合成SSBLa多肽与DNA共同免疫动物导致DNA抗体产生抑制

合成SSBLa多肽与DNA共同免疫动物导致DNA抗体产生抑制 【摘要】目的观察SSB抗原与DNA抗原共同免疫动物时不同抗体滴度的变化，研究合成SSB/La多肽与DNA共同免疫动物是否导致DNA抗体产生抑制。方法根据人SSB抗原cDNA编码的氨基酸序列，设计合成214,225位的12个氨基酸多肽，将人工合成多肽与血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin， KLH)进行耦联，与 dsDNA、SSB联合DNA、KLH、PBS分别作为抗原对5组家兔进行免疫,用ELISA法检测产生的抗体。并取动物心、肝、肾、脾和皮肤进行组织学检查和免疫荧光检测。结果ELISA法检测发现,不同抗原免疫家兔均能诱导相应抗体产生。联合免疫组SSB/La抗体的滴度明显高于单独SSB免疫组，而dsDNA抗体的滴度明显低于单独免疫组。此外，混合免疫组中同一家兔SSB抗体效价显著高于DNA抗体效价。免疫后未发现动物以上器官组织学改变。结论SSB多肽、DNA免疫家兔后抗体产生规律存在差异，合成SSB/La多肽与DNA共同免疫家兔后可导致DNA抗体产生抑制。 【关键词】 SSB多肽 共同免疫 抗体产生抑制 SSB peptides and DNA co-immunization induces inhibition of anti-dsDNA antibody production DING Min1, LI Hou-min2, CHEN Xue2, ZHANG Jian-zhong2 (1.Department of Dermatology, Xuzhou Central Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221009, China; 2.Department of Dermatology, People′s Hospital of Peking University, Beijing 100044) Abstract:Objective The aim of the present study is to observe the anti-SSB antibody and anti-dsDNA antibody production profiles following immunization with synthetic SSB peptides alone, DNA alone or co-immunization with these two antigens.Methods SSB 214-225aa peptide was synthesized by organic chemistry solid-phase peptide synthesis. 5 groups of rabbits were immunized with the following antigens: synthetic SSB peptides linked with keyhole limpet hemocyanin (KLH), dsDNA, SSB plus DNA, KLH and PBS. The antibodies produced were determined by ELISA. Histopathology and direct immunofluorescence assay were also performed.Results Anti-SSB and anti-dsDNA antibodies were produced through immunization with SSB peptide and DNA respectively. The titre of anti-SSB antibody in co-immunization group was higher than that in SSB peptide immunization group, while the titre of anti-dsDNA antibody in co-immunization group was lower than that in DNA immunization group. It was also revealed that the titre of anti-SSB antibody was relatively high and that of anti-DNA antibody was relatively low in the co-immunization groups. Pathology showed no morphological or immunological abnormalities in the heart, liver, kidney，spleen and skin tissues.Conclusion Inhibition of anti-DNA-antibody production will be induced by co-immunization with synthesized SSB peptides and DNA, implying that the milder manifestations in some forms of LE maybe, at least partly, associated with the upper-hand formation of anti-SSB antibody. Key words: SSB peptides; dsDNA; co-immunization; restraint of anti-DNA antibody production 系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中往往有多种自身抗体，如抗 dsDNA、抗Sm抗体、抗SSA抗体和抗SSB抗体等。研究，在 红斑狼疮(LE)等自身免疫性疾病的发病机制中，抗dsDNA抗体 为最具有致病性的自身抗体，可参与肾脏损害以及其他脏器损害 的形成,1-2,。临床上，抗dsDNA抗体滴度消长往往与LE活动 和其严重性相关;抗SSB抗体主要见于干燥综合征及某些LE患 者，而临床上发现有抗SSB抗体的LE患者往往病情较轻，预后 较好,3,5,。说明不同抗体不仅有诊断意义，而且可能还有一 定的预后意义。本研究用合成SSB多肽和DNA抗原免疫动物，观 察在分别免疫和共同免疫后相应抗体产生的情况，以了解在不同抗体产生中有无相互作用。 1 材料和方法 1.1 主要试剂与仪器 Fmoc-氨基酸,小牛胸腺DNA(鼎国公司，北京)，血蓝蛋白(KLH，Sigma公司)，羊抗兔IgG(Sigma公司),四甲基联苯胺(Sigma公司),96孔酶联板(Corning公司),多肽自动合成仪(ABI 433A型)，高效液相色谱仪(Waters 600E)，冷冻抽干机 (Virtis)。 1.2 动物 健康新西兰白兔10只，雌性，体重2 kg左右，分为5组(每组2只)。SSB组:标为SSB1,SSB2。DNA组:标为DNA1,DNA2。SSB+DNA组:标为联合1，联合2。KLH组:标为KLH1，KLH 2。PBS组:标为PBS1，PBS2。分别用以下5种抗原进行免疫:a. 合成多肽SSB/La 20 mg与载体蛋白KLH交联制备抗原KQKLEEDAEMKS-Y-KLH; b. 小牛胸腺DNA; c. SSB+DNA，取SSB-KLH抗原与DNA抗原混合; d. KLH; e. PBS。 1.3 方法 1.3.1 多肽抗原氨基酸序列的预测与设计 通过专门结构软件，综合蛋白的二级结构、亲水性、面可及性等，结合免疫原性表位，设计合成SSB/La多肽。多肽序列: SSB/La 214,225aa KQKLEEDAEMKS-Y。羧基末端加上Y(酪氨酸)以便与载体(KLH)耦联。 1.3.2 抗原表位多肽的合成 设计的抗原表位多肽采用有机化 学固相合成法(Fmoc保护的氨基酸，固相载体为树脂)，采用多肽自动合成仪，自多肽的羧基端向氨基端合成，得到肽树脂，再用TFA法将多肽从树脂上切割下来，粗提。纯化方法:用Waters 600E高效液相色谱仪，C18反相高效液相色谱法分离纯化，纯度95%以上。Virtis冷冻抽干机抽干。 1.3.3 家兔免疫 采用浓度为1 g/L的抗原多肽对家兔进行免疫。初次免疫:抗原多肽和弗氏完全佐剂(CFA)各1 ml充分乳化 50个点)皮下注射。加强免疫:抗原后免疫, 背部多点(40, 多肽和弗氏不完全佐剂(IFA), 每间隔20天加强免疫1次。共进行免疫4次。在第2、3、4次免疫后10天左右进行耳静脉采血, 分离血清采用间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价。免疫后14天处死兔(颈动脉放血)，留取血液静置，分离血清行ELISA检测。 1.3.4 ELISA法检测抗体 用抗原多肽片断(不含有KLH)、DNA、多肽片断，DNA、KLH包被96孔酶联反应板:多肽片断，0.1 ml/孔，含0.2 μg抗原;DNA，0.1 ml/孔，含2 μg抗原;KLH，0.1 ml/孔，含2 μg抗原;pH 9.6碳酸盐缓冲液4?过夜。PBS-T(0.01 mol/L PBS，pH 7.4，含0.05,土温,20)洗4次，控干。封闭:1, BSA pH 9.6磷酸盐缓冲液0.1 ml/孔37? 1 h。PBS-T洗4,5次，控干。将兔血清稀释成(用1,BSA PBS-T):1?100，1?200，1?400，1?800，1?1600，1?3200，1?6400;用正常家兔血清(免疫前的)作阴性对照，稀释成1?1000，0.1 ml/孔37? 30 min，PBS-T洗4,5次，控干。二抗用辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 0.1 ml/孔，37? 40 min，PBS-T洗4,5次。显色剂用四甲基联苯胺(TMD)显色系统。终止液:1 mol/L H2SO4。测光密度(D)值，检测波长为:450 nm。阴性对照D值2.1倍以上判定为阳性，阳性结果的最高稀释度为抗体滴度。 1.3.5 组织病理及直接免疫荧光检查 处死兔后立即取肝、脾、心、肾及皮肤组织分别行组织病理及直接免疫荧光。按常规操作进行。 2 结 果 2.1 SSB及DNA抗体产生情况 第2、3、4次免疫后留取的血清ELISA法检测抗SSB及抗DNA抗体，结果显示不同抗原免疫家兔后诱导了相应抗体产生，第2次免疫后即可检测到抗SSB及DNA抗体，且抗体效价随免疫次数逐步升高。抗体效价达到峰值后即不再升高。SSB与DNA联合免疫家兔时，所检测到的抗SSB抗体滴度较单独SSB多肽免疫家兔明显升高(表1);而联合免疫组产生的抗DNA抗体滴度较单独DNA免疫组明显低(表2)。另外，联合免疫组产生的抗SSB多肽抗体明显高于抗DNA抗体(表3)。表1 第3、4次免疫后SSB免疫组与联合免疫组表2 第3、4次免疫后DNA免疫组和与联合免疫组表3 第3、4次免疫后联合免疫组SSB抗体 2.2 组织病理及直接免疫荧光检查 不同抗原免疫后的兔肝脏、脾脏、心脏、肾脏及皮肤组织病理无明显异常。直接免疫荧光检 查未发现IgG和C3免疫复合物沉积。 3 讨 论 抗dsDNA抗体是SLE特别是LE肾炎的标志性抗体，而抗SSB/La抗体主要见于干燥综合征和某些LE。Wasicek等,3,曾比较了单纯抗Ro/SSA抗体阳性与抗Ro/SSA和抗La/SSB抗体均阳性的SLE患者的临床特征，发现伴有抗La/SSB抗体的SLE患者的临床表现要较单纯抗Ro/SSA抗体阳性的患者轻。张建中等,5,对40例亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)患者进行3,14年的随访分析后证实了环形红斑型SCLE抗SSB抗体阳性率更高、病情更轻、不容易发展成为SLE，而丘疹鳞屑型SSB抗体阳性率较低，也容易发展成为SLE;认为抗SSB抗体与病情较轻、预后较好相关。 在干燥综合征及LE患者中经常可同时检测到多种自身抗体，Sm抗体常与U1 RNP抗体相伴随产生，而SSA抗体常与SSB抗体相伴随，抗dsDNA抗体也往往与其他抗体伴随产生。这些抗体之间有无相互作用目前还不清楚。SSB/La抗体与dsDNA抗体之间有无相互作用，人们已进行过一些研究，如Zhang等,6,8,报道部分抗SSA、SSB抗体是抗dsDNA抗体的独特型抗体，此种抗体可以抑制dsDNA抗体与dsDNA的结合，认为这种抗体在调节LE患者dsDNA抗体产生中具有重要作用。 近年来对SSB抗原结构的研究有了进一步的深入，相继发现了一些免疫表位。人SSB/La抗原cDNA包括1631个碱基,编码408 个氨基酸。文献表明La 1,107位氨基酸、La 111,242位氨基酸和La 346,408位氨基酸为免疫优势表位,9,。Terzoglou等,10,用SSB抗原表位多肽免疫家兔产生了抗相应表位的抗体及其他表位甚至全长SSB抗原的抗体。本实验通过对SSB抗原分子结构的分析，选择合成了 SSB/La 214,225aa十二肽，该多肽位于文献的抗原优势表位区域内。 在本实验中不同抗原免疫家兔后均产生了相应抗体。在联合免疫组中抗SSB/La抗体的滴度明显高于抗dsDNA抗体，提示在2种抗原共同免疫过程中，2种抗体的产生形成了一定的"竞争"现象，而在此竞争中，抗SSB/La抗体的产生体现出优势效应，相对抗dsDNA抗体产生就处于弱势。从单独免疫和共同免疫时抗SSB/La抗体和抗dsDNA抗体滴度的变化情况，也提示抗SSB/La抗体产生对抗dsDNA抗体产生有一定"抑制"作用。这种现象产生的机制还不清楚，但因为dsDNA抗体在LE中是一种致病性极强的自身抗体，抗dsDNA抗体被抗SSB/La抗体所抑制可能会导致抗dsDNA抗体相关性炎症反应及组织损伤的减少，可能会减少DNA-抗DNA免疫复合物介导的免疫反应，从而减轻病情。另一方面，尽管SSB/La抗体也是自身抗体，但多与病变轻微密切相关，提示其致病性弱，如果弱致病性抗体能对强致病性抗体产生抑制，则具有积极意义。 本实验从抗体生成的角度探讨了SSB/La抗体和抗dsDNA抗体之间的关系。虽然本实验中SSB和 DNA免疫后产生了相应抗体， 但被免疫动物各器官的组织病理检查无异常，直接免疫荧光亦无 免疫沉积，提示诱导LE及其他自身免疫病的炎症和组织损伤除 了自身抗体产生外尚需其他因素的参与。 【参考文献】 Balow JE, Austin HA 3rd. Renal disease in systemic ,1, lupus erythematosus ,J,. Rheum Dis Clin North Am, 1988, 14(1):117-133. ,2,Arbuckle MR, James JA, Kohlhase KF, et al. Development of anti-dsDNA autoantibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus ,J,. Scand J Immunol, 2001, 54(1-2):211-219. ,3,Wasicek CA, Reichlin M. Clinical and serological difference between systemic lupus erythematosus patients with antibodies to Ro versus patients with antibodies to Ro and La,J,. J Clin Invest, 1982,69(4):835-843. ,4,Tebbe B, Mansmann U, Wollina U, et al. Markers in cutaneous lupus erythematosus indicating systemic involvement. A multicenter study on 296 patients ,J,. Acta Derm Venereol, 1997, 77(4): 305-308. ,5,张建中,金江，郭利邵，等.两型亚急性皮肤型红斑狼疮病 情演变的分离现象,J,.中华皮肤科杂志，2001, 34(1):9-11. ,6,Zhang W, Reichlin M. Some auto-antibodies to Ro/SS-A and La/SS-B are anti-idiotypes to anti-double-stranded DNA,J,. Arthritis Rheum, 1996, 39(3): 522-531. ,7,Zhang W, Winkler T, Kalden JR, et al. Isolation of human anti-idiotypes broadly cross reactive with anti-dsDNA antibodies from patients with systemic lupus erythematosus ,J,. Scand J Immunol, 2001, 53(2): 192-197. ,8,Zhang W, Frank MB, Reichlin M. Production and characterization of human monoclonal anti-idiotype antibodies to anti-dsDNA antibodies ,J,. Lupus，2002, 11(6): 362-369. ,9,McNeilage LJ, Macmillan EM, Whittingham SF. Mapping of epitopes on the La (SS-B) autoantigen of primary Sj gren′s syndrome: identification of a cross-reactive epitope ,J,. J Immunol,1990,145(11):3829-3835. ,10,Terzoglou AG, Routsias JG, Sakarellos C, et al. Linear epitopes of two different auto-antigens-La/SSB and myelin basic protein--with a high degree of molecular similarity, cause different humoral immune responses ,J,. J Autoimmun,2003,21(1):47-57. 本文编辑:程春开 作者:丁敏作者单位:徐州市中心医院皮肤科，江苏徐州221009