周血分离出来的独立的胎儿细胞,成功的对例胎儿施行产前诊断,这对胎儿 没有一点危险,但怀孕的胎儿细胞是否会残存于母体血中仍是问题。 ,,结合体外受精技 产前植入诊断 术,在胚胎发育到~个细胞时应用显微操作,对单个细胞进行遗传学或 分析,将疾病控制在胚胎发育的早期阶段。也是一个有前途的发展方向。 通过检测携带者并对高危夫妇进行生育指导,配合产前诊断,就可以 从第一胎起防止重型患儿出生,有效降低的发病率,对提高我国人口素 质有重要意义。天津医科大学硕士学位论文 结论 结论 、.方法简便,快速,特异性强,较为敏感。但是仅能用于基 因纯合缺失的检测,无法检测基因突变患者及杂合缺失的携带者,而 且还可能因为酶失效或酶切不全等而造成假阴性结果而容易漏诊和误诊。 、本文例疑似的病例中共检出例外显子、纯合缺失和 例仅外显子纯合缺失的患者,.与方法检测结果一 致。 、利用不仅能够检测出的纯合缺失,而且还能够准确的筛查出携 带者。个家系及例对照中,通过共发现例携带者。 、“”型携带者在人群中的携带率约为%,生育过的夫妇再次生育时 再发率为/,因此对于此类携带者的检出对遗传咨询很重要。通过 方法在家系中发现例“”型携带者。 、在本研究中显示拷贝数在患者中以、为主、携带者以、 为主、正常人以、多见,其各拷贝数的频率分布在病人组与携带者组、 病人组与正常人组差异有统计学意义,而在携带者与正常人组差异无统计学 意义。 、本研究未发现拷贝数与疾病的严重性之间明确的反比的关系。 、与.相比,技术可准确检测致病基因的缺失、重复突 变等。不仅具有高通量检测优势,而且还可以对基因进行定量分析, 辨别出基因的杂合缺失状态,筛查携带者。而且它更加简单、准确、 高效,还能区分表型,是一种高效的遗传病基因诊断方法。相信以 后会在临 床上广泛应用。