大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能、免疫功能和乳腺肥大细胞白介素-4水平的影响

大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能、免疫功能和乳腺肥大细胞白介素-4水平的影响 大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能、免疫功能和乳腺肥大细胞白介素-4水平的影响 动物营养2010,22(6):1679—1686 ChineseJournalofAnimalNutrition doi:10.3969/j.issn1006—267x.2010.06.031 大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能,免疫功能和 乳腺肥大细胞白介素一4水平的影响 郝振荣朱志宁王明蒋林树郭玉琴 (北京农学院动物科技学院,北京102206) 摘要:本试验旨在研究大豆异黄酮对泌乳后期中国荷斯坦奶牛泌乳性能,免疫功能和乳腺肥大细胞白介素一4 水平的影响.选择12头泌乳后期的荷斯坦奶牛随机分为4组,每组3个重复.对照组和A,B,C组分别添加不同 水平的大豆异黄酮(O,1O,2O,30mg/kg).分离采自奶牛乳腺的肥大细胞,并分别与0,0.25,0.50,075mg/mL的 大豆异黄酮共育.结果表明:1)大豆异黄酮可显着减缓泌乳后期奶牛产奶量下降趋势(P<0.05),其中A,B和c 组奶牛的产奶量比对照组提高7.29%,12.66%和10.13%;2)B和C组乳蛋白质率显着高于对照组(P<0.05); 3)大豆异黄酮可提高血清和乳中生长激素(GH)和催乳素(PRL)的含量,B和C组效果显着(P<O.05),显着降低 (P<O.05);4)大豆异黄酮可显着提高血清(P<0.05),乳生长抑素(ss)含量 (P<0.O1)和乳腺组织(C组,P< 0.05)中自介素一4(IL一4)的水平;5)0.25mg/mL大豆异黄酮能够极显着增加奶牛乳腺肥大细胞的IL一4表达量 (P<O.O1).由此可知,大豆异黄酮能够通过对乳腺免疫指标表达量的调控,提高奶牛泌乳性能,增强奶牛的免疫功 能,可促进乳腺肥大细胞IL.4的分泌. 关键词:大豆异黄酮;荷斯坦奶牛;泌乳性能;免疫功能;白介素一4 中图分类号:$826文献标识码:A文章编号:1006—267X(2010)O6.1679—08 高产奶牛乳腺为最主要的牛乳发生器,因此在 生产中提高乳腺免疫机能对于奶牛健康和优质乳品 生产具有重要的意义.大豆异黄酮(sI)作为类雌激 素样物质,其促进乳腺发育和提高动物机体免疫机 能的作用,促进了人们对植物异黄酮类物质对机体 免疫影响的研究l1].肥大细胞作为乳腺中重要的 免疫效应细胞,能够分泌包括白介素一4(IL.4),干 扰素),(IFN—y)等多种免疫因子,并与众多感染性 疾病具有紧密的关系,其中IL一4能够通过抑制 IFN—y诱导的No的产生,促进体液免疫反 应l3].因此通过研究乳腺肥大细胞在大豆异黄 酮作用下的变化,可以探究大豆异黄酮的免疫调 节机理.本研究旨在通过研究饲粮中添加大豆异 黄酮对泌乳后期奶牛泌乳性能,免疫功能的作用 效果,以及对乳腺肥大细胞IL一4分泌和mRNA表 达量的影响,揭示大豆异黄酮对机体和乳腺免疫 功能的作用机理. 1材料与方法 1.1试验动物与分组 选择12头荷斯坦奶牛,胎次接近,体重 (472.35?37.00)kg,产奶量(30.00?3.25)kg/d, 乳成分接近[gL脂率(3.40?0.15)%,乳蛋白质率 (3.10?0.10)%],均为泌乳后期(203?5)d.采用 单因子试验设计,对照组和A,B,c组分别添加不 同水平的大豆异黄酮(0,10,20,30mg/kg).预试 期7d,试验期为28d.于试验期的第0,3,7,14, 21,28天,分别采集奶样和血样.试验期结束对试 验动物进行屠宰,并采集乳腺组织. 1.2试验材料 大豆异黄酮纯度?98%,购自陕西森弗生物技 术有限公司,棕黄色细小粉末状.总RNA提取试 剂(TRIzo1)购自Invitrogen公司.反转录试剂盒 (M.MLV)购自Invitrogen公司,定量试剂盒 (SYBR~PremixExTaqTM)购自Takara公司,反 收稿日期:2010—07—02 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871796) 作者简介:郝振荣(1983),男,山西偏关人,硕士研究生,主要从事反刍动物营养与免 疫研究.Email:haozhenrong@sina.corn *通讯作者:蒋林树,副教授,硕士生导师,E-mail:jIs@bac.edu.cn 1680动物营养22卷 转录过程中应用随机引物EOligo(dT)]. 1.3饲养管理 试验奶牛饲喂全混合日粮(TMR),单槽饲喂, 添加时与少量基础饲粮混合均匀后添加到供试牛饲 粮中,试验期间奶牛自由饮水,每天挤奶3次.基础 饲粮组成及营养水平见表1. 表1基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table1Compositionandnutrientlevelsof basaldiet(DMbasis)% 项目Items含量Content 原料Ingredients 大麦Barley 玉米Corn 豆粕Soybeanmeal 棉籽粕Cottonseedmeal 麸皮Bran 预混料Premix" 玉米干酒糟及其可溶物CornDDGS 菜粕Rapeseedmeal 青贮玉米Cornsilage 膨化大豆Extrudedsoybean 磷酸氢钙CaHPO4 过瘤胃保护脂肪Rumenprotectedfat 玉米干粕Driedcornmeal 苹果粕Applemeal 胚芽粕Plumulemeal 石粉Limestone 羊草Chinesewildrye 苜蓿于草Alfalfahay 食盐NaC1 合计Total 营养水平Nutrientlevels 干物质DM 净能NE/(MJ/kg) 粗脂肪EE 粗蛋白质CP 酸性洗涤纤维ADF 中性洗涤纤维NDF 钙Ca 总磷TP 6.25 12.72 3.75 3.60 2.50 0.25 1.25 1.25 42.50 2.O0 0.45 1.O0 5.0O 3.35 3.75 O.66 4.50 5.O0 0.22 1O0.0O 23.60 7.44 4.70 17.5O 20.2O 36.2O O.86 0.44 "预混料为每千克饲粮提供Premixprovidesfollowing perkgofdiet:Cu4560mg,Mn4590mg,Zn12100mg,Se 200mg,Co60mg,VA2000000IU,VD450000IU,VE 10000IU,炯酸niacin3000mg. 过瘤胃保护脂肪包含Rumenprotectedfatcontain: DM93%,CP25%,CF32%,NDF17%,淀粉starch3%,蔗 糖sucrose5%,ME19MJ/kg. 1.4样品的测定及方法 1.4.1奶样与血样的处理与测定 每天记录试验奶牛的产奶量,以校正乳产量 表刀. 奶样采集:采集08:00,15:3O和22:303次奶 样,按比例混匀并立即于一2O?冷冻贮藏,用于乳 中催乳素(PRL),生长激素(GH)和生长抑素(Ss) 以及IL.4和免疫球蛋白G(IgG)含量的测定. 血样采集:使用真空采血管进行尾静脉无菌采 血,血样于3000r/min离心15min后吸取上清液, 制备血清并于一2O?冷冻贮藏,用于血清中GH, PRL,SS,IL一4和IgG含量的测定. 所有指标均采用放射免疫法进行测定. 1.4.2屠宰,取样与测定指标 试验结束时,对试验奶牛进行屠宰.屠宰按照 试验动物保护条例进行,试验奶牛电击致死后,采集 其乳房的不同部位,于液氮中保存.用于测定血清 和乳中IL.4,IgG的含量,以及乳腺组织中IL一4, IgG的mRNA表达量.另取部分组织4?保存,用 于乳腺肥大细胞的分离以及与大豆异黄酮共育后的 IL.4分泌量和mRNA表达量的测定. 1.4.3乳腺肥大细胞的分离与筛选 切取和选择脂肪较少且富含乳腺小叶的乳腺组 织,用磷酸盐缓冲液(PBS,含有1mg/mL青霉素, O.5mg/mL链霉素)冲洗组织块,4?PBS中暂存. 酶消化法分散细胞:采用分次酶消化法对乳腺 细胞进行分散,剪碎的组织块,用消化液A(含 3mg/mL链霉蛋白酶,0.75mg/mL木瓜凝乳蛋白 酶)室温消化2次,20min/次,每次消化后使用孔径 为300m细胞筛进行过滤,去除已游离的细胞. 后使用消化液B(含1.5mg/mL胶原蛋白酶, 0.15mg/mL弹性蛋白酶)30?消化2次,20min/次, 每次消化后过滤,收集滤液,4?离心(400xg, 10min),弃上清液,PBS[含牛血清白蛋白(BSA) 0.25mg/mL]重悬. 肥大细胞的分离与纯化:细胞悬液采用100m 细胞筛过滤,并收集滤液,进行细胞计数.4?离心 (400×g,10min),弃上清液,细胞分离液(Percol1) 进行重悬,并使细胞数量达到1×10个,利用不连 续密度梯度离心进行肥大细胞的纯化.Percoll密 度依次为:1.090,1.080,1.070,1.062g/mL. 2O?下离心(500×g,40min)后,收集1.070和 1.080之间,1.080和1.090之间2个界面的细胞, PBS洗涤,离心并重悬. 1.4.4乳腺肥大细胞的培养 细胞完全培养液:RPMI1640[含有羟乙基哌嗪 乙磺酸(HEPES)25mmol/L,GIBCO公司],L一谷 氨酰胺2mrnol/L,10%胎牛血清(FBS),青霉素 6期郝振荣等:大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能,免疫功能和乳腺肥大细胞白 介素一4水平的影响1681 100IU/mL,链霉素100IU/L和干细胞因子 50ng/mL. 细胞维持培养液:FBS为1%,其他均和完全培 养液相同. 肥大细胞培养分为4个处理,分别使用维持培养 ),维持培养液+大豆异黄酮0.25mg/mL 液(S10组 (SI1组),维持培养液+大豆异黄酮0.50mg/mL (SI2组),维持培养液+大豆异黄酮O.75mg/mL (SI3组)进行培养,每组6个重复. 75cm培养瓶内接种5.0x10.细胞以完全培养 液培养24h后进行试验,置37?,5%CO2细胞培养 箱中孵育,并于培养后24,48h时分别收集培养上清 液和肥大细胞,冷冻保存用于测定IL一4的表达量. 1.4.5IL一4,IgG的mRNA表达量的测定 培养上清液中的IL一4的表达量使用ELISA放 免试剂盒进行翻译水平检测. 乳腺组织总RNA提取采用TRIzol,对做所提 取RNA进行检测后,以甘油醛一3一磷酸脱氢酶 (GAPDH)作为内参照物,以Oligo(dT)作为引物按 照M—MLV反转录试剂盒推荐方法进行反转录. 反转录扩增条件:60?,34S,40个循环.采用 2法计算mRNA相对表达量.根据IL一4(Gen. Bank中登录号为280824)序列设计引物,根据IgG (GenBank中登录号为338062)序列设计引物. 表3RT—PCR引物序列 Table3PrimersequencesforRT—PCR 引物序列Primersequences(5一3) 自介素一4IL_4 免疫球蛋白GIgG 甘油醛一3一磷酸脱氢酶GAPDH Forwardprimer:GCGGACTTGACAGGAATCTCAAC Rewardprimer:GCCTTTCCAAGAGGTCTTTCAGC Forwardprimer:CGTCATCGGCTTATTCCTGCTC Rewardprimer:GAGGGCCCCTACATCCTCC Forwardprimer:TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA Rewardprimer:GCTGGGGGTCCAGGGACCTTACT 1.5数据处理与 试验数据用Excel进行整理,应用SPSS16.0 统计处理软件的ANOVA程序进行方差分析,差异 显着时用Duncan氏法进行各组间的多重比较,试 验数据用平均值?差表示. 2结果 2.1大豆异黄酮对产奶量和乳成分的影响 由表4可知,奶牛饲粮中添加大豆异黄酮可维 持泌乳后期奶牛的泌乳高峰,减少泌乳后期产奶量 的下降,与对照组比差异显着(P<O.05),但试验组 间差异不显着(P>0.05).饲粮中添加大豆异黄酮 对乳脂率没有显着的影响(P>0.05).B组和C组 乳蛋白质率显着高于对照组(P<0.05). 2.2大豆异黄酮对血清中激素水平的影响 由表5可知,饲粮添加不同水平大豆异黄酮,能 提高血清中PRL和GH的含量,降低SS水平,但影 响程度各不相同.试验结束时和开始前相比,A,B, C组PRL分别提高了32.16%(P<0.05),37.68% (P>0.05)和36.35%(P<0.05);GH提高了 22.42%(P>0.05),50.34%(P<0.05)和30.77% (P<0.05);试验组的SS分别降低了20.48%, 19.61%和15.29%,差异显着(P<O.05). 表4不同添加水平的大豆异黄酮对奶牛产奶量和乳成分的影晌 Table4EffectsofsupplementationlevelofSIonmilkyieldandcompositionindairyCOWS 同列数据肩标不同小写字母表示差异显着(P<O.05),不同大写字母表示差异极显着(P<O.01),相同字母或无肩标表示 差异不显着(P>O.05).下表同. Inthesamecolumn,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference (P<O.05).withdiffer- entcapitallettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.01),andwiththesameornol ettersuperscriptsmeanno significantdifference(P>O.05).Thesameasbelow. 1682动物营养22卷 催乳素 PRL/(ng/mL) 生长激素 GH/(ng/mL) 生长抑素 SS/(pg/mL) 第0天Day0 第3天Day3 第7天Day7 第14天Day14 第21天Day21 第28天Day28 第O天Day0 第3天Day3 第7天Day7 第14天Day14 第21天Day21 第28天Day28 第O天Day0 第3天Day3 第7天Day7 第14天Day14 第21天Day21 第28天Day28 12.53?2.46 12.88?3.O9 11.96?2.24 14.95?3.1O 14.11?1.74 16.56?1.37 1.65?0.16 2.04?0.33 1.64?0.30 1.88?O.43 1.90?O.23 2.02?O.12 40.86?1.47 37.93?6.24 36.38?6.93 38.O9?3.35 35.55?4.87 32.49?2.O5 1O.59?1.93 12.09?0.68 11.O7?1.25 14.23?5.60 17.47?2.04 14.58?1.51 1.47?0.15 1.95?0.46 2.27?O.23 2.1O?0.07 2.03?0.O6 2.21?O.13 39.57?0.42 35.65?2.32 30.90?2.29c 34.O3?2.86 32.O0?3.77a 31.81?1.63 11.O6?1.54 12.52?2.70 12.68?1.34 12.95?3.45 13.92?1.66 15.08?O.73 1.69?O.30 1.58?0.16 1.58?0.21 1.95?O.17 1.99?O.22 2.21?O.14 40.58?1.73 37.87?3.23 32.92?3.01 35.85?5.82 37.O1?6.7O 32.O8?1.2O 1O.98?2.01 12.67?O.52 12.84?1.31 11.31?3.O1 13.18?1.4O 1O.12?0.94 1.79?O.17 1.66?O.38 1.57?0.41 1.66?0.57 1.58?0.23 1.54?O.63 38.55?3.O5 36.39?2.68 41.95?7.27 37.63?4.74 37.37?3.47 38.96?1.77 2.3大豆异黄酮对乳中激素水平的影响 由表6可知,饲粮添加不同水平大豆异黄酮,能 提高乳中PRL和GH的含量,降低ss水平,但影响 程度各不相同.试验结束时(28d)和开始前(0d) 相比,试验组PRL分别提高了14.47%(P>0.05), 42.12%(P<0.05)和35.99%(P<0.05);GH提 高了7.84%(P>0.05),39.08%(P<O.05)和 47.67%(P<0.05);而ss分别降低了21.35%, 19.81%和8.01%,差异显着(P<0.05),对照组SS 含量升高5.54%(P>0.05). 2.4大豆异黄酮对血清IgG含量,乳腺IgGmRNA 表达量的影响 由表7可知,饲粮中添加不同水平大豆异黄酮, 可明显提高大豆异黄酮半抗原刺激产生的免疫应答 反应,产生的血清IgG明显升高,A,B和C组分别 比试验开始前提高26.95%(P<0.05),37.59% (P<0.01)和20.10%(P<0.01).由表8可知,饲 粮中添加大豆异黄酮的水平对乳腺中IgG的mR- NA表达量无显着影响(P>0.05),但从数据上看, 试验组比对照组IgG表达量略有下降. 2.5大豆异黄酮对血清及乳中IL一4含量影响 由表9可知,饲粮添加不同水平大豆异黄酮,能 提高血清和乳中IL-4的含量.A,B和C组血清中 IL一4含量试验后比开始前分别提高了54.55% (P<0.05),30.43%(P<0.O1)和33.02%(P< 0.01),而对照组试验后差异不显着(P>0.05).乳 中IL-4含量在试验后分别提高62.97%,53.66% 和5O.00%,差异极显着(P<0.01). 2.6大豆异黄酮对乳腺组织中?,4mRNA表达量的影响 由表10可知,c组IL.4mRNA表达量高于其 他3组,差异显着(P<0.05). 2.7大豆异黄酮对培养后肥大细胞?,4含量的影响 由表11可知,培养24h后SIO和SI3组的IL-4 分泌量极显着低于SI1和SI2组(P<0.O1),其 mRNA表达量SI1和SIO组极显着高于SI2,SI3组 (P<0.01).48h时所有试验组的IL一4分泌量均 显着高于SIO组(P<0.01);mRNA相对表达量则 为SI2极显着低于SIO组(P<0.01),SI1和SI3组 极显着高于SIO组(P<0.01). 3讨论 3.1饲粮中添加不同水平的大豆异黄酮对奶牛 泌乳性能的影响 依据产奶量变化情况可见,添加大豆异黄酮的 各个试验组试验期间产奶量显着高于对照组(P< 0.05),因此大豆异黄酮能够减缓泌乳后期奶牛的泌 乳下降趋势.试验结束后与开始前相比,试验组奶 牛血清和乳样中的GH,PRL均有不同程度的上 6期郝振荣等:大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能,免疫功能和乳腺肥大细胞白 介素一4水平的影响1683 升,总体上B,C组的效果较好,而试验组中的SS则 全部呈现显着性的下降(P<0.05).有研究表明, 雌激素能够引起青年母牛的乳腺组织增生,大豆异 黄酮是一类具有雌激素作用的植物黄酮类物质,能 够与雌激素受体相结合并表现出雌激素的作用_5. 乳腺的发育是在雌激素,PRL和GH等的共同促进 下发育的一,且机体不同组织分泌的促进乳腺生长的 一 些因子能够通过多种分泌途径来调节雌激素对乳 腺发育的作用].GH能够使乳腺实质及总乳腺细 胞数显着增加..,但其在泌乳过程中并不能直接影 响产奶量.GH在泌乳期间主要的作用是调节营养 物质在乳腺的重分配,在泌乳期间GH能够使来 自体内脂肪的能量较多用于乳腺组织..PRL在产 前启动泌乳方面具有重要的作用?1,但研究表明反 刍动物泌乳过程中PRL与产奶量仅呈弱相关,但在 泌乳早期对奶牛乳头进行挤奶刺激可迅速增加血液 PRL含量,然而随着乳汁的分泌PRL含量逐渐下 降口.迄今为止,仍未见PRL与产奶量之间明确关 系的报道.ss具有降低乳腺生长的作用,试验表明, 胰岛素样生长因子一工(IGF-D的表达能够抑制其分 泌l1,而IGF—I能够促进牛乳腺的发育引. 表6不同添加水平的大豆异黄酮对奶牛乳中激素水平的影响 Table6EffectsofdifferentSIsupplementationlevelsonhormonesinmilkindairyCOWS 表7不同添加水平的大豆异黄酮对奶牛血清IgG含量的影响 Table7EffectsofdifferentSIsupplementationlevelsonIgGcontentinserumofdairyCOWSg /L 1684动物营养22卷 表8不同添加水平的大豆异黄酮对奶牛 乳腺IgGmRNA表达的影响 Table8EffectsofdifferentSIsupplementationlevelson IgGexpressionlevelinmammarytissueofdairyCOWS 相对表达量 Relativeexpressionlevel 3.2饲粮中添加不同水平的大豆异黄酮对奶牛 血清和乳腺免疫功能的影响 IL-4能够促进嗜酸性粒细胞的激活和分化,辅 助B细胞并提高对应的IgM,IgE和不激活补体的 IgG亚型的产量,并同超敏反应有关.作为一种重 要的免疫激动剂,IL.4能够刺激同型抗体向IgE的 转化口.I1.已有研究表明,大豆异黄酮类物质能够 通过上调磷酸酶一1(AP.1)的DNA限制活性来增 加IL.4的表达量,且这种使IL-4表达量增加的能 力与异黄酮的剂量相关_1引.据试验结果可见,各个 试验组的血清IL一4含量均显着提高(P<0.05或 P<0.01),乳中IL.4含量极显着提高(P<0.01). 乳腺中的IL.4mRNA表达量则在C组中有显着的 提高(Pd0.05).在肥大细胞的大豆异黄酮添加培 养试验中可见,随着试验时间的延长,SI1和SI2组 IL.4的分泌量极显着高于S10和SI3组,而细胞 IL.4mRNA表达量则显示SI1和SI3组的表达量 显着高于S10组,而SI2组显着低于S10组.细胞 试验与动物试验均显示出,大豆异黄酮能够促进 IL.4的分泌,且不同剂量时的增加程度不同. 表9不同添加水平的大豆异黄酮对奶牛血清及乳中IL-4含量影响 Table9EffectsofdifferentSIsupplementationlevelsonIL一4ofserumandmilkofdairyCOWSng/mL 表10不同添加水平的大豆异黄酮对乳腺组织中 IL一4mRNA表达量的影响 Table10EffectsofdifferentSIsupplementationlevelson IL一4expressionlevelinmammarytissueofdairyCOWS 组别Groups相对表达量Relativeexpressionlevel A组GroupA B组GroupB C组GroupC 对照组Controlgroup 0.48?0.10 0.40?0.08 O.68?O.O4 O.5O?O.04 大豆异黄酮能够通过IL.4间接调节IgG的分 泌与表达.IL.4能够增加所有免疫球蛋白的分泌 水平[1,也有试验表明IL.4能够促进免疫球蛋 白G1和免疫球蛋白E的增加而抑制免疫球蛋白 G2a的产生.本试验中泌乳牛血清中IgG含量 有明显升高,但仍在健康水平内.说明IL-4通过激 活和上调辅助T淋巴细胞2(Th2)细胞的分泌能力 增加了IgG的分泌量乜引.乳腺中的IgG水平则为 试验组显着低于对照组,可能是由于乳腺组织的屏 障作用造成的. 6期郝振荣等:大豆异黄酮对奶牛泌乳后期泌乳性能,免疫功能和乳腺肥大细胞白 介素一4水平的影响1685 S10组GroupS10 SI1组GroupSI1 GroupSI2 SI2组 SI3组GroupSI3 0.53?O O.68?O O.65?0 0.46?0 025 046a 0230a 036 1.O0?0.07 1.15?O.30 0.76?0.40c 0.69?0.160 O.62?O. O.89?O. 1.14?0. O.78?0. 0230c 013 090 016 0.88?0.18 1.O5?0.11Aa 0.7O?0.07 0.96?O.22 4结论 ?大豆异黄酮能够增加泌乳后期的奶牛产奶 量,同时调控奶牛乳腺免疫,增加IL一4和IgG含量. ?适宜剂量(20mg/kg)的大豆异黄酮能够调 控乳腺肥大细胞IL.4的分泌水平,增加IL_4的分 泌量. ?大豆异黄酮能够通过对乳腺免疫因子表达 量的调控,促进乳腺肥大细胞IL_4的分泌,提高奶 牛泌乳性能,增强奶牛的免疫功能. 参考文献: r1]CHENPY,KU0YC,CHENCH,eta1.Isolation andimmunomodulatoryeffectofhomoisoflavones andflavonesfromAgavesisalanaPerrineexEngelm fJ1.Molecules,2009,14(5):1789—1795. 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