葛根总黄酮对运动大鼠骨四头肌转铁蛋白受体基因表达的影响

葛根总黄酮对运动大鼠骨四头肌转铁蛋白受体基因表达的影响 葛根总黄酮对运动大鼠骨四头肌转铁蛋白 受体基因表达的影响 4122008,Vo1.29,No.05良晶科学※营养卫生 葛根总黄酮对运动大鼠骨四头肌转铁蛋白受体 基因表达的影响 唐量1,熊正英1,张英起2 (1.陕西师范大学运动生物学研究所,陕西西安710062;2.第四军医大学生物技术中心,陕西西安71OO33) 摘要:目的:通过研究葛根总黄酮对运动大鼠骨四头肌转铁蛋白受体(transferrinreceptor,TfR)基因表达的影 响,葛根总黄酮抗疲劳的分子生物学机制.方法:将SD大鼠随机分为三组:安静对照组(A),运动组(B)和 服药组(C).B组和C组进行7周的大强度耐力跑台训练,随后抽提各组大鼠骨四头肌TfRmRNA,与Cy3和Cy5 标记的cDNA混合探针杂交,通过芯片扫描仪对其荧光强度进行扫描,并用计算机对结果进行分析.结果:基因 表达谱显示,与安静组比较,运动组大鼠骨四头肌TfR基因表达下调;与运动组比较,服药组大鼠骨四头肌TfR 基因表达显着上调.结论:葛根总黄酮对运动大鼠骨四头肌TfR基因表达有明显上调作用,而TfR基因表达上升 与运动中铁的转运密切相关,可作为易感基因在疲劳的分子生物学机制和抗疲劳功能食品筛选中进一步研究. 关键词:基因芯片;葛根总黄酮;TfR;运动训练;骨四头肌;大鼠 EffectsofPuerariaFlavonidonExpressionofTransferrinReceptorinQuadricepsofExercise -trainingRats TANGLiang,XIONGZheng—ying,ZHANGYing—qi (1.InstituteofSportsBiology,ShaanxiNormalUniversity,Xi'all710062,China; 2.CenterofBiotechnology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'all710033,China) Abstract:Objective:BygenechipcDNAmicroarray,thebiomolecularmechanismofanti— fatigueofPuerariaflavonidwas studiedinthequadricepsoftheexercise— trainingrats.Methods:SDratswererandomlydividedintothreegroups:normalrest group(A),exercise-traininggroup(B)andadministered— druggroup(C).BgroupandCgroupratsweretrainedwithhighintensity 7weeksbytreadmil1.ThetotalRNAswereisolatedfromthequadricepstissue,andwerepurifiedtomRNAsbyoligotex.The purifiedmRNAwerereverselytranscribedtocDNAwithhybridizationprobeslabeledbyfluorescent-dUTP.Thegenechipwas scannedforthefluorescentsignalsandshoweddifferencesbythecomputeranalysis.Results:TheTfRgeneWasdown-regulated expressioninthequadricepsofexercise— trainingratscomparedwithofrestratsandobviouslyup—regulatedexpressioninthe quadricepsofadministered-drugratscomparedwimofexercise— trainingrat.Conclusion:TfRgeneexpressioninquadricepsof thetrainingratsisregulatedbyPuerariaflavonid,anditsexpressionhasaneffectonfatigueandplaysaroleinthestudyoffatigue mechanismandscreeninganti—fatiguefunctionalfoodasasensitivegene. Keywords:genechip;Puerariaflavonid;TfR;exercisetraining;quadriceps;rat 中图分类号:G804.7文献标识码:A文章编号:1002—6630(2008)05.0412.04 运动性贫血是大强度运动训练中影响身体机能的重 要因素,与铁代谢的不稳定密切相关,缺铁可造成运 动性贫血.运铁蛋白受体(transferrinreceptor,Tin)在 铁的吸收中起着十分重要的作用,在铁新陈代谢过程中 关键且必不可少,其表达量与铁蛋白的结合能力直接影 响机体的铁状况.因此,关于TfR影响因素的研究就 显得十分必要.本实验应用具有高通量,并行性和快 速,准确等优点的基因芯片技术,首次研究葛根总黄 酮对大强度耐力训练大鼠骨四头肌TfR基因表达的影 响,以探讨葛根总黄酮抗运动性疲劳的分子生物学机 制,并对基因芯片技术在运动性疲劳机制研究及抗疲劳 功能食品筛选中的应用进行探索. 收稿日期:2007—07—18 作者简介:唐量(1974一),男,博士,研究方向为运动性疲劳的分子生物学机制与抗 疲劳药物筛选. E-mail:fl531@snnu.edu.ca ※营养卫生良晶科学2008,Vo1.29,No.05413 1与方法 1.1材料与对象 材料为葛根总黄酮,按冷浸法提取…:称取野葛根 100g,分别取70%乙醇,95%乙醇和甲醇各500ml,浸 泡24h以上,过滤,回收乙醇,甲醇,药液减压浓 缩至干,得到葛根总黄酮的黄褐色粉末.再用蒸馏水 配置成悬浮液,使用药品浓度为150mg/ml. 实验对象选用健康雄性3月龄SD大鼠16只,体重 250~300g(由陕西中医研究所实验动物中心提供).适应 性喂养1周后进行实验. 1_2动物模型_2l 大鼠随机分为三组:安静对照组(安静组),大强度 耐力训练组(运动组)和服药+大强度耐力训练组(运动服 药组).饲养环境保持高度清洁,自然光照,自由饮水 和进食,动物室温23,28?,相对湿度50%,65%.安 静组动物笼中静养,运动组和服药组动物进行7周的跑 台训练(坡度为0),先进行5周适应性训练,然后进行 2周的大强度耐力训练.适应性训练每周5d,每次 20min,跑速每周递增,分别为15,22,27,31, 35m/min,共训练5周;大强度训练每周7d,每次 30min,跑速为35m/min,共训练2周.在训练的同时, 服药组动物每天灌服1m1配置的葛根总黄酮,剂量以 25mg/kg体重计,安静组和运动组每天灌服相同体积的 蒸馏水. 1.3取材 第8周第1d将实验大鼠轻度麻醉后,立即断髓处 死,取大鼠骨四头肌放入RNase.free的9%生理盐水中 漂洗样本以除去血渍和污物.滤纸吸干之后,液氮冷 冻保存,以备总RNA抽提.所有的取材器械及冷冻 保存管均用高压灭菌消毒,取材器械用DEPC水浸泡 过夜. 1.4试剂与仪器 dNTPPromega公司;SuperScriptII逆转录酶及工 作液GibcoBRL公司;Taq酶上海生物工程服务公 司;Cy3.dUTP,Cy5.dUTPAmershamPhamacia公 司;QligotexmRNAMidiKitQiagen公司. 芯片杂交密封舱,硅烷化芯片TeleChem公司, CartesianPixsys7500型点样仪Cartesian公司;Gene Pix4000B型扫描仪Axon(USA)公司;PTC.225型PCR 仪MJResearch公司;RobbinsScientificModel1000型 杂交箱RobbinsScientific公司;UVPCL.1000型紫外交 联仪uVP公司. 1.5总RNA提取和检测 采用改良酚氯仿一步法抽提总RNAt3】.将超低温保 存的样品液氮环境下碾磨成粉末状,加入适量TRIzol试 剂在组织匀浆粉碎机上进行匀浆,然后离心10min(4?, 12000×g).加入溶液D和1%的巯基乙醇,匀浆离心 后取上清液分别经氯仿,异丙醇抽提后,再分别用5ml 和10ml75%乙醇洗涤两次,离心后干燥沉淀5min,加 入RNase.free的Milli.Q水溶解沉淀后,LiC1沉淀法纯化 后紫外分析及电泳检测提取到的总RNA质量. 1.6基因芯片的制备 所用BiostarR.20s芯片由博星基因芯片有限公司提 供,芯片上包括控制系统和有效基因,其中控制系统 包括阴性对照16个,空白点19个,内参基因20个, 其余皆为有效基因.用通用引物进行PCR扩增,PCR 产物长度为1000~3000bp(少数例外),PCR反应及产物 纯化用标准方法进行…,通过琼脂糖电泳监控PCR质 量.靶基因以0.5g/L溶解于3倍SSC溶液中,用Cartesian 公司的Cartesian7500点样仪及Telechem公司的硅烷化玻 片进行点样,点样后玻片进行水合2h,室温干燥0.5h, uV交连(能量值设定65rrd/cm),再分别用0.2%SDS,水 及0.2%硼氢化钠溶液处理10min,凉干备用. 1.7探针标记与杂交 参照Schena等的方法[5],在501的逆转录反应体 系中加入50,100lag的mRNA,进行逆转录标记,用 Cy3.dUTP标记正常安静对照组骨四头肌mRNA,用Cv5. dUTP标记运动组骨四头肌mRNA;再用Cy3.dUTP标记 运动组骨四头肌mRNA,用Cy5.dUTP标记服药组骨四 头肌mRNA.乙醇沉淀后,将两组Cy3.dUTP和Cy5. dUTP标记的探针分别混合,并溶解于2015×SSC +0.2%SDS杂交液中.将芯片和杂交探针分别经95?变 性后置于杂交舱内并加入混合探针,杂交密封舱密闭, 60?恒温杂交16h,依次用2×SSC+0.2%SDS,0.1% ×SSC+0.2%SDS,0.1%×SSC洗涤10min,室温晾干 待用. 1.8cDNA芯片的扫描检测与分析 采用GenePix4000B型扫描仪进行芯片扫描,用 ImaGene30软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比 值,用预先选定的内参照基因(管家基因)对原始提取信 号进行均衡和修正.先将所有数据的前景值与背景值相 减,得出Cy3,Cy5标记的强度值;将所有小于200的 强度值以200取代.根据总数为12的有效基因(select值 =1,Cy3,Cy5值两者皆大于200,或者其一大于800, Ri=Cy5/Cy3在0.1,10之间)Cy5/Cy3的Ratio的自然对数 值lnRi等于ln(Cy5/Cy3),以Ri值在0.1,10之间的有 效基因作为均一化依据,算出这些基因Ratio自然对数 平均值1n(Ri),算出Ri的平均值1n(R')作为均一化 (normalization)系数.本实验的均一化系数R'为0.944 和1.101.将所有数据项的Cy3标记强度乘以均一化系 数,得出调整后的Cy3.将所有Cy3小于200的强度值 4142008,VoL29,No.05良品科学※营养卫生 以200取代.算出所有基因调整后的Ratio值(Cy5/Cy3). 筛选出Ratio大于2或小于0.5的数据判断基因表达差异. 2结果与分析 2.1总mRNA提取结果 所提总RNA的光密度值结果显示,安静组,运动组 和运动服药组骨四头肌组织总0I)26II)值在1.8~2.0 之间,70?保温实验合格.RNA浓度0』g/1)以OD26o ×40×稀释倍数计算(总体积为301),各组所提总RNA 的纯度,浓度符合后续分子生物学实验要求(见表1). 琼脂糖凝胶电泳结果表明,各组所提总RNA的 表1骨骼肌组织总RNA的提取结果 Table1ExtractingtotalRNAfromskeletalmuscletissues 28S,18S和5S三条带清晰可见,结构基本完整,无 DNA或蛋白质的污染,表明抽提到较高纯度的总RNA (见图1). A-,A:为安静组大鼠骨四头肌:B-,Bz为运动组大鼠骨四头肌;C, C:为运动服药组大鼠骨四头肌. 图1RNA1%琼脂糖凝胶电泳 Fig.1ResultsofRNAon1%agarosegelelectrophoresis 2.2芯片杂交和筛选结果 大鼠骨四头肌基因表达谱的散点图以Cy3荧光强度 值为x轴,以Cy5荧光强度值为Y轴建立坐标,每一 个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号.数据点Y 值与x值的比值在0.5至2.0之间,基本属非差异表达; 数据点Y值与x值的比值在0.5到2.0范围之外(该点很可 能属于差异表达).无显着差异表达的基因分布于x等 于Y直线上或靠近该直线的周围,有显着性表达差异的 基因分布在直线的上,下两侧,上方为表达上调的基 因,下方为表达下调的基因(见图2和图3). 4000O > S30000 想 蓑20000 U10000 O 01O0o02O0oO3O0o040000 Cy3荧光强度(AV) 图2骨四头肌(对照组/运动组)基因表达散点图 Fig.2Scatterplotsofgenesexpressionpattemonquadriceps ? 0100002O0OO300004000O Cy3荧光强度(A,,) 图3骨四头肌(运动组/服药组)基因表达散点图 Fig.3Scatterplotsofgenesexpmssionpattemonquadriceps 图2显示,与安静对照组比较,大强度耐力训练 组大鼠骨四头肌TfR基因下调表达;图3显示,与运动 组比较,服药组大鼠骨四头肌TfR基因显着上调表达, 表明葛根总黄酮可抑制大强度运动训练导致的大鼠骨四 头肌Tt'R基因下调表达趋势,明显促进大鼠骨四头肌TfR 基因的上调表达.各组具体的Cy5,Cy3标记的强度值 及Ratio(Cy5/Cy3)值见表2. 3讨论 TfR是一种跨膜糖蛋白,与转铁蛋白相互作用介导 铁吸收,同时铁含量影响体内TfR含量及活性.TfR反 映了细胞内可利用铁量,是评价功能性铁缺乏的敏感指 标.在TfR的翻译和转录过程中影响铁,运铁蛋白, 铁应答元件(IRE)与铁调节蛋I~(IRP)的众多因素,如不同 的组织及生理环境均可间接的影响TfR的表达[7-Sl.而组 表2葛根总黄酮对大强度运动训练大鼠骨四头肌TfR基因表达的影响 Table2EffectsofPuemriaflavonidonTfRexpressioninquadricepsofexercise-trainingrats o 4321 ※营养卫生食品科学200&Vo1.29,No.05415 织细胞铁含量是影响转铁蛋白mRNA翻译和TfRmRNA 稳定的关键因素. 大强度运动训练大鼠与安静对照组比较,骨四头肌 TfR基因表达明显下调,不利于铁向细胞内转运;而灌 服葛根总黄酮使大强度运动训练大鼠骨四头肌TfR基因 表达显着上调,缓冲细胞内低铁状态,有利于铁向细 胞内转运,是服药组大鼠对大强度运动训练的一种适应 性表现.分析机制可能与葛根总黄酮作为一种天然的抗 氧化剂,清除体外或大强度运动中体内产生的过量自由 基有关【lo.0"].当机体铁缺乏时,IRE与IRP亲和力提高, TfRmRNA3'端的IRE与IRP结合,抑制TfRmRNA的 降解,增加稳定性,使TfR表达升高,增加细胞对铁 的摄取…].研究表明【l5],氧自由基可抑制IRP的表达. 大强度运动训练大鼠骨四头肌TfR基因表达下调可能与 运动中过量自由基对IRP的表达抑制所致.而服药组大 鼠大强度运动训练后骨四头肌TfR基因表达上调,可能 与葛根总黄酮清除骨四头肌中过量自由基,解除自由基 对IRP的抑制作用,干预自由基介导的IRP和TfR基因 表达调控途径,稳定IRP和TfRmRNA3'端IRE的结 合,进而增加TfRmRNA的稳定性和表达有关.本实 验证实了TfR基因与运动密切相关,在疲劳的分子生物 学机制和抗疲劳功能食品筛选研究中可作为易感基因供参 考,有关作用的详细分子生物学机制尚待进一步研究. 参考文献: [1]郭建平,孙其荣,周全.葛根总黄酮不同提取工艺的探讨[J】.中草药,[15] 1995,26(10):522-525. 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