浅论温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究

浅论温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究 浅论温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究 作者:张静， 黄怀球， 薛汝增 张晓辉 冯佩英 李美荣【摘要】 【目 的】 探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。 【方法】 将4株临床分离菌株分别接种于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg 羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5种培养基平皿上，每种培养基接种5个 平皿，分别置于25 ?、35 ?、36 ?、37 ?及38 ?含体积百分数 为5%CO2的恒温箱中培养。观察菌落生长情况并计算酵母细胞转化 率。【结果】 在38 ?，平皿转化率为25%(只有1株菌发生了转化); 在35 ?和37 ?时，平皿转化率分别是60%和85%;而在36 ?时平 皿转化率仅为45%。使用50 mg/kg羊血BHI和0.5%GSBHI培养基培 养，65%培养皿上的菌株发生了酵母相转化，使用BHI培养基培养， 45%培养皿上的菌株发生了酵母相转化，而使用SDA和PDA培养基培 养，只有20%培养皿上的菌株发生了酵母相转化。37 ?时，有3株 菌在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞 转化率均达到90%，1株菌在SDA、PDA和BHI培养基上的转化率均低 于10%。【结论】 温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素， 培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素。 【关键词】 申克 孢子丝菌; 酵母相转化; 温度; 培养基 Abstract: 【Objective】 To investigate the effect of temperature and media on mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii. 【Methods】 The clinical isolates 4 were inoculated on plates of media after reactivation. Each isolate was inoculated on plates of SDA， PDA， BHI， 50 mg/kg goat blood BHI and 5 mg/kg GSBHI， and 5 plates of each media were prepared because isolates of each meida were incubated at 25 ?， 35 ?， 36 ?， 37 ?， and 38 ?. Growth of Sporothrix schenckii was observed and rates of transformation were calculated. 【Results】 At 38 ?， the transformations rates were 25%(the only one Strain converted yeast). At 35 ? and 37 ?， the transformations rates were 60% and 85%， respectively. At 36 ?， the transformations rates were 45%. There were 13 of 20 plates converting yeast when 5% goat blood BHI and 0.5%GSBHI were used， 9 of 20 plates when BHI was used， 4 of 20 plates when SDA and PDA were used. At 37 ?， transformation rates of 3 isolates reached 90% on medium of BHI， 50 mg/kg goat blood BHI和5 mg/kg GSBHI; However， the transformation rates of 1 isolate were less than 10% on SDA， PDA， and BHI. 【Conclusion】 Temperature is the key factor that affects mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii， nourishments of media may also be necessary for transformation. 申克孢子丝菌属于双相型真菌，在自然界或室 温培养为菌丝相，在体内或37 ?培养为酵母相。申克孢子丝菌感染 可导致孢子丝菌病，不仅可以引起皮肤组织的病变，还可侵犯内脏器 官引起系统性病变，严重危害着人类的健康[1-2]。酵母相是申克孢 子丝菌的致病相，申克孢子丝菌在体内从菌丝相到酵母相的转化是致 病的一个关键步骤[3-4]。目前关于酵母相转化的研究多集中在基因 水平[5-6]，而对于与致病性同样紧密相关的生化特点研究较少。本 文研究了不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验菌株 菌株SUMS0382、SUMS0383、 BMU02035和BMU00471经形态学和分子生物学鉴定为申克孢子丝菌。 SUMS0382和SUMS0383分离自我科淋巴管型孢子丝菌病患者， BMU02035和BMU00471由北京大学真菌和真菌病研究中心惠赠，亦分 离自孢子丝菌病患者。 1.2 培养基 沙堡弱琼脂(Sabouraud? 蒺s agar， SDA)基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar， PDA) 基、脑心浸汁琼脂(brain heart infusion agar， BHI)基、含50 mg/kg 去纤维蛋白羊血清的脑心浸汁琼脂基(brain heart infusion agar plus 50 mg/kg goat blood， 50 mg/kg羊血BHI)及含5 mg/kg葡萄 糖脑心浸汁琼脂基(brain heart infusion agar plus 5 mg/kg Glucose， 5 mg/kg GSBHI)，pH值均为7.0，购自广州市迪景微生物 技术有限公司。 1.3 菌株活化 将实验菌株接种于 PDA 斜面 培养基上，在含体积分数为5%的CO2 25 ?恒温箱中培养，每隔7 d 传代1次，连续传代2次，光镜下检查菌落形态，以保证菌株的纯度 和生长活力。 1.4 酵母相转化 于超净工作台内，采用划线接种法将每株菌分别接种于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5种培养基上，每种培养基接种5个平皿，分别置于25、35、36、37及38 ?含5%的体积分数为CO2恒温温箱中培养。观察菌落生长情况，每5 d传代1次，连续传代3次。 在所有平皿上的菌株传代3次生长至第5天时，用接种环挑取少量菌落，置于灭菌载玻片上，滴加乳酸酚棉兰或酚红染色后，置于光学显微镜下观察菌落形态。参照文献计算每个平板上菌株的酵母细胞转化率，转化率 10%为酵母相转化成功。 1.5 统计学 利用精确概率法对所有菌株在不同温度和培养基下转化率的差异进行统计学分析，统计软件使用SPSS 16.0， P 0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 菌株活化 4 株申克孢子丝菌经活化后均生长良好，形成棕褐色有皱褶的典型菌落。 2.2 酵母相转化 2.2.1 申克孢子丝菌在不同温度的酵母相转化 在25 ?的培养条件下，5种培养基上生长的菌株均现为明显的丝状菌落，不能转化为酵母相。在38 ?时，25%培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化(为菌株BMU00471，其余菌株均不能生长)。35 ?和37 ?时分别有60%(/20)和85%(17/20)培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化。36 ?时仅有45%(9/20)培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化(表1)。菌株在各温度下的转化率的差异具有统计学意义(P 0.001)。在光镜下计数不同温度时50 mg/kg羊血BHI培养基上生长的4株申克孢子丝菌酵母细胞的转化率，发现所有菌株在35 ?和37 ?的转化率均明显高于36 ?和38 ?，对于菌株BMU00471，其在35 ?和37 ?的转化率均可达到90%;38 ?时所有菌株的转化率最低，菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035均低于10%(图1)。不同温度下的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 , 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢。在含5%去纤维蛋白羊血清的BHI培养基上，菌株BMU00471在35、36、37和38 ?均可以转化为酵母相。在35 ?和37 ?时，酵母细胞生长良好，光镜下观察发现90%的菌丝可转化为酵母细胞;在36 ?，酵母相菌株生长相对缓慢，光镜下仍可见到较多的菌丝片段和孢子;在38 ?，菌株生长速度较36 ?时快，但在光镜下发现转化的酵母细胞数量较 36 ?少(图2)。