肺低分化癌神经内分泌表达及其与肿瘤生物学行为的关系

肺低分化癌神经内分泌表达及其与肿瘤生物学行为的关系 上海交通大学 硕士学位论文肺低分化癌神经内分泌表达及其与肿瘤生物学行为的 关系 姓名:章晓淼 申请学位级别:硕士 专业:胸心外科 指导教师:曹子昂 20070401 肺低分化癌神经内分泌表达及其与肿瘤生物学行为的关系 摘 要 目的: 探讨肺大细胞癌和小细胞癌的神经内分泌表达差异。肺癌神经内分泌特性对肿瘤分 期及预后的影响。 方法:利用免疫组化方法对肺大细胞癌标本和小细胞癌标本进行 神经内分泌标志物检测。通过病史回顾，对肿瘤进行 TNM 分期，并对患者进行一 年生存率随访。比较大小细胞肺癌在神经内分泌上的差异及分析肺癌神经内分泌表 达与肿瘤生物学行为的关系。 结果:?肺大细胞癌 CHG 表达阴性，NSE 表达阳 性率 38.46,，S-100 蛋白表达阳性率 84.62,，SYN 表达阳性率 69.23,，TTF-1 表达阳性率 30.77,。肺小细胞癌,,, 表达阳性率为 ,,(,,,，,,, 表 达阳性率为阳性率为 ,,(,,,，,,,,, 蛋白表达阳性率为 ,,(,,,， ,,, 表达阳性率为 ,,(,,,，,,,,, 表达阳性率为 ,,(,,,。 肺大细胞癌与小细胞癌在 ,,,、,,,、,,,,, 蛋白、,,, 分泌表达上 有差异。?肺大细胞癌的肿瘤生物学行为受 ,,,、,,,,, 蛋白、,,,, , 表达的影响，其预后与 ,,, 和 ,,,,, 分泌表达有关。?肺小细胞癌的 肿瘤生物学行为受 ,,,、,,,、,,,,, 蛋白表达的影响，其预后与 ,, , 的表达有关。 结论:肺大细胞癌和小细胞癌的神经内分泌功能有明显差异。 肺癌的神经内分泌功能对其生物学行为有一定影响并可作为评估肿瘤预后的标志: 嗜铬素阳性表达的小细胞肺癌，,,, 阴性表达的大细胞肺癌，,,,,, 阳性 表达的大细胞肺癌均有较好的预后。 关键词 肺大细胞癌 肺小细胞 癌 肿瘤临床分期 免疫组化 嗜铬素 神经特异性烯醇化酶 , ,,,, 蛋白 突触素 甲状腺转录因子,, 一年生存率 1Expression Of Poorly Differentiated Lung NeuroendocrineCancer And The Relationship With Tumor BiologicalBehaviour Abstract Objective:Approah the difference of the expression of neuroendocrine between large cell lung cancerLCLC and small cell lung cancerSCLC.The effect that the neuroendocrine characteristic of lung cancer has on the tumor staging and prognosis. Method:Use the immunohistochemical method to detect the neuroendocrine marks of both LCLC and SCLC.Through case reviewgain the tumor TNM staging and follow up the one-year survival rate of the patients.Compare the difference of neuroendocrine between LCLC and SCLC then analys the relationship between the expression of neuroendocrine lung cancer and the tumor biological behaviour. Result:?In LCLCCHG is negativeNSE is positive by 38.46,S-100 protein is positive by 84.62, SYN is positive by 69.23,TTF-1 is positive by 30.77,in SCLC CHG is positive by 78.38,NSE is positive by 64.86,S-100 protein is positive by 54.05, SYN is positive by 29.73,TTF-1 is positive by 54.05,.LCLC has difference with SCLC on the expression of CHGNSES-100 proteinSYN. ? The biological behaviour of LCLC is affected by the expression of NSES-100 protein and TTF-1.The prognosis relates to the expression of NSE and TTF-1.?The biological behaviour of SCLC is affected by the expression of CHGNSE and S-100 protein.The prognosis relates to the expression of CHG. Conclusion: There is obviously difference between LCLC and SCLC.The 2neuroendocrine function of lung cancer has effect on its biological behaviour and can bethe prognostic marks of the tumor:the CHG positive SCLCthe NSE negative LCLC andthe TTF-1 positive LCLC patients have a better prognosis. Key Words: large cell lung cancer small cell lung cancer tumor clinic stageimmunohistochemical method chromogranin neuro-specific enolase S-100protein synaptophysin Thyroid transcription factor 1 one-year survival rate 3 前 言 肺癌是目前全世界最常见的恶性肿瘤，在多数发达国家中，其发病率占男性常见恶性肿瘤的首位，在女性常见恶性肿瘤中占第二、三位。在北美以及全欧洲国家，肺癌已成为男性最常见的癌症死因，同时在亚洲、拉丁美洲和非洲的发展中国家癌症死因中也日趋上升。我国肺癌发病人群主要分部在华东沿海，华北及东北工业发达的城市和地区，近年肺癌发病率及死亡率亦呈上升趋势，有报道表明，,,,, 年,,,,, 年我国肺癌发病人数增加 ,,(, 万，死亡人数增加 ,,(, 万。肺癌已成为我国最常见、增幅最大的恶性肿瘤。吸烟是肺癌最主要的致病原因。肺癌根据其病理学形态可分为非小细胞肺癌(,,,,,)和小细胞肺癌(,,,,)。其中，非小细胞肺癌约占肺癌总数的 ,,,，其又可分为鳞癌、腺癌、大细胞癌及鳞腺癌;小细胞肺癌约占肺癌总数的 ,(,,,,,,。 研究表明，在正常肺的肺神经内分泌细胞中可观察到神经内分泌的特征性表型，大部分神经内分泌的特异性肽产物，包括 ,,,,,, 脱羧基酶，嗜铬素( ,,,,,,,,,,,,，,,,)，突触素(,,,,,,,,,,,,,，,,,)，细胞浆大量的核心颗粒突触蛋白，神经细胞黏附分子，神经特异性烯醇化酶(,,,,,,,,,,;,,,; ,,,,,,,，,,,)，,,,,, 蛋白(,,,,, ,,,,,,,)以及甲状腺转录因子,,(,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,;,,, ,，,,,,,)均可作为肺细胞神经内分泌表型的特征性产物。除了正常的肺神经内分泌细胞外，一些肺癌细胞也具有神经内分泌的特性，主要包括类癌、大多数小细胞肺癌及以大细胞癌为主的一部分非小细胞肺癌。肺神经内分泌细胞可以单个或细胞小群体的形式存在，在胎儿后期和产后早期大量存在，但在成人肺中相对较少，从而表明这些神经内分泌细胞的分泌在肺的胚胎发育及肺细胞成熟过程中发挥了重要作用。但目前尚不了解哪个遗传程序诱导肺与肺癌的神经内分泌细胞分化，仅在果蝇及脊椎动物的实验中发现螺旋,环,螺旋型转录因子家族在神经元的定向及分化中发挥关键作用。当经反义寡聚核苷酸清楚肺癌细胞中的转录因子时，可显著降低神经内分泌标志物的表达。 4 虽然肺癌神经内分泌的基因研究并不成功，但很多学者在临床工作中发现具有神经内分泌特性的肺癌的生物学行为较不具有神经内分泌功能的肺癌更为恶性，因此对低分化肺癌细胞中神经内分泌特性的研究工作在国外已初步开展，但在国内这方面的研究仍较少，本课题拟通过免疫组化检测，临床病例回顾和随访，数学统计分析等方法对低分化肺癌进行神经内分泌表达的标志物检测和生物学行为的研究，从而比较具有神经内分泌特性的肺癌与不具有神经内分泌特性的肺癌在肺癌生物学行为及预后方面的异同点，为进一步的临床工作提供依据。 5 资料与方法 ,( 临床资料 病理标本 选择 ,,,, 年 , 月至 ,,,, 年 , 月在我院就诊的原发性肺癌患者中的小细胞肺癌和大细胞肺癌标本(经镜检明确诊断)，包括手术切除标本、支气管镜活检标本及肺穿刺活检标本，其中小细胞肺癌共 ,, 例，大细胞肺癌 ,, 例。 回顾资料 通过手术探察，病理检查，影像学检查等手段对以上病理标本来源的 ,,, 例患者进行肿瘤的临床 ,,, 分期，并对患者生存期进行随访。 ,( 肺癌组织细胞的免疫组织化学检测 ,(, 肺癌组织细胞嗜铬素(,,,,,,,,,,,,，, ,,)的免疫组织化学染色检测 将福尔马林固定的肺癌石蜡组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精(,,,,， ,,,，,,,)脱水后，用 ,,,, 的柠檬酸缓冲液( ,,,(,)微波处理 ,,,,, 分钟。接着用 ,(,, (,, 分钟),,,, 阻断内源性过氧化物酶。切片用牛血清处理和 ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,)洗涤后，与抗 ,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,;,,,,) 在室温下过夜反应。切片经,,, 洗涤后，加 ,,,,,,,, ,,(兔)(,,,,,; ,,,,) 在室温下孵育 ,, 分钟。最后用,,,(,,,,,;,)显色 , 至 ,, 分钟。同时，我们选用一例肾上腺嗜铬细胞瘤作为阳性对照;用 ,,, 代替一抗作为阴性对照。其中 “,”为阴性，“?”为弱阳性，“，”为阳性，“，，,，，，”为强阳性。选取典型的反应图像进行照片拍摄。 ,(, 肺癌组织细胞神经特异性烯醇化酶( Neuron-specific enolase，NSE) 的免疫组织化学染色检测 6 将福尔马林固定的肿瘤组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精(,,,,， ,,,，,,,)脱水后。接着用 ,(,, 和 ,,,,,,,,(,, 分钟)阻断内源性过氧化物酶。切片用牛血清处 理,,,,,,,,, ,,,,,, ( ,,, ) 洗 涤 后 ， 与 鼠 抗 Neuron-specific enolase (,,,,,,,;,,,,,,) 在室温下过夜反应。切片经 ,,, 洗涤后，滴加 ,,,,,,,, ,,(鼠)(,,,,,; ,,,,) 在室温下孵育 ,, 分钟。最后用 ,,,(,,,,,;,)显色 , 至 代,, 分钟。同时，我们选用以往一例神经纤维瘤组织作为阳性对照;用 ,,,替一抗作为阴性对照。其中 “,”为阴性，“?”为弱阳性，“，”为阳性，“，，,，，，”为强阳性。选取典型的反应图像进行照片拍摄。 ,(, 肺癌组织细胞 ,,,,, 蛋白(,,,,, ,,,,,,,)的免疫组织化学染色检测 将福尔马林固定的肿瘤组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精(,,,,， ,,,，,,,) 用 脱水后， ,(,, 的胰蛋白酶 (,, ,(,) 在室温下消化 ,, 分钟。接着用 ,(,, ,,,,(,, 分钟)阻断内源性过氧化物酶。切片用牛血清处理和 ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,)洗涤后，与兔抗 ,,,,,(,,,,,,,，,:,,,; ,,,,) 在室温下过夜反应。切片经,,, 洗涤后，滴加 ,,,,,,,, ,,(兔)(,,,,,; ,,,,) 在室温下孵育 ,, 分钟。最后用 ,,,(,,,,,;,)显色 , 至 ,, 分钟。同时，我们选用以往一例神经鞘膜瘤作为阳性对照;用 ,,, 代替一抗作为阴性对照。其中 “,”为阴性，“?”为弱阳性，“，”为阳性，“，，,，，，”为强阳性。选取典型的反应图像进行照片拍摄。 ,(, 肺癌组织细胞突触素(,,,,,,,,,,,,,，,,,)的免疫组织化学染色检测 将用福尔马林固定的石蜡组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精(,,,,， ,,,，,,,)脱水后，用 ,,,, 的柠檬酸缓冲液( ,,,(,)微波处理 ,,,,, 分钟。接着用 ,(,, (,, 分钟),,,, 阻断内源性过氧化物酶。切片用牛血清处理和 ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,)洗涤后，与抗 ,,,,,,,,,,,,, (,,,,,,,,;,,,,) 在室温下过夜反应。切片经,,, 洗涤后，加 ,,,,,,,, ,,(鼠)(,,,,,; ,,,,) 在室温下孵育 ,, 分钟。最后用,,,(,,,,,;,)显色 , 至 ,, 分钟。同时，我们选用一例脑神经元性肿瘤作为阳性对照;,,, 代替一抗 作为阴性对照。其中 “,”为阴性，“?”为弱阳性，“，”为阳性， 7“，，,，，，”为强阳性。选取典型的反应图像进行照片拍摄。 ,(, 肺癌组织细胞甲状腺转录因子,,(,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,;,,, , ，,,,,,)的免疫组织化学染色检测 将福尔马林固定的肺癌石蜡组织切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精(,,,,， ,,,，,,,)脱水后，用 ,,,, 的柠檬酸缓冲液( ,,,(,)微波处理 ,,,,, 分钟。接着用 ,(,, (,, 分钟),,,, 阻断内源性过氧化物酶。切片用牛血清处理和 ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,)洗涤后，与抗甲状腺转录因子,, (,,,,,,,,;,,,,) 在室温下过夜反应。切片经 ,,, 洗涤后，加 ,,,,,,,, ,,(鼠)(,,,,,; ,,,,) 在室温下孵育 ,, 分钟。最后用 ,,,(,,,,,;,)显色 , 至 ,, 分钟。同时，我们选用一例甲状腺乳头状癌作为阳性对照;用 ,,, 代替一抗作为阴性对照。其中 “,”为阴性，“?”为弱阳性，“，”为阳性，“，，,，，，”为强阳性。选取典型的反应图 肺癌临床 ,,, 分期 通像进行照片拍摄。 ,( 肿瘤分期及随访 ,(, 过病史资料(包括患者的手术资料、病理诊断资料、影像学检查资料)的整理，根据 ,,,, 年 ,,,, 肺癌 ,,, 分期对 ,,, 例患者进行肺癌 ,,, 临床分期，并根据文献报道将患者分为早期(， 期)、中期(，，,,，，，, 期) 。 、晚期(，，，,,，, 期) ,(, 生存期随访 通过电话访问，短信询问等方式了解患者自发病以来的病情变化，并对患者的生存期进行随访。本课题所研究的患者为 ,,,, 年,,,,, 年所确诊的患者，因此本课题中以从确诊之日起的一年生存率作为患者预后分析的依据。 ,( 数据统计分析 利用统计软件对数据进行卡方检验分析，,,,(,, 时认为有统计学意义，,,,(,, 8时认为有显著统计学差异。阳性率,样本阳性数,样本总数。样本阳性数,强阳性标本数，阳性标本数，弱阳性标本数。 9 结 果 ,( 免疫组织化学染色结果 肺大细胞癌 ,, 染色光镜下见瘤细胞大，胞浆丰富，核浆比例低，染色质呈泡状，常见核仁，有时可见异型巨细胞(见图 ,，图 ,)。肺小细胞癌 ,, 染色光镜下见较小的癌细胞，胞浆少，细胞界限不清，核染色质呈细颗粒状(见图 ,，图 ,) 。 图 , 肺组织内见大细胞癌浸润(,,，×,,) ,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,, ;,,;,, 图 , 异型巨细胞的病理性核分裂象(,,，×,,,) ,,,, ,,,,,,,,,;,, ,,,,,,; ,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,, ;,,, 10 图 , 肺组织内见肿瘤细胞浸润(,,，×,,) ,,,, ,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,, ;,,;,, 图 , 癌细胞有明显异型性，可见病理性核分裂相 (,,，×,,,) ,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,, ;,,;,, ,(, 肺癌组织细胞嗜铬素(,,,,,,,,,,,,)免疫组织化学染色结果 嗜铬素免疫组化染色阳性反应定位于细胞浆和细胞核中，光镜下可见铁苏木苏染色的蓝色背景中呈均匀分布的棕黄色颗粒。 11 本组样本中 ,, 例肺大细胞癌标本嗜铬素免疫组织化学染色均呈阴性反应(见图,)。,, 例肺小细 胞癌标本中嗜铬素免疫组织化学染色呈强阳性反应为 ,, 例，阳性反应(见图 ,，图 ,)为 ,, 例，弱阳性反应为 , 例，阴性反应为 ,, 例。 (见表 ,) 表 ,:嗜铬素免疫组化结果 肺大细胞癌 肺小细胞癌 强阳性 , ,, 阳性 , ,, 弱阳性 , , 阴性 ,, ,, 图 , 大细胞肺癌呈 ,,, 阴性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 12 图 , 小细胞癌呈 ,,, 阳性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 图 , 小细胞癌呈 ,,, 阳性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 13 肺癌组织细胞神经特异性烯醇化酶( Neuron-specific enolase)免疫组织化学染色结果 神经特异性烯醇化酶免疫组化染色定位于细胞浆，光镜下可见苏木苏淡染的背景中在细胞浆中呈深浅不一，棕黄色颗粒状的不均匀分布。 本组样本中 ,, 例肺大细胞癌标本神经特异性烯醇化酶免疫组织化学染色呈强阳性反应为 , 例，阳性反应(见图 ,)为 ,, 例，弱阳性反应为 , 例，阴性反应(见图,)为 ,, 例。,, 例肺小细胞癌标本中神经特异性烯醇化酶免疫组织化学染色呈强阳性反应(见图 ,,)为 ,, 例，阳 例，弱阳性反应为 , 例，阴性反应(见图 ,,)为 ,, 例。(见性反应为 ,, 表 ,) 表 ,:神经特异性烯醇化酶免疫组化结果 肺大细胞癌 肺小细胞癌 强阳性 , ,, 阳性 ,, ,, 弱阳性 , , 阴性 ,, ,, 图 , 大细胞癌呈 ,,, 阳性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 14 图 , 大细胞癌呈 ,,, 阴性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 图 ,, 小细胞癌呈 ,,, 强阳性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 15 图 ,, 小细胞癌呈 ,,, 阴性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 肺癌组织细胞 ,,,,, 蛋白免疫组织化学染色结果 ,,,,, 蛋白的免疫组化染色定位于细胞质和细胞核，光镜下呈弥漫均匀分布，深浅一致的棕黄色。 本组样本中 ,, 例肺大细胞癌标本 ,,,,, 蛋白免疫组织化学染色呈强阳性反应(见图 ,,)为 ,, 例，阳性反应为 ,, 例，阴性反应为 , 例，未检出弱阳性反应标本。,, 例肺小细胞癌标本中 ,,,,, 蛋白免疫组织化学染色呈强阳性反应(见图 ,,)为 ,,例，阳性反应为 ,, 例，弱阳性反应为 ,, 例，阴性反应为 ,, 例。(见表 ,) 表 ,:,,,,, 蛋白免疫组化结果 肺大细胞癌 肺小细胞癌 强阳性 ,, ,, 阳性 ,, ,, 弱阳性 , ,, 阴性 , ,, 16 图 ,, 大细胞癌呈 ,,,,, 强阳性反应 (,,,,,,,,， ×,,,) ,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 图 ,, 小细胞癌呈 ,,,,, 强阳性反应 (,,,,,,,,，×,,,) ,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,, ;,,, ,,,, ;,,;,, 17 肺癌组织细胞突触素(,,,,,,,,,,,,,)免疫组织化学染色结果 肺癌细胞突触素免疫组化染色定位于细胞浆，光镜下呈大片状或局灶性分布 的褐色。 本组样本中 ,, 例肺大细胞癌标本突触素免疫组织化学染色呈强阳性反应为 ,,例，阳性反应(见图 ,,)为 , 例，弱阳性反应为 ,, 例，阴性反应为 ,, 例。,, 例肺小细胞癌标本中突触素免疫组织化学染色呈强阳性反应为 , 例，阳性反应(见图 ,,)为 ,, 例，弱阳性反应为 , 例，阴性反应为 ,, 例。(见表 ,) 表 ,:突触素免疫组化结果 肺大细胞癌 肺小细胞.