应用流式细胞术研究大蒜粉对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

应用流式细胞术研究大蒜粉对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 应用流式细胞术研究大蒜粉对小鼠巨噬细 胞吞噬功能的影响 2006年6月第32卷第3期SouthChinaJPrevMed,June2006,Yo1 应用流式细胞术研究大蒜粉对小鼠巨噬 细胞吞噬功能的影响 黄琼,李志,杨杏芬,黄俊明,黄建康,蔡玟 【摘要】目的建立流式细胞术检测小鼠巨噬细胞吞噬功能的方法,探讨其在保健食品增强免 疫力功能中的意义.方法昆明种小鼠随机分为4组,其中3组分别按0.1l,0.22,0.66g/ (kg?BW)低,中,高3个剂量的大蒜粉片灌胃,阴性对照组给予纯净水,连续30d后,分离小鼠腹腔 巨噬细胞.与调理后的荧光微球孵育后,用流式细胞仪检测FITC荧光阳性巨噬细胞数来计算巨噬细 胞吞噬率,观察大蒜粉对腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球功能的影响,同时用ConA诱导的小鼠脾淋巴细 胞转化试验及小鼠迟发型变态反应试验观察大蒜粉对小鼠细胞免疫功能的影响.结果用荧光微球 技术结合流式细胞仪检测实验组和对照组的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球功能,结果显示,实验 组(大蒜粉)能明显提高小鼠巨噬细胞吞噬功能,其低,中,高3个剂量组吞噬百分率分别为(24.42? 4.10)%,(23.82?4.55)%,(29.55?5.81)%,吞噬指数分别为0.36?0.07,0.35?0.08,0.47? 0.11,均高于阴性对照组[(17.32?4.80)%,0.24?0.07](P<0.O1);各剂量组迟发型变态反应能 力均升高,低剂量组淋巴细胞转化值增高,均高于阴性对照组,差异有统计学意义 (P<0.05或P< 0.01).结论流式细胞仪检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的方法具有简便,快捷,重 复性好以及准 确率高的特点,适合在保健食品增强免疫力功能评价中推广应用. 【关键词】流式细胞术;吞噬作用;免疫,细胞;小鼠 中圈分类号:Q813文献标识码:A文章编号:1671—5039(2006)03—0019—04 AppHeaflonofflowcytomeu-ytoobservetheeffectofgarlicpowderonmacrophagicphagocytosisin miceHUANGqio,~,L1Zhi,YANGXing-fen,etai.CenterforDiseaseControlandPreventionofGuang- dang御ce.Guangzhou510300,China 【Abs嘲】 0bj~[iveToobservetheeffectofgarlicpowderonmacrophagicphagocytosisinmice utilizingtheflowcytometryandpossible叩 plicmioninhealthfoodfunctionevaluation.Methods4ran. domlydividedKunmingmousegroupsweregivenpurewaterandgarlicpowderat0. 11g/(kg?BW),0.22 g/(kg'BW),0.66g/(kg'BW)dosesrespectivelyviagavage.Theperitonealmacrophageswereob. rainedandthenincubatedincoatedfluorescentmicmsphercser30days.Thenumberof兀 TCDositive peritonealmacrophagesandthephagocytosisratewerecalculatedbyflowcytometrytoexaminetheeffectof garlicpowderonphagocytosisofperitonealmacrophages.Spleenlymphocytetransformationtestinducedby ConAandIYrH(Delayed-typeHypersensitivity)testwerecarriedouttoinvestigatetheeffectofgarlicpow. deroncellularimmunityfunctioninmice.ResultsThepercentageofphagocyticcensamonglow., medi. 蚰-,high-dosegroupswere(24.42?4.10)%,(23.82?4.55)%,(29.55? 5.81)%aswellasthe ph~socrtlcindexwere0.36?0.07,0.35?0.08, 0.47?0.11respectively.BothsignificantlyincreaSed comparedtocontrolgroup[(17.32?4.80)%,0.24? 0.07](P<0.O1).SignificantdifferenceWaSfound ofIYrHamong3dosegroups,theabilityofTlymphocytetransformationinlowdosegroupco mparedtocon- trolgroup(P<0.05.P<0.01).ConclusionTheapplicationofflowcytometrytomeaSuret hephagocy- 基金项目:广东省重点医学科技攻关专项课(粤TJ[2003]246号);广东省医学科 学技术研究基金课题 (A2003074) 作者单位:广东省疾病预防控制中心毒理实验所.广东广州510300 作者简介:黄琼(1976一),女,硕士,主管医师,主要研究方向:食品及保健食品毒理与 功能学评价 ? 19? ? 论着? ? 2O?医学2006年6月第32卷第3期utna』!:坚堡:丝::三 tosisofperitonealmaerophagesinmousewasfeasibleandCanbeusedintheimmunefunction evaluationof healthfood. 【KeyWords】Flowcytometry;Phagocytosis;Immunity,cellular;Mice 目前国内大部分实验室在检测单核-巨噬细胞 (mononuclear.macrophage)吞噬功能时仍主要采用 碳廓清实验和鸡红细胞吞噬实验来进行评价. 这两项传统的单核.巨噬细胞功能检测方法依据的 是该细胞具有吞噬异物颗粒功能的原理,尽管已在 国内沿用多年,但仍存在诸多不足之处,对快速,简 便,有效地评价单核.巨噬细胞免疫功能有一定的局 限性. 采用荧光微球技术结合流式细胞仪来检测小鼠 腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球功能在国外已较多采 用,但在国内很少见应用报道.本研究应用流式细 胞术来检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的功 能,并将该方法应用于传统保健食品大蒜增强免疫 功能的研究,为这一高通量的检测方法推广应用于 保健食品增强免疫力功能的评价提供实验依据. l材料和方法 1.1材料 1.1.1实验动物和实验室SPF级昆明种雌性小 白鼠,6,8周龄(体重:l8,22g)由第一军医大学 实验动物中心提供,合格证号:粤检证字2003A061, 颗粒饲料由第一军医大学实验动物中心提供.动物 实验室:SPF级,合格书粤检证号2003C008.室温 (22?2)?;湿度60%,75%. 1.1.2仪器和试剂流式细胞仪(FACSCalibur) 为美国BectonDickinson公司产品,配备功率为l5 mW的气冷488ilin氩离子激光管;VERSAmax全自 动酶标仪为美国MolecularDevices公司产品;德国 蔡司荧光显微镜;Carboxylate.modifiedmicrospheres 为美国MolecularProbes公司产品,由广州英伟创津 公司经销;BSA为美国Sigma公司产品;RPMI1640 培养基为GibcoBRL产品(1165062);伴刀豆球蛋白 A(ConA)为美国WorthingtonBiochemical公司产品 (50K904J);噻唑蓝(MTr)为美国Biotec公司产品 (BS0887);2%和20%绵羊红细胞(SRBC)悬液自 行制备(生理盐水洗涤3次,200Or/min,10min); 受试样品大蒜粉片由安利(中国)日用品有限公司 提供. 1.2方法 1.2.1动物给样采取随机分组方法,分别设阴性 对照组和低,中,高3个受试物组(剂量为0.11, 0.22,0.66g/(kg?BW),分别相当于人体推荐量的 5,lO,3O倍),每组l2只动物.各组每天按20mL/ (kg?BW)量灌胃,其中阴性对照组给予纯净水,受 试物组按剂量给予受试样品(样品用纯净水调配成 各剂量所需浓度),连续灌胃30d后进行各项试验. 1.2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验 (1)荧光微球(beads)预调理:1%BSA37?30min, 超声处理5min后,加人6孔培养板中,调整beads 浓度为1×10/板.(2)小鼠腹腔巨噬细胞分离:实 验前4d腹腔注射0.2mL2%SRBC(巨噬细胞激 活),实验当天以颈椎脱臼法处死小鼠,腹腔注射 3mLHankS液(含5%FBS),轻揉腹部2O次,剪开 腹部,吸取2mL腹腔洗液于6孔培养板中,调整巨 噬细胞数为(4,6)×10/板.(3)吞噬作用:巨噬 细胞与beads室温避光孵育30rain后,2mL冷PBS 液轻柔洗涤2次(洗出多余未消化的beads)后,用 细胞刮刮下尚未脱壁的巨噬细胞,收集细胞悬液, 75txm过滤器过滤,根据细胞密度用0.3,0.5mL PBS定容上机分析.(4)流式细胞仪分析:标记的 细胞经FSC和SSC在二维Dot-Plot图中划出巨噬细 胞区,然后对巨噬细胞作FITC荧光强度检测,485 nm为激发波长,530nm为发射波长,数据显示于 FL1.FSC二维散点图和FL1直方图中.每组分析 lO例动物样本,每份样本获取10000个巨噬细胞, CellQuest软件分析吞噬不同荧光微球的巨噬细胞 的比例,根据下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数. 吞噬百分率(%)=(吞噬荧光微球的巨噬细胞数)/ (计数的巨噬细胞数)×100,吞噬指数=(被吞噬的 荧光微球总数)/(计数的巨噬细胞数). 1.2.3ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验 (MTr法)按照卫生部《保健食品检验与评价技术 》(2003年)的方法进行. 无菌取脾,每组分析l2例动物样本,置于盛有 适量无菌HankS液平皿中,用镊子轻轻将脾磨碎, 制成单个细胞悬液.经200目筛网过滤,或用4层 纱布将脾磨碎,用HankS液洗2次,每次离心 10min(100Or/min).然后将细胞悬浮于1mL的 完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上),调整细胞浓度为3×10.个/mL. 将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中,每孔 1mL,一孔加75ttLConA液(相当于7.5tLg/mL), 2006年6月第32卷第3期S0uthChinaJPreyMed,June2006,Vol32,No.3 另一孔作为对照,置5%CO:,37~CCO:孵箱中培养 72h.培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液 0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640 培养液,同时加入MTY(5mg/mL)50L/孔,继续培 养4h.培养结束后,每孔加入1mL酸性异丙醇, 吹打混匀,使紫色结晶完全溶解,用全自动酶标仪以 570nnl波长测定光密度值. 1.2.4小鼠迟发型变态反应试验(足跖厚度增加 法)按照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》 (2003年)的方法进行. 致敏:小鼠用2%(v/v)SRBC腹腔或静脉免 疫,每只鼠注射0.2mL.致敏后4d,测量左后足跖 部厚度,然后在测量部位皮下注射20%(v/v)SR一 ? 21? BC,每只鼠2OL,注射后于24h测量左后足跖部 厚度,同一部位测量3次,取平均值,每组分析l2例 动物样本. 2结果 2.1大蒜粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球功 能的影响 图1是荧光显微镜下观察到的吞噬不同荧光微 球的巨噬细胞图;图2是流式细胞仪分析和数据获 取结果图;1是流式细胞计数结果统计表.表1 结果显示,与阴性对照组比较,大蒜粉3个剂量组小 鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的百分率和吞噬指数 均明显提高,差异有统计学意义(P<0.01). 吞噬1个荧光微球吞噬2个荧光微球吞噬3个荧光微球吞噬5个荧光微球 图1吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞图(400X) 1t3:总巨噬细胞群 R2:未吞噬荧光微球的巨噬细胞群 R4:吞噬1个荧光微球的巨噬细胞群 R5:吞噬2个光微球的巨噬细胞群 1t6:吞噬3个或3个以上荧光微球的巨噬细胞群 RegionStatistics RegionEverits%Gated RllOo22loo.oo R2784478.27 1t4l48414.81 R52782.77 R627O.27 1t7973197.1O 图2吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FSC-SSC和FL1-FSC二维散点图 2.2大蒜粉对小鼠细胞免疫功能的影响 表2结果显示,与阴性对照组比较,大蒜粉 0.11g/(kg?BW)剂量组的光密度差值增高,提示 淋巴细胞转化增殖能力增强;大蒜粉3个剂量组的 迟发型变态反应能力均明显提高,差异均有统计学 意义(P<O.05或P<O.01). 医学2006年6筮鲞筮坠塑』堕!盟:』坠堕Q丝:: 表1大蒜粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球 功能的影响(i?s.n=10) 与阴性对照组比较,??P<0.01 表2大蒜粉对小鼠淋巴细胞免疫功能的 影响(?s.n=12) 与阴性对照组比较,??P<O.01,?P<O.05 3.讨论 目前国内常用的巨噬细胞吞噬功能检测方法包 括小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和碳廓清实 验,但这两种实验方法结果准确度受主观人为因素 的影响较大;另外油镜下观察和计数小鼠腹腔巨噬 细胞吞噬的鸡红细胞相对工作量较大,效率较低,结 果受观察者判断的主观影响较大;再者流式细 胞仪一次获取10000个细胞与镜下人工计数100 个细胞相比较,样本的代表性大为提高,实验结果的 精度也更为可靠和保证.因此,无论从方法的灵敏 度,精确度,还是从减少实验室工作量等多方面考 虑,将小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验应用于 保健食品增强免疫功能的评价有广泛而深远的推广 意义.采用荧光微球技术结合流式细胞仪来检测小 鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球功能在国外已较多采 用.3J,但在国内很少有应用,在保健食品增强免疫 力功能评价方面也未见有应用报道.本研究采用该 方法来检测大蒜粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的 影响,结果显示:与阴性对照组比较,大蒜粉3个剂 量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球的百分率和吞 噬指数均明显提高,与相关研究结果一致】.巨噬 细胞是免疫反应中一类十分活跃的细胞,它在非特 异性免疫,细胞免疫及抗肿瘤免疫方面都起着重要 作用.目前在国外,结合荧光标记技术和FCM技术 在单核一巨噬细胞吞噬功能检测研究中的主要应用 还有:检测吞噬了含有FITC标记的调理后大肠杆菌 的单核一巨噬细胞活性_4J,检测单核一巨噬细胞吞噬 各类凋亡细胞活性',前者能反映巨噬细胞的噬 菌功能,后者与其抗肿瘤作用密切相关,值得进一步 研究大蒜在这两方面功能的作用,为更好,更广泛地 开发大蒜这一良好的免疫调节食品提供一定的理论 和实验基础.另外,本研究结果还显示大蒜粉能增 强小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力,能提高迟发型变态 反应能力,与相关研究结果一致J,这进一步说明大 蒜粉增强免疫力功能是通过多方面作用的结果. 参考文献: [1]MitsuyukiIchinose,NobumasaHam,MasashiSawada,eta1.A flowcytometricassayrevealsallenhancementofphagocytosisby plateletactivatingfactorinmurineperitonealmacmphages[J]. 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