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人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建

2017-12-21 9页 doc 27KB 19阅读

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人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建 人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建 2QQ生12旦箜21鲞箜塑』!!盟ber2003,Vo121.No6 人源性抗一HBc单链噬菌体抗体库的构建 汤正好马会慧李刚黄呈辉卢建溪姚集鲁 【摘要】目的构建人源性单链噬菌体抗体库,为筛选人源性抗一HBc单链抗体奠定基础.方法 利用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术,直接从乙肝病毒核心抗体(抗一HBc) 阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA;合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基 因,并将重,轻链...
人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建
人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建 人源性抗—HBc单链噬菌体抗体库的构建 2QQ生12旦箜21鲞箜塑』!!盟ber2003,Vo121.No6 人源性抗一HBc单链噬菌体抗体库的构建 汤正好马会慧李刚黄呈辉卢建溪姚集鲁 【摘要】目的构建人源性单链噬菌体抗体库,为筛选人源性抗一HBc单链抗体奠定基础.方法 利用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)和噬菌体表面展示技术,直接从乙肝病毒核心抗体(抗一HBc) 阳性患者淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA;合成全套人抗体可变区引物扩增抗体可变区基 因,并将重,轻链可变区基因进行拼接装配成单链抗体(ScFv)基因,重组于噬菌粒载体pHEN1,转化 抑制型大肠埃希菌E.coliTG1,以辅助噬菌体援救后,构建成人源性单链噬菌体库.结果成功地构 建了人源性抗一HBc单链噬菌体库,库容量达10..结论利用RT—PCR和噬菌体表面展示技术可以 成功构建人源性单链抗体库,并达到建库,可进一步从中筛选人源性单链抗体. 【关键词】抗体;噬菌体;噬菌体表面展示技术;聚合酶链反应;肝炎核心抗原,乙型 Constructionofaphagedisplaylibraryofhumansingle-chainFvantibodiesfromperipheralb loodlym- phocytesofpeoplewithpositiveserumantibodyagainsthepatitisBviruscoreproteinTANG Zheng- hao,MAHui—hui,LJCang,eta1.DepartmentofInfectiousDiseases,TheThirdAliatedHospital ofSunYat—senUniversity,GuangZhou510630,China 【Abstract】 ObjectiveToconstrucraphagedisplaylibraryofhumansingle-chainFvantibodiesfrompe— ripheralbloodlymphocytesofpeoplewithtx:~itiveserumantibodyagainsthepatitisBviruscoreproteinMethods Theheavychainandlightchainvariableregiongeneofhumanimmunoglobulinwereamplifiedindividuallyby RT— PCRfromperipheralbloodLymphocytesmRNAofpatientswithtx:~itiveserumhepatitisBviruscoreprotein antibodyandrandomlycombinedthroughaDNAlinkerencodingthepeptide(Gly4Ser)3tocorkstructsingle-chain variablefragments(ScFv)gene.InthepresenceofhelperphageM13KO7,theScFvweredisplayedonthesurface ofrecombinantphages.ResultsRepertoireantibodylibrarywasobtainedwith10.cloniesresistanttoampicillin andkanamycin.ConclusionsAtypicalphagedisplaylibraryofhumansingle-chainFvantibodieshasbeenCOn— structedUsingRT—polymerasechainreaction(RT— PCR)andphagedisplaytechnique,humansingle-chainFvan— tibediescanbescreenedfromthislibrary. 【Keywords】 Antibodies;Bacteriophages;Phagesurfacedisplaytechnology;Polymerasechainreac— tion;HepatitisBcoreantigers 聚合酶链反应技术和蛋白质的噬菌体表面展 示技术的建立和完善,使基因工程抗体可以不经过 杂交瘤而直接从免疫动物或人体淋巴细胞中获得 抗体基因并表达….单链抗体(Single—chainvari— ablefragment,ScFv)作为基因工程抗体的一种,其 在医学应用上的价值正随着基因工程抗体研究的 不断深入而逐渐得到肯定.本研究采用基因工程 和噬菌体表面展示技术从乙型肝炎患者外周血淋 巴细胞中克隆人抗体可变区基因并构建了人源性 作者单位:510630广州,中山大学附属第三医院传染科(汤 正好,现在上海交通大学附属市第六人民医院感染科,200233,上 海) ? 403? ? 论着? 噬菌体单链抗体库,以期为人源性ScFv的筛选和 应用奠定一定的研究基础. 材料与方法 一 ,材料 (一)质粒,菌株及细胞噬菌粒载体 DHEN1[2由英国剑桥大学蛋白质工程中心惠赠; 辅助噬菌体M13KO7及大肠埃希菌E.coliTG1 为Pharmacia公司产品;人外周血淋巴细胞取自筛 选的乙肝病毒核心抗体(抗一HBc)阳性无偿献血者 抗凝血. (--)主要试剂细胞总RNA提取,胶回收及 QQ生旦笠鲞蔓塑h』!fber2003,Vol21,N06 质粒抽提试剂为QIAGEN公司产品;TaqDNA聚 合酶,dNTP及限制性内切酶为Promega公司产 品.cDNA合成试剂为MBI公司产品. (三)引物参照文献[3,4]合成,加以适当改 动.恒定区3端引物IgG:5一GTCCACCTTGGT— GTTGCTGGGCTT一3:IgM:5TGGAAGAGG— CACGTTCTTTTCTTT一3;CK:5AGACTCTCC— CCTGTTGAAGCTCTT一3;C】:5一TGAAGATTC— TGTAGGGGCCACTGTCTT一3. 重链可变区5端引物VHl-4_6:5'-GTCCTCG— CAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTR— CAGCTGSWGSAGTCKGG一3;VH2:5'-GTCCT— CGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAG. GTCAACTTAAGGGAGTCTGG一3;VH3. 5:5一G— TCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC— GAGGTGCAGCTGKTGSAGTCTGS一3. Kappa链可变区5端引物VK1.4:5一G— GCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGG— ATCTGACATCSWGATGACCCAGTCTCC一3: VK2. 3.6:5一GGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGT— GGCGGCGGATCAGAWRTTGTGMTGACKCAG— TCTCC一3;VK5:5一GGCTCGGGCGGTGGTGGG— TCGGGTGGCGGCGGATCAGAAACGACACTC— ACGCAGTCTCC一3. lambda链可变区5端引物V2:5一G— GCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGG— ATCACAGTCTGYSYTGACKCAGCCGCC一3; V, 3b:5一GGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGT— GGCGGCGGATCATCYTMTGWGCTGACTCAG— SMACC.3;V?, 5:5一GGCTCGGGCGGTGGTGG— GTCGGGTGGCGGCGGATCACASGYTRTACTG— ACTCAACCGYC一3. 重链可变区引物3端引物JH:5一GCCACCC— GACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGA— RGAGACGGTGACCRKKGTYCC一3. Kappa链可变区3端引物JK1:5一GAGT— CATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATYTC— CASCTTGGTCC(,厂3;JK2:5一GAGTCATTCTC— GACTTGCGGCCGCACGTTTKATMTCCASYYK— KGTCCC一3. lambda链可变区3端引物J:5'-GAGT— CATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTARRACGG— TSASCTKGGTCCC一3. 注:YC,T;RA,G;W=A,T;S=C,G;K=T, G;M :A,C 二,方法 (一)外周血淋巴细胞分离,总RNA的提取及 eDNA合成取抗一HBc阳性抗凝血50ml,分离淋 巴细胞.细胞总RNA的提取和cDNA合成按试 剂盒操作. (二)PCR扩增抗体基因以cDNA为, 扩增VH—CH1(7,肛)和vL—CL(Jc,)抗体基因.在 50l反应体积中加人cDNA2l,dNTP250 gmol,MgCI22.0mmol,上,下游引物各50pmol, Taq酶2.5U.PCR反应程序为:94?40s;退火1 min,温度从55?至50?,每5个循环降1?,49? 10个循环;72?1min30S,共40个循环,最后 72?延伸10min.琼脂糖凝胶电泳回收产物,以 其为模板扩增vH和vL基因,PCR反应程序为: 94?40S,55?1min,72?1min,共30个循环, 最后72?延伸10min.按上述方法回收PCR产 物,一20?保存备用. (三)ScFv基因的拼接取上述纯化的抗体 重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)基因,进 行如下方法拼接:50l反应体积中加VH和VL 各20ng,dNTP250gmol/L,MgCI22.0mmol,Taq 酶2.5U,不加引物,94?1min,55?1min,72? 1min,7个循环后加重链可变区5端引物和轻链 可变区3端引物各10pmol/L,继续PCR反应25 个循环,凝胶回收拼接产物. (四)ScFv基因的克隆与转化将拼接后回 收的ScFv基因片段和载体pHEN1分别用Sill和 NotI双酶切并纯化回收,回收产物用T4DNA连 接酶进行连接,连接反应体系:ScFv片段150ng, 10×buffer5肚l,pHEN1载体250ng,T4DNA连接 酶6U,加去离子水至总体积50l,16?16h,同 时设无片段载体对照.将连接产物转化100l TG1感受态菌,37"C250r/min培养1h.取其中 100肚l转化细胞铺2×YTAG(含2%葡萄糖和100 g/ml氨苄青霉素)平板,另以100pl未转化的 TG1感受态作阴性对照.30?培养过夜,记录克 隆数,计算转化率(转化率=克隆数×稀释倍数/车专 化的DNA量)和库容(库容=转化率×DNA转化 量×连接率). (五)重组质粒鉴定随机挑取15个克隆于1 ml2×YTAG培养基中,37"C250r/min培养8h, Q生12旦筮1鲞筮?塑hj』!!tDis,December2003,vol21.No6 五,抗体库的构建 转化克隆经辅助噬菌体超感染后,得到全套噬 菌体抗体库.涂板法测定抗体库滴度为2.17× 10加cfu/ml,库容为1.75×106. 讨论 ScFv是由VH和VL通过linker连接而构成 的单链小分子抗体,由于其大小仅为完整抗体的六 分之一,且结构和生物学特性与天然抗体或单克隆 抗体等明显不同.目前ScFv的制备主要采用噬菌 体抗体库技术.该技术为ScFv的制备提供了快捷 有效的途径,避免了单克隆抗体制备的烦琐过程, 可绕过杂交瘤甚至不经过免疫途径直接从脾细胞 或淋巴细胞获得目的抗体基因_1.4],同时使人源性 抗体的获得成为可能,避免了鼠源性抗体用于人体 时产生人抗鼠抗体反应(HAMA)的问题5. 噬菌体抗体库虽然有着很多优点,但在实际操 作中仍有一些值得注意的环节.首先,由于直接从 淋巴细胞中扩增抗体的可变区基因,因此,淋巴细 胞必须达到一定的数量才能获得足够的抗体 mRNA,以合成eDNA作为扩增的模板,否则就会 降低产物量,甚至不能获得目的片段.我们从50 m1人外周血中分离出淋巴细胞,细胞数达10/ml, 结果扩增效果较好.其次,抗体可变区扩增的策略 和反应条件对目的片段的获得极为关键.设计两 次PCR扩增引物扩增抗体可变区基因不仅容易获 得目的片段,还可以增加产物的特异性,即先扩增 VHCH1和VL—CL基因,再以其为模板半巢式 PCR扩增VH和VL基因.PCR反应条件则要根 据不同的PCR仪来进行调整.对于简并和引入酶 切位点的引物,扩增的条件更为复杂,需要在 操作过程中不断调整才能获得最佳效果.我们采 用了简并引物并在引物的5端引入了SfiI和Not I两个酶切位点及linker序列,采用改良的Touch— downPCR程序和半套式PCR,扩增VH—cH1,VL— CL和VH,VL基因,结果扩增出所有目的基因,但 有些引物扩增的产物量较低,我们增加了扩增次 数,合并产物才使其达到满意的浓度.将VH,VL 片段通过PCR拼接组装成ScFv基因相对容易,但 由于TaqDNA聚合酶具有在产物3端自行加入碱 基A的特性,因此,拼接率不是很高,一方面要适 当增加模板量,另一方面还要加入ScFv的上下游 引物对其进一步扩增.此外,ScFv基因的克隆和 转化直接影响到转化效率和库容.我们采用的是 噬菌粒载体pHEN1[,该载体特点是在ScFv基因 后面含有一段编码myc尾肽(myc—Tag)的序列,在 此序列后有一琥珀(Amber)终止密码,位于ScFv 基因和cp?基因之间,在抑制型细菌TG1菌中,这 种琥珀密码子不能有效发挥其终止作用,故在蛋白 翻译过程中可以通读而形成ScFv—cp?融合蛋白, 在加入辅助噬菌体M13K07后,ScFv以融合蛋白 的形式表达在噬菌体表面.ScFv基因和pHEN1 载体的合适比例对于获得高连接率非常重要.我 们用150ngScFv基因和250ngpHEN1载体进行 连接后获得近50%的连接率.ScFv—pHEN1载体 转化细菌的方法可采用化学法和电穿孔法,后者效 率较高.我们用Mg制备TG1感受态菌进行转 化,转化率可达10g. 总之,噬菌体抗体库的构建存在较多关键的环 节,把握好这些环节才能构建出具有符合标准库容 的抗体库.我们利用PCR和噬菌体表面展示技 术,直接从人的外周血淋巴细胞中扩增出抗体轻, 重链可变区,并将其拼接成ScFv基因,克隆于 pHEN1载体,转化抑制型大肠埃希菌TGI,用辅助 噬菌体超感染,建立了含有抗HBc的人源性单链 噬菌体抗体库,滴度为217×10加cfu/ml,库容为 198×10,已基本达到建库要求. 志谢感谢北京医科大学肿瘤研究所王琰教授,中山大学 寄生虫教研室詹希美教授,陈代雄博士在本课题完成中给 予的帮助 参考文献 1HoogenboomHR,WinterG.By—passingimmunisation.Human antibodiesfromsyntheticrepertoiresofgermlineVHgeneseg— mentsrearrangedinvitro.jMolBiol,1992,227:381-388. 2HoogenboomHR,GriffithsAD,JohnsonKS,eta1.Multi—subunit Droteinsonthesurfaceoffilamentousphage:methodologiesfor displayingantibody(Fab)heavyandlightchains.NucleicAcids Res,1991,19:4133—4137. 3CaiX.GarenA.Antimelanomaantibodiesfrommelanomapa— tientsimmunizedwithgeneticallymodifiedautologoustumorcells: seleetionofspecifieantibodiesfromsingle-chainFvfusionphageli— braries.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:6537—6541. 4MarksJD,HoogenboomHR,BonnertTP,eta1.By—passingim— munization.HumanantibodiesfromV—genelibrariesdisplayedon phage.JMolBiol,1991,222:581—597. 5LecerfJM,ShirleYTL,ZhuQ,eta1.Humansingle—chainFvin— trabodiescounteractinsituhuntingtinaggregationincellularmod— elsofHuntington'sdisease.ProcNatlAeadSciUSA,2001,98: 4764—4769. (收稿日期:2002—1O-18) (本文编辑李欣)
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