酵母蔗糖酶的提取和酶活测定

酵母蔗糖酶的提取和酶活测定 一，实验目的 学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法; 学习提取生物活性大分子的方法。 (一)实验 材料:活性干酵母粉、石英砂; 试剂:95,冰乙醇、DNS液、PBS(pH7.2)、 5,蔗糖溶液、1N NaOH溶液; 仪器:水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光 光度计。 (二)实验原理 蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法; 蛋白质等生物活性大分子的提取方法。 (三)提取工艺和酶活测定 蔗糖酶 1.蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变;在pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活; 2.蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂(如Vc)保持酶活力; 3.酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大(约270KDa)， 后者活力较低，分子量约为135KDa，两种酶 的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。 提取工艺 1. 破碎酵母细胞的方法: 蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活; 或者采用自溶法(适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁)，此方法较为温和，但是时间较长， 需加入少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染; 原则:低温，处理时间短，防止酶失活。 2. 选择性热变性: 根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去， 而蔗糖酶保持活性仍在上清液中;该法简便易行。 原则:1、选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性， 2、溶液的蛋白质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。 3. 有机溶剂沉淀法: 根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的 物沉淀的条件。 原则:1、注意在低温下操作，故无水乙醇要预冷; 2、边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活; 3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。 测定酶活的原理 1.蔗糖酶可作用于β,1，2糖苷键，将蔗糖水解为D,葡萄糖和D,果糖; Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，Mn2+ 是其抑制剂。 2.葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5,二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的 量和反应液的颜色强度成正比例关系。 3.蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。 提取酶注意事项 1.了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择合适的提取条件; 2.提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加一些保护剂(如还原剂、金属螯合剂等); 3.提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素; 4.一般先选择分辨率低处理量大的方法(如萃取、沉淀、吸附)浓缩酶，再采用分辨率高的方法(如离子交换层析、亲和层析、超滤)精制; 5.通过酶活测定，调节提取条件。 (四)实验步骤 反复冻融法破碎酵母细胞 1. 称取0.5g活性干酵母粉，0.2g石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状， 2.加入10mLPBS(pH7.2)，混合均匀，研磨5min ,,20度冷冻(液面结一层薄冰即 可)， 再研磨5min; 离心获得粗酶液 1. 吸取3mL酵母细胞破碎液于离心管中(两组同学配平)，5000rpm 15min，保留上清液;——粗酶液 分离纯化获得纯酶液 1.吸取剩余的7mL酵母细胞破碎液于烧杯中，45度水浴15min，缓慢搅拌(防止产生泡沫，蛋白质变性)，迅速冷却， 5000rpm 15min，保留上清液;——选 择性热变性除去杂蛋白 2.将上清液置于烧杯中，加入等体积预冷的无水乙醇(乙醇终浓度约50,)，边加边缓慢搅拌，,20度静置15,20min， 5000rpm 15min，保留沉淀物;——有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶 3.吸取7mLPBS(pH7.2)于沉淀物中，轻轻搅拌促溶;——纯酶液 ?