呋喃妥因和呋喃唑酮在食品中残留的酶联免疫测定法的研究(可编辑)

呋喃妥因和呋喃唑酮在食品中残留的酶联免疫测定法的研究(可编辑) 呋喃妥因和呋喃唑酮在食品中残留的酶联免疫测定法 的研究 山东大学 硕士学位论文 呋喃妥因和呋喃唑酮在食品中残留的酶联免疫测定法的研究 姓名:刘围 申请学位级别:硕士 专业:无机化学 指导教师:郗日沫 20080520山东大学硕士学位论文 仃.;;如;; : 符号说明 冲 辣根过氧化物酶 牛血清白蛋白卵清蛋白 乙二胺活化的牛血清白蛋白 碳二亚胺 一一一锄 羟基琥珀亚胺 ?却曲 鹏 磷酸盐缓冲液 酶标板洗液 邻苯二胺 ?血 ?匝 ,?二甲基甲酰胺 ??廿 ’ 弗氏完全佐剂氓 ’ 弗氏不完全佐剂 由锄酶联免疫吸附测定法 巧?墩 .氨基乙内酰胺 跗血 . ... 氨基..恶唑烷酮 . 嘶扬 氨基脲呋喃西林代谢物 .吗啉基甲基..氨基..恶 .删印证.一.一 唑烷酮检测限 高效液相色谱法 曲南. 液质联用 孕印? 而 乙二胺 衄 舳眦半抑制率抑制率%的时候药物的浓度 . .羧基苯甲醛 . 们 邻硝基苯甲醛 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下,独立进行研 究工作所取得的成果和除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本论文的研究作出重要贡 献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律责任由本人承担。 日 论文作者签名: 窒国 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留 允许论文被查阅和 或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文全部或部分内容编入有关数据 库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论 文。 保密的论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名: 期:舢,?/.幽 导师签名:甓.辞书埠日山东大学硕上学位论文 中文摘要 随着经济的迅速发展,人民的生活水平不断提高,对肉蛋类产品的需求量大 大增加,因而现代的养殖业得到了迅速发展。硝基呋喃类药物是人工合成的 广谱 抗生素,因其价格较低且治疗效果好,一些经营者为追求经济利益,而广泛用 于 畜禽及水产养殖业,并作为治疗药物和饲料添加剂。但是多年来的研究表明, 硝 基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌、致畸、致突变性,这些药物的大量使用不 可避免的残留于动物的肉、蛋、奶、脏器、组织中,从而影响人体健康,所以世 界上许多国家,比如欧盟、美国、中国、日本等都严格控制硝基呋哺类药物用于 畜禽及水产养殖业。因此食品安全问已引起全世界的高度重视。 现在很多国家已经建立了一些药物残留的检测。传统检测硝基呋哺类药 物残留的方法包括、.、.、..等仪器法。这些 可以作为标准方法,但仪器设备昂贵,样品前处理复方法准确、稳定、可靠, 杂、 费时、费力、不易普及,因此必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。酶联免疫 检测法克服了以上方法的缺点,是一种快速、灵敏、方便的检测方法, 有着广阔的发展前景。因此,本论文旨在建立呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物 的酶联免疫吸附检测法。 对于呋哺妥因及其代谢产物免疫原的制备,根据其结构特点,从其 代谢产物出发,采用多种方案与载体蛋白偶联,通过免疫只有混合酸 酐法合成的免疫原是成功的。它是利用削先与偶联引入一羧基,然 后利用混合酸酐法与载体蛋白合成了免疫原。合成免疫原的同时,也利用相同的 方法合成了多种包被抗原。利用混合酸酐法合成的免疫原免疫新西兰白兔获得了 能同时检测呋喃妥因和舢?以衍生物??的形式存在的抗体,得到 的抗体分别与多种包被抗原进行交叉测定,结果利用戊二醛法合成的包被抗原进 行检测灵敏性及特异性较好。对呋喃妥因抗体其检测结果为: 是. 咖,检测限为.呲。该抗体除对和删的交叉反应率 较高外,和其他药物的交叉率均较小。呋喃妥因在养殖用水中的添加回收率批内 在.%之间,批间在?%之间。批内变异系数在...%之间, 之间。对抗体其检测结果为:转化为 批间变异系数在..% 计算是. 检测限为. /。该抗体除对皿和呋山东人学硕十学位论文 /, 喃妥因的交叉反应率较高外,和其他药物的交叉率均较小。在猪肝中的添 加回收率批内在.%之间,批间在?%之间。批内变异系数在 ...%之间,批间变异系数在...%之间。 对呋喃唑酮及其代谢产物的研究,其免疫原和包被抗原的合成方法, 与呋喃妥因及其代谢产物的相似,也是从代谢产物出发,利用多种方案合 成了免疫原,通过检测免疫后得到的抗体,用混合酸酐法合成的免疫原免疫得到 的抗体,用戊二醛法合成的包被抗原进行检测结果较好,免疫得到的抗体可以同 时检测呋喃唑酮及其代谢产物。对呋喃唑酮的抗体其检测结果为:是 . 咖,检测限为. /。该抗体除与和的交叉反应 率较高外,和其他药物的交叉率均较小。呋喃唑酮在养殖用水中的添加回收 率批 内在.%之间,批间在?%之间。批内变异系数在..%之间,批 间变异系数在...%之间。对抗体的检测,我们只做了灵敏性及特异 性的分析,其检测结果为:转化为计算是. /,检测限为. 咖。该抗体除对和呋哺唑酮的交叉反应率较高外,和其他药物的交 叉率均较小。 通过对硝基呋喃类药物的研究,我们成功地制备了呋喃妥因和呋喃唑酮及其 代谢产物的免疫原和包被抗原,并通过动物免疫制备了相应的多克隆抗体, 建立 了呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物的酶联免疫检测法,并用于实际体系检 测, 检测结果显示该方法的重复性、精确度、准确度较好。 关键词:呋喃妥因;;呋喃唑酮;;酶联免疫检测 山东大学硕学位论文,, .,,叩 . ,知胁 砌盯.扎 毋‘ 仃 嬲 . 、? 皿 向酏如 、疵,? 甜诅锄 、,?碰..,仃璐】 仃 ,嬲,如【锄 印. . 疵姘., 璐,龇 】 舡谢 .位谊 唧、、趾 ? 晰 锄 .,. ,, ,骶衄,锄 锄叩 肌 .., 嬲唱 . 洫 ,, 培. 街锄 ?丑’?陀. . 卸妇 . ? 也 仃如玎 仃。缸锄 虢 廿 , 印 ? 如 : 锄血, 嬲 . 印 锄 ? 【. 印 “ .曲矗. 仃诅铀 珊 证 证.?::吼 仃叶 、? 锄 够山东大学硕上学位论文 晰廿也 .‖儿 雕岍 . , , 如 .‖.?廿 硒打如砌抽 埘 , ? % % ? . 锄 卜 .?.% .?.% 仃. . 仃 南毋、.咖 诎 谢 仃狮 也 缸。矗岫锄 仃。如锄. 狮嬲.咖 、析 % .%? ?%缸., 觚 .?.% .?.% .醛.腿,、? 砌 鹤?蚰 锄曲。缸锄 锄 撕锄% 趾.雒“ 也曲也印 如. 缸讹锄 . 矗帕, 卸 够 谢 .‖协 髂诵油 雒 伽叩。啪 . 嬲./儿. 凡 陀 . 巧 降% %.锄 . ..%.?%氨订硫 订. 、忱锄 时州 晰 ./止锄 缸讹.. 、, ‖ . 玛 向 删 扛锄孤 . 弱,伽 如.协 【 . 山东大学硕士学位论文 : 仃.;;如;; 符号说明 冲 辣根过氧化物酶 牛血清白蛋白卵清蛋白 乙二胺活化的牛血清白蛋白 碳二亚胺 一一一锄 羟基琥珀亚胺 ?却曲 鹏 磷酸盐缓冲液 酶标板洗液 邻苯二胺 ?血 ?匝 ,?二甲基甲酰胺 ??廿 ’ 弗氏完全佐剂氓 ’ 弗氏不完全佐剂 由锄酶联免疫吸附测定法 巧?墩 .氨基乙内酰胺 .跗血 ... .氨基..恶唑烷酮 嘶扬 氨基脲呋喃西林代谢物 .吗啉基甲基..氨基..恶 删印证.一.一 . 唑烷酮检测限 高效液相色谱法 曲南. 液质联用 孕印? 而 乙二胺 衄 舳眦半抑制率抑制率%的时候药物的浓度 . .羧基苯甲醛 . 们 邻硝基苯甲醛 山东人学硕士学位论文 第一部分前言 第一章硝基呋喃类药物概述 硝基呋喃类舢药物是一种广谱抗生素,它有非常好的抗菌作用 和药动力的特性,因价格较低且效果好,而被广泛应用,作为猪、禽类和水产促 生长的添加剂。它主要用来治疗由大肠杆菌或沙门氏菌所引起的肠炎、疖疮、赤 鳍病、溃疡病等,药效稳定,能抑制或杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌,并对某 些原虫、真菌有一定作用。硝基呋喃类药物常见的有种,即呋喃唑酮 、呋哺它酮、呋喃妥因仃啪和呋喃 西林仃。缸,代谢产物分别为、?心?、、,其结构式 见图卜。硝基呋喃类药物被动物服用之后,原药分子在动物体内迅速代谢,其 在体内的稳定性不超过几小时,代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结 合态,结合态可长期保持稳定,从而延缓原药在体内的清除速度。而普通的食品 加工方法如烧烤、微波加工、烹调等难以使蛋白结合态残留物大量降解,食 用含有该残留物的肉制品会对人体产生一定的毒副作用。以呋喃唑酮为例,蛋白 结合态的呋喃唑酮残留物含有称为.氨基..唑酮的完整侧链,在人胃 的弱酸性条件下,侧链可以从蛋白结合态的母体分子上解离下来,可以代 谢成为伊羟乙基肼,该代谢物是致突变、致畸和致癌化合物【,。 世界上许多国家限制甚至禁止使用此类药生产动物源性食品,并规定了其在 动物源性食品中的检验检疫标准。欧盟已于年禁止在食用动物中使用硝基 呋喃类抗生素,在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。年 美国公布了禁止在进口动物源性食品中使用的种药物名单,包括呋喃 西林和呋喃唑酮。我国也于颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。 年底我国进出口食品检验检疫局对出口欧盟的肠衣及肉类产品增加了硝基 呋喃呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因代谢物项目的检测【。尽管 我国政府和相关组织对该类药物的残留给予了高度重视,但硝基呋喃类药物在水 产动物源性食品中的残留仍时有发生。我国出口欧盟的鱼、虾等水产品都曾被检 出呋喃唑酮药物的残留,严重制约了我国动物源性食品的出口,损害了我国畜牧 业、水产业的良好形象。年的致癌多宝鱼事件,上海市公布了对件冰鲜 件样品中全部被检出硝基呋喃类代谢物。随后, 或鲜活多宝鱼的抽检结果, 山东大学硕士学位论文 北京市场的多宝鱼也相继检出此类问题。与此同时,广州市场多宝鱼抽检结果: 个多宝鱼样品全部含有硝基呋哺类代谢物。因此,为了保障人民身体健康, 保证进出口水产品的质量,有必要寻求一种快速灵敏方便的筛选检测方法。 、八 ? :、凡 八\ ??眦 /\卢 酬妞。 图.:硝基呋喃类药物母体及其代谢产物的结构式 觚 仃讪 咖 第一章硝基呋喃类药物的检测方法 随着社会的发展,人们生活水平质量不断提高,因而人们对食品质量安全问 题也越来越重视。为确保进出口及国内市场上动物性食品禽肉、鱼、虾等的食用 安全,需要快速准确的残留量分析方法。目前文献报道的呋喃类药物残留的分析 方法主要有:、.和酶联免疫法。 第一节仪器法 ..高效液相色谱法 :学位论文 山东火学硕 是世纪年代发展起来的一项高效、快速的分离分析技术,是 国际上药物残留检测中的常用方法。 高效液相色谱在经典的液体柱色谱基础上 引入了气相色谱法理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器, 实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。 等人利用这种方法测 定人的血浆和尿液中呋哺妥因的含量,在血浆中最低检测限为.‖咖, 等人利用高效液相色 在尿液中的最低检测限为.‖鲈【。. 谱结合电化学检测方法测定呋喃妥因,呋喃唑酮和呋哺它酮在牛奶中的残留量, 回收率都在%以上【】。高效液相色谱法检测的基本过程是将样品粉碎后利用 有机溶剂或其他方法去除水分,再用有机溶剂如乙酸乙酯洗脱,然后浓缩、 流动相溶解、净化、上机检测,虽然目前有利用固相萃取柱对溶液进行 浓缩净化,但其仍涉及到大量的有机溶剂处理,过程比较复杂,周期也比较 长, 不能满足出口产品快速批量检测的要求。 ..液相一质谱联用法. .也是药物残留检测中的常用方法。 .和. 衄利用高效液相色谱结合紫外及质谱检测法测定动物食品中呋喃唑酮的 残留,检测限可达 回收率都在%以上。 等人 , 瓜 利用高效液相色谱.串联质谱法..测定家禽及蛋类食品中硝基呋喃 检测限可以达到. 类代谢物的残留, ‖【】。荷兰瓦郝尼罕??.实 验室建立了完整的.法检测呋喃唑酮代谢物【刀。等【,】进一步 对该方法进行改进,利用简化了衍生后的呋喃唑酮代谢物的提取 过程,再用.法进行定性分析,对检测猪肝中呋喃唑酮代谢物的不 同方法进行比较研究,表明利用法和.法测定的结果基本 相同。目前,、.相关联的提取方法已经得到改良,并通 过一系列的加标样品研究得以验证。徐维海等【】采取.法研究呋喃唑酮 及其主要代谢产物在罗非鱼体内的残留规律,利用该方法对呋喃唑酮及其 代谢物的检出限分别为‖/【卧‖/【。法可以利用待测分 子的结构来定性,可以排除酶联免疫方法和法检测的假阳性结果,用以 确证检测结果。这种方法的检测过程同法基本是一样的。 无论是还是.都有高灵敏度、高特异性的特点,但是它们需要 昂贵的仪器,大量的有机溶剂,繁琐的衍生化及费时的样品处理过程,所以它 们 山东大学硕士学位论文 很难能用于大规模的常规检测。 第二节生物免疫检测法一酶联免疫法 ..酶联免疫吸附测定法基本原理 酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术,其先将抗体或抗原包被到某种 固相载体表面,并保持其免疫活性。测定时,将待检样本和酶标抗原或抗体按不 同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应,后加入酶标抗体与免疫复合 物结合,用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分,最后加入酶反 应底物,根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度值的大小进行定性或定 量分析的方法。 .. 的特点 虽然现在用于药物残留的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、液相一 质谱联用法、微生物法等,但它们要么灵敏度低,要么仪器价格昂贵,操作繁琐, 而法与这些方法相比有着其独特的优点。对批量样品的残留检测而言, 通常首要进行筛选性检测分析,然后对样品用常规分析或确证分析进行定性或定 量分析。免疫检测分析具有经济、快速、技术要求低的特点,其要求抗 原抗体分子结构有互补性,具有高度特异性,检测限可以达到至水平级, 在仪器设备要求不高的条件下,便可观察和检测到抗原抗体的特异性结合,非常 适用于检测痕量水平的药物残留,因而具有极为广泛的应用前景。另一方面, 常 规分析中,分析成本大部分产生于样品的处理净化过程,而免疫检测具有高度敏 感性和特异性,可以在最大程度上减少样品的前处理过程,提高检测速度,继而 实现在不增加检测费用的前提下,增加检测的样品数量,可以消除或大大降低常 规分析中产生的大量有机溶剂污染,并且固相免疫检测具有易于自动化的优点 【】。食品安全分析的发展方向是快速、灵敏、简便。分析与其它方法相 ,易于推广。酶联免疫检测法是在放射免疫分析技术的发展过程中取比简便 其精 华、去其糟粕而产生的一项新的免疫学技术。它的优势在于灵敏度高,特异性强, 仪器设备要求不高,测定成本低,方法快速、简便,试剂保存时间较长,自动化 程度高,无放射性同位素污染和可现场操作等优点。在药残检测过程中, 是对仪器法的一种必要补充。法的优点可总结为如下几点: . 高特异性,高灵敏性; 山东大学硕十学位论文 . 检测范围在至水平,属于超微量分析技术; . 结果准确,重现性好; . 廉价,方法操作简单; . 易商品化; .检测速度快。 因此在检测技术日益趋向于高技术化、速测化、便携化和易商品化的今天, 在人们对食品质量要求越来越高的条件下,研究酶联免疫测定方法具有直接 的经 济效益和社会效益。 .. 检测类型 操作步骤不同,有间接法、直接法、双抗体夹心法、 根据检测目的的不同, 捕获法等类型,本实验主要采用间接法。 :用于检测未知抗体的间接法 方法一 . 包被:用. , .的碳酸盐包被缓冲液将已知包被抗原稀释 至一定浓度,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加止/孔,?过夜。次日,弃 去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗次,“/孔,每次分钟。简称洗涤,下 同; . 封闭:用%封闭上述已包被的酶标板,“/孔,室 温孵育.小时,然后洗涤; . 加样:加一定稀释的待检样品未知抗体 /孔于上述已封闭的 反应孔中,置?孵育小时或室温.小时,然后洗涤。同时做空白孔, 阴性对照孔及阳性对照孔; . 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体抗抗体 “/孔。?孵育.~小时或室温.小时,洗涤; . 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的底物溶液 / 孔,室温.分钟; . 终止反应:于各反应孔中加入 盐酸止/孔; . 处,以空白对照孔调零后 结果判定:在检测仪上,于 ,若大于规定的阴性对照值的倍,即为阳性。 测各孔值 方法二:用于检测抗原的间接竞争法 . , .的碳酸盐包被缓冲液将已知包被抗原稀释 包被:用. 山东大学硕士学位论文 至一定浓度,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加“/孔,?过夜。次日,弃 去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗次,此/孔,每次分钟。简称洗涤,下 同; . 封闭:用%封闭上述已包被的酶标板,此/孔,室 温孵育小时,然后洗涤; . 加样:加一定稀释的待检样品抗体和半抗原“/孔于上述己封 闭的反应孔中,置? 孵育小时或室温小时,然后洗涤; 其它的步骤同方法一的、、、。 其它的方法还有三明治法、直接法测抗体、捕获法测抗体等。 ..免疫原的制备 在酶联免疫检测中,免疫原、抗体、酶标记物的制备是三个最关 键的基本要素,尤其是免疫原的制备,因为没有好的免疫原,就不会产生好的抗 体,因此在酶联免疫检测中,制备出好的免疫原是尤为重要的。通常 凡具有免疫原性的物质,其分子量常大于,而一般药物小分子的分子量小 于,只具有免疫反应性,不具有免疫原性,因此,有机小分子必须与大分 子载体偶联后才具有免疫原性。 ...载体的选择 免疫原制备中用作载体的物质较多,主要包括以下几类: :人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋 蛋白质类载体 白、血蓝蛋白以及人、牛和鸡一球蛋白等均可作为载体。这 些载体免疫活性较强,有商品供应,容易获得,操作也较方便,而且蛋白质上有 可以与半抗原结合的游离氨基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基 等活性集团。 多肽类聚合物:这类聚合物是人工合成的多肽聚合物,主要有多聚赖氨酸、 多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸等,可与半抗原结合一所形成的免疫原可获得高滴 度、高亲合度的抗血清。 大分子有机化合物和某些粉末:如聚乙烯吡咯酮、淀粉、硫酸葡聚糖、羧甲 基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒、乳胶和炭末等,可吸附半抗原,也可用来作为载 体,但用这类载体合成的免疫原免疫动物,所获抗血清的质量不稳定。 ...免疫原连接方法山东人学硕上学位论文 物理方法 物理方法是一些大分子载体,例如淀粉、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等通过 电荷和微孔吸附半抗原,但用这类载体合成的免疫原免疫动物,所获抗血清的质 量不稳定,所以一般不用该方法制备免疫原。 化学方法 目前,用于免疫原化学合成的方法有很多。主要有:活化酯法、混合酸酐法、 重氮化法、对氨基苯甲酸法、环状二元酸酐法、同型双功能团试剂、异型双功能 团试剂等。 活化酯法常用的试剂有和,,】主要用于水溶性的反应体 系中,而【,】主要用于油溶性溶液,此方法主要用于含有羧基和氨基的化 合物的偶联,在半抗原和载体蛋白之间形成肽键;混合酸酐法主要用于有机物分 子中游离羧基和蛋白质中游离氨基的偶联,主要试剂是氯甲酸异丁酯或氯甲酸乙 酯,又称氯甲酸异丁酯法【,,在我们的研究中我们用该方法成功的合成了呋喃 妥因和呋哺唑酮及其代谢产物的免疫原;重氮化方法主要用于苯环上有氨基的化 合物,先将氨基重氮化后再与载体蛋白质的酪氨酸残基偶联,例如克伦特罗免疫 原的合成【】;对氨基苯甲酸法主要用于带有酚羟基的半抗原的修饰;环状二元酸 酐法,主要用于带有羟基、伯氨基和仲氨基的修饰,此方法常用的试剂有琥珀酸 酐【,和戊二酸酐【;同型双功能团试剂有很多种,文献报道比较多的有戊二 醛、,’.羰基二咪唑、,.丁二醚法等,戊二醛主要用于含 有氨基的有机小分子与蛋白质载体的氨基偶联【,,在我们的研究中我们用该方 法成功的合成了呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物的包被抗原;法主要用 于在无水的条件下活化含有羧基或羟基的小分子,活化效率非常高【,】;,. ,通常用于含有酚羟基、巯基、氨基等官能团的连接。异型 丁二醚法【 双功能团试剂也有好多种,但这些试剂主要用于巯基和氨基之间的偶联,文献报 道比较多的是【,剐,该试剂活化巯基的速率非常高。 除了以上总结的一些方法外,还有很多方法可用于免疫原的合成,至于在合 成时选择什么样的方法,这就需要我们根据半抗原的官能团进行确定。 ...免疫原的鉴定方法 在有机小分子半抗原的酶联免疫分析中,人工抗原的合成是制备抗体最关键 的步骤。人工抗原合成的鉴定是必须的工作,目前测定的方法主要有紫外吸收法 山东大学硕上学位论文 【、红外光谱法【】、核磁共振法【】、同位素示踪法【、凝胶电泳法等。核磁共 振法无法鉴定免疫原合成是否成功,因为免疫原都是小分子与大分子蛋白偶联, 大分子蛋白结构复杂,受多种化学环境的影响裂分多,化学位移复杂,用核磁 共振法很难分析,但是可以鉴定小分子的修饰是否成功,例如本研究中, 等中间体的鉴定就用了核磁共振法;凝胶电泳法当大分子偶联的小分子 较少时,也很难测定。目前国内常用的鉴定方法为紫外吸收法,本研究免疫原 的 合成也主要利用了此方法。 ..硝基呋喃类药物酶联免疫检测的研究现状 国内外利用酶联免疫吸附检测法检测硝基呋喃类药物是近几年刚刚兴起的, 目前文献报道最多的是检测呋喃唑酮代谢物的残留,年,年发表了几 篇文章介绍了酶联免疫法检测呋喃西林代谢物的残留。沈美芳等人利用酶联 免疫 法测定水产品中呋哺唑酮代谢物的残留,最低检测限为.耀皿,平均回 %【”】。在年,欧盟一些成员国成立了名为的组 收率超过 织,专门研究呋喃类药物及其代谢物的检测方法。 .等人首次成 功合成了呋喃唑酮代谢物的免疫原,从代谢物出发,利用混合酸酐法合成了 免疫 原,并成功制备了针对的衍生物的多克隆抗体,利用直接 对抗体进行检测,可以达到.蛐旧。 .接下来又用 酶联免疫法做了虾样中的残留,检测限为.‖瓜,并结合?测定 的假阳性率【。 墩和 .利用一种简化的样品 处理方法定量测定多个实际体系中的残留量,检测限可达.‖/‖。呋 喃唑酮酶联免疫检测法的建立为硝基呋喃类其他药物的检测奠定了基础。 年 .发表了一篇文章介绍了酶联免疫检测法的建立,同样用 混合酸酐法合成了免疫原,对制备的抗体进行测定,为.旭肚,检测限 .等人于年发表的一篇文章介绍了利用直接 可达.‖/【。 和间接法检测食品中的残留,该文利用法合成的免 疫原,制备的抗体利用直接和间接法进行了各项指标的检测,回 等人通过与对羧基苯甲醛 收率范围在...%之间【。讪 偶联再与载体蛋白连接制备了针对与对羧基苯甲醛偶联物的单克隆抗体 【 硝基呋喃类药物虽然在动物体内迅速代谢,我们在检测动物肌肉组织中药物山东人学坝学位论文 残留主要是检测其代谢物的残留,但是有些养殖户将药物加入到养殖用水或饲料 呋喃妥因及 中作为添加剂,所以我们有时候需要检测水或饲料中母体的残留。 其代谢物,呋哺唑酮及其代谢物的酶联免疫吸附检测法是本论文主要涉及到的研 究内容,呋喃妥因在养殖用水中的残留检测的文章己发表【】,检测结果在下面的 实验及结果讨论部分中有详细地介绍。 ..本论文目的和思路 本论文的目的为建立硝基呋喃类药物中呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物 在食品中残留的酶联免疫检测法,为商品化生产硝基呋喃类药物酶联免疫检测试 剂盒奠定基础。 论文设计思路图.:将不具有免疫原性的小分子与大分子蛋白载体偶 联,制备具有免疫原性的全抗原,再制备针对该硝基呋喃类药物的高特异性 的多 克隆抗体,进而通过检测抗体的各项指标,从而建立组织样品中硝基呋 喃类药物残留的检测体系。 / .\ / \ 丫一 图?:本论文的设计思路 追 咖 . 山东大学硕士学位论文 第二部分实验部分 第一章实验 第一节实验材料与设备 ..实验试剂及实验耗材 呋喃妥因 .胁,,公司产品 一锄 ,.,公司产品 呋喃唑酮,,公司产品 .锄:血..,,公司产品 呋喃它酮,,公司产品 舢订一甜印一一血。一,,鲫公司产 品,购自北京百灵威化学技术有限公司 呋喃西林们如,,舯公司产品, .,即:公司产品 邻一硝基苯甲醛.仃,,.,罂公司产品, 购自北京百灵威化学技术有限公司 一羧基苯甲醛.训,,.,购自上海点耀化 学试剂有限公司 牛血清白蛋白硫九 】血,,纯度%,鄹公司产品,购 自北京欣经科生物技术有限公司 卵清蛋白眦血,,罂公司产品,购自北京欣经科生物技术有限公 司 , 碳二亚胺一锄砷 ,.,孕公司产品,购自北京欣经科生物技术有限公司 .加血 ,.,纯度三%, 对氨基苯甲酸 公司产品,购自北京舒伯伟化工仪器有限责任公司 一羟基琥珀酰亚胺?岫,,.,曲,, 纯度%,舯公司产品,购自北京欣经科生物技术有限公司 乙二胺 ,,分析纯,购自济南光芒化学试 剂有限公司 山东火学硕士学位论文 氯甲酸异丁酯 咖,‖儿.一.,化学纯,购自 上海飞翔化学试剂有限公司 三正丁胺,,锄, .,‖.?.,购自中国医 药上海有限公司 戊二醛 】,.,%水溶液,生化试剂,购自中国 医药上海有限公司 ,一二甲基甲酰胺州晦册锄,,,天津科密欧化学试剂开 发中心 甲醇,乙醇化学纯,购自济南盛林化学试剂有限公司 透析袋最大允许透过分子量,,肿公司产品,购自北京舒伯伟化工 仪器有限责任公司 孔聚苯乙烯酶标板:上海生工生物工程技术服务有限公司 ..主要仪器设备 紫外可见分光光度仪 们,公司 .,上海亚荣生化仪器厂 旋转蒸发仪 台式真空泵.?,巩义市英峪予华仪器厂 ,最大转速印,上海安亭科学仪器厂 台式离心机 氮气纯度?.%,压力之. ,济南德洋特气有限公司 磁力搅拌器乃.型恒温磁力搅拌器,上海雷磁新经仪器有限公司 冷冻干燥机.,北京博医康实验仪器有限公司 ,公司 核磁共振仪 .精密计:上海精密科学仪器有限公司 电子天平:北京赛多利斯仪器系列有限公司 , 冷冻离心机:如 ..主要缓冲溶液的配制 , .的配制:. ,. 磷酸盐缓冲液. ?,. 溶于 儿蒸馏水中 ?,. , 硼砂缓冲液 .的配制:. ?,. 止蒸馏水中 溶于 包被液缓冲液:.碳酸盐缓冲液 州 . , 山东人学硕士学位论文 封闭液: %卵清蛋白.%/ . . 柠檬酸缓冲液: 醋酸钠柠檬酸 显色液: 邻苯二胺也柠檬酸钠缓冲液‖过氧化氢% 终止液: 盐酸 第二章偶联物的制备 第一节呋喃妥因及其代谢产物的偶联物的制备 ..活化牛血清白蛋白的制备 . 将 ‖乙二胺慢慢滴入冰冷的 , .磷酸盐缓冲液中,一?搅拌,向该溶液中逐滴加入浓盐酸,调 和 至.;称取 ‖ ‖加入上述 的溶液中,室温反应小时。反应完毕后,取上清液于??透析。先后用 . .缓冲液和蒸馏水透析五天,每小时更换一次透析液。将透 , 析后的溶液冻干,得白色絮状固体,?保存待用。 .. 衍生物的制备图. ?剐?的合成:将 蚴一羧基苯甲醛溶于 . . ,得液。将 姗溶于 甲醇中,得液。将 甲醇中 、液混合,搅拌,于?回流,跟踪,约小时反应结束。旋转蒸干 后加入约儿乙醇洗涤抽滤。 ?的合成同的合成 ..呋喃妥因及其代谢产物免疫原的合成 呋喃妥因及其代谢产物趾免疫原的合成通过七种方案来制备,如图 ?。但是通过免疫只有第七种方案合成的免疫原产生的抗体具有良好的灵敏 性 和特异性。 第七种方案合成的免疫原.是通过混合酸酐法来制备的【。步 骤如图.:称取 溶于 无水?中搅 . 拌溶解,加入‖. 三正丁胺,冰浴反应分钟,然后逐滴加入础 . .‖溶 氯甲酸异丁酯,室温反应小时。称取 于 %中,将活化好的逐滴加入溶解了的中,于 .缓冲液和蒸馏水 一?反应小时。反应结束,先后用. , 山东人学硕上学位论文 透析天,期间更换透析液,以便较好除去未反应的小分子。透析后,反应液冷 冻干燥。紫外吸收可初步鉴定偶联是否成功。 、七啪汕一啪砒一女八 ?’ ’ ’ 、八。旦唑钆 ? ’ 子椰 棚 图.:灿的衍生物和合成的实验步骤 聆., ??’ ????? 广、 骼/沙 卜\太 、 ,、/ ~。一璐‖纣 , 伽 ??’ ???????????卜 步?咚一 ?一 咧争。 ? 由 鱼. . . 一. . ?. 一 ?一岛 。 卜 旨 坐 ’ 陷/符一锚乳呔 ? 山东火学硕士学位论文 八 ~八毪儿 ?扣丛 四妒《一瓷哥一伽啦 哥矗叮哥一各员趴 ? 父 忖 砂『\太 、 ?一竺墨唧?威 ? 弋?。 ? 透析 ??????? 一 ?啪氏一奄 。凡飞 :呋喃妥因及其代谢产物舢?免疫原合成的实验步骤 图 仃】 ...呋喃妥因及其代谢产物包被抗原的合成 ?的合成同的合成 山东大学硕士学位论文 ?呋喃妥因及其代谢产物趾包被抗原的合成 在合成呋喃妥因及其代谢产物免疫原的同时,我们也用七种方案 合成了包被抗原,载体蛋白换为,但是只有用戊二醛法合成的包被抗原来 检测混合酸酐法合成的免疫原免疫兔子得到的抗体时,抗体显示良好的灵敏 性和 特异性。戊二醛法制备包被抗原?.步骤如图.: , 称取.‖卵清蛋白溶在硼砂缓冲液. .中,搅拌溶解。称取. .瑚触加入上述溶液中,然 后量取. %的戊二醛逐滴加入到上述溶液中于室温反应小时。先后 用. .缓冲液和蒸馏水于一?透析五天,每小时更 , 换一次透析液。将透析后的溶液冻干,得到固体粉末。 ? 。‖ 分?乒 一 .:戊二醛法合成呋喃妥因及其代谢产物??包被抗原的实验步骤 图 ?.,】【 曲 也 第二节呋喃唑酮及其代谢产物偶联物的制备 .. 衍生物的制备图 甲醇中, ?的合成将 .衄一羧基苯甲醛溶于 . 得液。将 溶于 甲醇中,得液。将、液 混合,搅拌,于?回流,跟踪,约小时反应结束。旋转蒸干后加入 约儿乙醇洗涤抽滤。 ?的合成同的合成 ..呋喃唑酮及其代谢产物免疫原的合成 呋喃唑酮及其代谢产物免疫原的合成,我们同样也用了七种方案如 图.,通过免疫,同样只有混合酸酐法是成功的。混合酸酐法制备呋喃哗酮 及其代谢产物免疫原?步骤如图.【】:称取 .山东大学硕士学位论文 . 蚴溶于 无水中搅拌溶解,加入弘 ? 三正丁胺,冰浴反应分钟,然后逐滴加入躯. 氯甲酸异丁 % 酯,室温反应小时。称取 .‖溶于 中,将活化完的逐滴加入溶解好的中,于一?反应小时。 , ,先后用. .缓冲液和蒸馏水透析天,期间更 反应结束 换透析液,以便较好除去未偶联的小分子。透析后,反应液冷冻干燥。 一 。 喇、伊一一 队 图.:的衍生物和合成的实验步骤 .汕 蠡 锄 狐 山东人学硕上学位论文 少~?? ~ 吖纣一斟?与? 。 吖矗~一杏舳:一‖一斟 。由?三?’ ??? 。 咚一 、 冬佣 ?. ? 粼八~? 毗钭~?:土丛一?健“斟且趴 以 。 ‘ 八? 一 ? 如 卜八/ 一斟几~。 符沙斟儿趴 ; 弋 凸 弋 ,一.山东大学硕士学位论文 八 州? 渤酬?一一酬‖。书 ?????????? 酬 ‖ 。持 . 。 妙 旧刚弋?竺:翌 一伊 弋?仙 电一电酷 生草吉器玲淑眦 卜 。 嗽耽一?乒筠~毗一酷且筠~? .:呋喃唑酮及其代谢产物免疫原合成的实验步骤 图 硒锄. 工 ..呋喃唑酮及其代谢产物包被抗原的合成 在前面我们合成呋喃唑酮及其代谢产物免疫原的同时,也采用同样 的方法合成了包被抗原,同样,只有戊二醛法合成的包被抗原检测利用混合 酸酐 法免疫原免疫得到的抗体才显示良好的灵敏性和特异性。 戊二醛法制备呋喃唑酮及其代谢产物包被抗原 .?的实验步骤如图?:称取 .‖卵 .中,搅拌溶解。称 清蛋白溶在 硼砂缓冲液. , %的戊二 取. .咖加入上述溶液中,然后量取.山东大学硕上学位论文 . 醛逐滴加入到上述溶液中于室温反应小时。先后用. , 缓冲液和蒸馏水于??透析五天,每小时更换一次透析液。将透析后的 溶液冻干,得到黄色固体粉末。、:八/\八 少~ 一 。~ 。各 。 一 :戊二醛法合成呋哺唑酮及其代谢产物包被抗原的实验步骤 图 如锄.”恤廿 . 恤 第三章呋喃妥因和呋喃唑酮及其代谢产物多克隆抗体的制备 第一节抗体的制备过程 ..免疫方案 初次免疫用注射器对抽法将弗氏完全佐剂与免疫原按:混合成油包水的 乳浊液,每只兔注射. 免疫原,进行背部皮下多点注射?点,每种 抗原免疫两只兔子。首免两周后第一次加强免疫用弗氏不完全佐剂与同样量 的抗 原混合,进行第二次免疫,剂量、方法同首免。以后每隔两周加强免疫一次, 剂 也,室温凝 量减半。从第三次免疫开始,每次免疫一周后,耳缘静脉取血. 固小时后?过夜,咖离心分钟,吸取血清,用以检测抗血 清效价,当抗血清效价基本不变时,不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫注 射七 天后进行心脏采血。 合成的七种免疫原被用来免疫雄性新西兰大白兔,每一种免疫原都皮下背部 “ 多点注射给两只兔子。其免疫程序和免疫剂量被总结在表?。山东大学硕十 学位论文 表?免疫方案 ?. ,. 曲加锣 ? 似 / “/ // // / ? ..心脏采血 通过免疫过程中的检测,当发现抗体效价与上次的检测结果没有明 显变化时,最后一次就直接注射生理盐水溶解的免疫原,在最后一次加强免 疫 天以后,对兔子进行心脏采血,血液在?静置过夜,次日‖血离心 分钟,消除一些杂蛋白及红细胞碎片,提取上清液,即抗血清。 ..抗体的纯化及保存 将心脏采血得到的抗血清用饱和硫酸铵纯化,依此用%、%、%的 饱和硫酸铵纯化三次,纯化后的抗体用. .透析,以除去硫 , 酸铵。将透析后的抗体用.%的叠氮化钠保存,并等分储存在.?以下保 存。山东人学硕上学位论文 第四章抗体检测 第一节呋喃妥因及其代谢产物多克隆抗体的检测 ..呋喃妥因及和多克隆抗体最佳测定浓度的选择 表.: 呋喃妥因和削多克隆抗体最佳检测条件的测定 . . 仃‰ . , ? . . . 从每一只兔子获得的抗体都被稀释成一系列的浓度用合成的多种包被抗原 通过方阵法进行检测。其检测过程如下: 纵向包被抗原浓度按.‖‖儿、.‖酌、.矬『/儿、.‖‖、 .‖/、.‖舢、.艇/儿、.‖/的系列稀释度包被酶标板, 的 .、浓度. 肛孔,?放置过夜,用 体积百分比是.%洗板三次,拍干;‖/孔封闭液 质量体积百分比是%卵清蛋白封闭,室温放置小时,洗板三次, 拍干;一系列稀释的抗体‖/孔被加入,室温放置小时,洗板三次, 拍干;‖/孔的:的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔被加入,室温 放置小时,洗板三次,拍干;加入‖/孔的底物邻苯二胺显色,室温放 终止反应,测定 处的 置. ,然后加入‖/孔的 吸光度值。以值为.左右的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特 异性测定。山东大学硕.学位论文 呋喃妥因及其代谢产物多克隆抗体最佳酶标二抗稀释度选择: 采用间接酶联免疫吸附测定法,酶标板先用包被抗原以最佳度盘浓度度盘, 洗盘、封闭方法同上。抗体加入采用从上至下梯度稀释,加入辣根过氧化物 酶标 记的羊抗兔酶标二抗时,从左到右梯度稀释,各行的酶标二抗稀释度从:到 。显色步骤也同上。 : ..间接酶联免疫吸附测定法测定呋喃妥因和多克隆抗体效价 用间接法,根据上面的检测选择出的最佳测试条件检测呋喃妥因及 其代谢产物抗体的效价,步骤如下:用各种包被抗原以上面优选出来的浓度 度盘, ~。放置过夜;洗盘;以‖/孔的封闭液室温封闭~小时;用洗液洗 酶标板次后,加入呋喃妥因抗体,抗体梯度稀释并室温放置~小 时;再次洗板后加入稀释度为: ‖/孔的辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔抗体,室温放置~小时。最后再洗板,加入‖/孔显色液。室温 显色分钟后,由 的盐酸口/孔终止显色,酶标仪珊测定结果。 测定结果由阴性对照孔校正。抗体效价的定义是抗体的吸光度值是阴性对照 的吸 光度值的倍以上的最大抗体稀释倍数的倒数。 ..竞争酶联免疫吸附测定法测定呋喃妥因和抗体灵敏性 我们利用合成的各种包被抗原和各种免疫原免疫得到的各种抗体进行交叉 测定,结果只有混合酸酐法合成的免疫原免疫得到的抗体,利用戊二醛法合 成的 包被抗原进行检测得到较好的结果,得到的抗体可以同时检测呋喃妥因和 剐?,但是在做灵敏性测定检测川?时,是用皿做竞争的,也就是需 要先把衍生为?。灵敏性测定用间接竞争法,选用最佳测 试条件,度盘、封闭等步骤同上,再同时加入呋喃妥因或抗体和呋喃妥因 或??竞争物,然后加入一定稀释度的抗体‖/孔和由配制含呋喃 妥因或皿的浓度从‘~ 鲈的竞争物‖/孑,将加入的溶液混 ,室温放置~小时;再洗板、显色,酶标仪 测定结果。测定结果 匀 由阴性对照孔校正。呋喃妥因及其代谢物抗体自身对抗体的抑制率,计算公 式如 下: % %【一,?,/,? .是含有竞争物的测试孔的吸光度值; 是只有抗体,不含竞争物的测试孔的吸光度值; 山东大学硕士学位论文 .是阴性对照稀释倍数与抗体稀释的倍数相同,并且孔中没有竞争物的测 试孔的吸光度值。 ..呋喃妥因和抗体交叉反应率特异性的测定 呋喃妥因和抗体交叉反应的测定与其灵敏性测定方法相同,采用间接 竞争法。度盘、洗盘、封闭、加酶标二抗及显色步骤相同,抗体特异性 检测中呋喃妥因或抗体和呋喃妥因或竞争物同时加入一步,在交 叉率测定时改为加入呋喃妥因或抗体和选择在结构上类似的一系列的药物 代替呋喃妥因或凹进行竞争抑制实验,该系列药物浓度的抑制浓度范围是 。~叫,计算抗体的交叉反应率,计算公式如下: 交叉反应率%呋喃妥因或的/结构类似物的。 呋喃妥因或的是呋喃妥因或自身对抗体%抑制,结构类似 物的是竞争物对抗体的%抑制。 ..呋喃妥因回收率的检测 ...标准曲线的建立 根据方阵法所选的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数进行间接竞争 测定,制作标准曲线。检测过程与上述一样,标准曲线在检测缓 冲溶液中制作呋喃妥因的最终浓度为.,.,.,.,,‖。 标准曲线的纵坐标用/表示,是未加呋喃妥因的吸光度值,是加呋喃 妥因的吸光度值,对应呋喃妥因浓度值为横坐标。 ...水体系中呋喃妥因残留量的检测 将养殖用水中添加呋喃妥因标准溶液,使得呋喃妥因在检测中的终 浓度分别为.,.,.,.,,‖。每个浓度的批间变异系数都以 不同的天的个重复数据进行计算,批内变异系数以同一天的次重复数 据计算。根据制定的标准曲线进行回收率的定量计算。一 ‘,’’ .. 回收率的检测 。 ...标准曲线的建立 根据方阵法所选的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数进行间接竞争 测定,制作标准曲线。检测过程与上述一样,标准曲线在检测缓 冲溶液中制作啪的最终浓度为,,,,咖。 标准曲线的纵坐标用/表示,是未加删的吸光度值,是加 山东大学硕上学位论文 的吸光度值,对应浓度值为横坐标。 ...生物基质的影响 将市场购买的猪肝研碎,称取 的猪肝置于 也的离心管中,然后加 入 ,旋转混匀分钟,倒掉上清液,再加入 甲醇 甲醇重复一次。 向猪肝中加入. 儿 ,混匀分钟。用 调至士., 旋涡振荡 ,然后 。取上清液加 离心 儿乙酸乙酯振荡 ,混合物室温下静置 ,然后 山,分出有机相,水相 离心 再用乙酸乙酯每次 ? 萃取两次,三次萃取的有机相合并在一起, 水浴减压蒸干,残余物中加入 正己烷和 ,旋涡振荡 , 然后 离心“,静置,将有机层弃掉。残余物用重新溶解制备 各种稀释度的肝萃取物:,:和:。?皿在和各种 稀释倍数:,:和:的肝样品中的终浓度范围为.到 鲈,通过这些测定数据来建立竞争曲线,确定猪肝基质的影响。 ... 的衍生 将市场购买的不含的猪肝样品研碎,称取×的猪肝置于, 的离心管中,先分别用 儿甲醇洗涤两次,向猪肝中加入. 再分别加入,,,,肚剐?标准溶液 卧和,, ,,肚标准溶液 咖,于?恒温振荡箱中孵育小 时。萃取方法和上述步骤...完全一样, ...回收率和变异系数的测定 将衍生的猪肝上清液用稀释成:,并且进行检测,结 计算用标准曲线。每个浓度的批间变异系数都以不同的天的个重复数 果的 据进行计算,批内变异系数以同一天的次重复数据计算。根据制定的标准曲 线进行回收率的定量计算。 第二节呋喃唑酮及其代谢产物多克隆抗体的检测 ..呋喃唑酮和多克隆抗体最佳测定浓度的选择山东大学硕士学位论文 表.:呋喃唑酮和多克隆抗体最佳检测条件的测定 ?. 向【 .. ?, . . . 最佳检测条件通过方阵法进行检测。步骤如下:酶标板先用各种包被抗原以 纵向浓度按.‖/、.朋/、.‖/、.‖‖儿、.‖酌、. 艇:/儿、.朋『/儿、.耀『/的系列稀释度包被酶标板,‖/孔,?放 置过夜,用洗板三次,拍干;以‖/孔的封闭液室温封闭~小时; 洗盘拍干后加入抗体,抗体由:稀释度开始梯度稀释并室温放置~小 时;加入稀释度为: ‖/孔的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体,室 温放置~小时。最后加入‖/孔显色液。室温显色分钟后, 由 测定结果。测定结果由阴性 的盐酸‖/孔终止显色,酶标仪 对照孔校正。 呋喃唑酮和多克隆抗体最佳酶标二抗稀释度的检测步骤同呋喃妥因和 多克隆抗体最佳酶标二抗稀释度的选择过程。 ..间接法测定呋喃唑酮和多克隆抗体效价 ,根据上面的检测选择出的最佳测试条件检测呋喃唑酮和 用间接法 抗体的效价,步骤如下:用各种包被抗原以上面优选出来的浓度度盘,~ ;洗盘;以‖/孔的封闭液室温封闭~小时;用洗液洗酶 。放置过夜 标板次后,加入呋喃唑酮或抗体,抗体梯度稀释并室温放置~小时; 再次洗板后加入稀释度为: ‖/孔的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗山东大 学硕士学位论文 体,室温放置~小时。最后再洗板,加入‖/孔显色液。室温显 色分钟后,由 的盐酸口/孔终止显色,酶标仪 测定结果。 测定结果由阴性对照孔校正。 ..竞争法测定呋喃唑酮和抗体灵敏性 利用各种包被抗原和各种抗体进行交叉测定,我们得出了同呋喃妥因或 抗体同样的结果,用戊二醛法合成的包被抗原检测混合酸酐法合成的免疫 原免疫得到的抗体结果较好,可以检测呋喃唑酮和两种药物,也需要 衍生为,因此在做抗体的灵敏性测定时,我们加入的竞争物是 。用间接竞争法,选用最佳测试条件,度盘、封闭等步骤同上, 再同时加入呋喃唑酮或抗体和呋哺唑酮或竞争物,抗体的稀释度 为: ‖/孔和由配制的含呋喃唑酮或的浓度从.~ 酌:儿的竞争物‖/孔,将加入的溶液混匀,室温放置~小时;再洗板、 测定结果。测定结果由阴性对照孔校正。 显色,酶标仪 ..呋喃唑酮和抗体交叉反应率特异性的测定 呋喃唑酮和抗体交叉反应的测定与其特异性测定方法相同,采用间接 竞争法。度盘、洗盘、封闭、加酶标二抗及显色步骤相同,抗体特异性 检测中呋喃唑酮或抗体和呋喃唑酮或竞争物同时加入一步,在交 叉率测定时改为呋喃唑酮或抗体和选择在结构上类似的一系列的药物代替 呋哺唑酮或进行竞争抑制实验,该系列药物浓度的抑制浓度范围是 ~ 之 酌:,计算抗体的交叉反应率。 ..呋喃唑酮回收率的检测 ...标准曲线的建立 根据方阵法所选的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数进行间接竞争 测定,制作标准曲线。检测过程与上述一样,标准曲线在检测缓 冲溶液中制作呋喃唑酮的最终浓度为.,.,.,., ‖。 标准曲线的纵坐标用/表示,是未加呋喃唑酮的吸光度值,是加呋喃 唑酮的吸光度值,对应呋喃唑酮浓度值为横坐标。 ...水体系中呋喃唑酮残留量的检测 将养殖用水中添加呋喃唑酮标准溶液,使得呋喃唑酮在检测中的终 浓度分别为.,.,.,.,璀/。每个浓度的批间变异系数都以不同山东人学硕士 学位论文 的天的个重复数据进行计算,批内变异系数以同一天的次重复数据计算。 根据制定的标准曲线进行回收率的定量计算。 第三部分结果与讨论 第一章免疫原的合成与鉴定 第一节呋喃妥因及其代谢产物免疫原的合成与鉴定 ..载体蛋白的选择 根据免疫学理论,小分子化合物分子量低于,不具有免疫原性, 不能直接刺激动物产生抗体,但将结构上具有一定复杂性的任何有机小分子与大 分子载体物质如蛋白质连接后可作为载体的抗原决定簇刺激动物产生能特异 性结合原小分子化合