血液处理过程中的红细胞溶血

血液处理过程中的红细胞溶血 Samuel O. Sowemimo-Coker Transfusion Medicine Reviews 2002, 16(1): 46 摘要：输注的红细胞制品中红细胞发生溶血已有报道，这对于需要输血的病人具有重要的临床意义。因为游离血红蛋白将裂解成二聚体与结合珠蛋白结合，进而通过网状内皮系统清除，一旦超出结合珠蛋白的结合能力，将会发生血红蛋白血症。溶血是指红细胞破坏后释放出血红蛋白并引起血浆颜色改变。红细胞异常溶血由许多因素引起，包括在血液处理过程中操作不当、保存条件不当、细菌性溶血、抗体激活补体的溶血、红细胞膜的缺陷及献血者异常等。溶血的程度常用红细胞比容校正后的整个血红蛋白中游离血红蛋白的百分率来表示。北美尚未建立可被接受的溶血范围，但是1%溶血目前用于评估血液保存材料的生物相容性，而欧洲委员会将标准定为0.8%。本文强调要对全血制备红细胞的全程进行充分的监控，从而减少溶血的发生。仔细评估血液制备过程将降低因溶血而废弃的红细胞量。 溶血是红细胞膜的完整性受到裂解或破损并释放血红蛋白的过程。血制品溶血可以通过悬液如血浆或添加剂中出现游离血红蛋白而证实。某些疾病如溶血性贫血病，或者血液处理过程如离心，都能导致红细胞破裂。虽然已有多种措施能提高红细胞在血液处理、保存、输注过程中的稳定性，但细胞离体后仍将增加溶血的危险。被认为能引起溶血的部分因素将在后面讨论，包括血液流动或处理过程中由于高速和旋涡引起的切变力以及与管道、血袋塑料表面的接触等等。 血液保存中与溶血有关的因素 制备过程 血库在血液采集和成分制备的过程中也会使红细胞破裂而释放血红蛋白，例如采血后分离不及时、快速抗凝（包括抗凝剂和血液的混匀）、离心速度的骤变、压积红细胞在添加剂中快速重新悬浮、血液保存袋外形和组成成分的多样化。当献血者采血量不足时，其血中抗凝剂相对比率将加大，易致红细胞损伤。此外为了提高血浆的回收量而采取的高速离心，会使红细胞过度压缩，甚至使红细胞比容超过80%。过度压缩的红细胞在CPD抗凝剂中会降低红细胞的活性，增加保存过程中的溶血。过滤前红细胞的保存血袋也会影响溶血的程度。常用血袋中有一些含有可提取的或不可提取的增塑剂，如邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）和三（2-乙基己基）三辛酯。DEHP能降低红细胞保存时的溶血率。红细胞在不含DEHP的塑料容器保存时溶血率会明显增加，42天后可达到1%以上，例如红细胞保存在含增塑剂丁基－n－三己基枸橼酸盐（BTHC）的聚氯乙烯（PVC）血袋中，上清血红蛋白浓度平均为850 mg/dl，上限为1470 mg/dl。许多厂商采用不含DEHP的血袋保存红细胞。红细胞在制备过程或保存于不含DEHP血袋中将受到损伤，更易在保存期或后续处理中发生溶血。除前面讨论的因素外，有时压积红细胞输注前需洗涤，这一增加的操作步骤洗去了红细胞外的血浆蛋白保护层，也可使红细胞受损。 切变力或机械性损伤而致的溶血 溶血有时也可能因切变力所引起，主要发生在以下情形：扭结管道的边缘、部分闭合的转移管道夹、采血袋的入口部分（红细胞从留样管道进入半闭合采集袋过程中）。切变力的损伤也发生在过度压缩的压积红细胞的重新悬浮过程。过滤前混匀时对血袋的摇晃或振荡也会致红细胞脆性增加及衰老红细胞的溶解。1000—1500达因/cm2的低切变力，与自然重力或过滤过程类似，本身不会导致溶血。但是保存容器表面异常粗糙或不规则可能引发湍流，这会发生溶血。例如人工瓣膜流体动力学特性所致湍流切变力会破坏红细胞，因此瓣膜置换病人常出现明显的溶血。红细胞被强行通过白细胞过滤器、小针孔、狭窄开口、扭结或扭曲的静脉导管、部分阻塞或闭合血袋时，都可能使红细胞受损。未稀释的浓缩红细胞比全血或稀释的浓缩红细胞更易出现机械性或外伤性溶血，因为前者红细胞比容较高，而后者红细胞比容和粘滞度较低。 细菌污染 红细胞异常溶血也可能是由于细菌污染而引起。当血液中出现了异常物质、血凝块、颜色改变（细胞或血浆呈褐色或紫色）、液体血中的异常团块、血浆不透明或浑浊、出现气泡或特殊气味时，应怀疑该血有可能被污染。 红细胞膜的缺陷及变形能力 红细胞变形能力对于体内细胞通过狭窄的毛细血管非常重要。红细胞变形能力下降或细胞膜的缺陷在红细胞的自发或保存诱导的溶血中起重要作用。如变形能力下降对遗传性球形细胞增多症和椭圆形红细胞增多症的溶血起重要的作用。6-磷酸-葡萄糖脱氢酶缺乏、镰状细胞贫血、镰刀状红细胞和其它血红蛋白病等献血者红细胞都有膜的缺陷将导致溶血。尿毒症及糖尿病病人红细胞的变形力很弱，因此红细胞对机械性损伤很敏感。红细胞的变形能力受细胞内在粘度的影响（如镰状细胞病和血红蛋白C病），也受膜特性的有限影响（如地中海贫血）。 温度 血液和成分在保存、过滤或过滤过程、血液处理等时的温度是溶血的重要因素。温度很大程度上影响了红细胞膜的变形能力和血液处理过程中膜的稳定性。红细胞突然冰冻会发生溶解，如血液被储存在温度失控的冰箱内或未添加冷冻保护剂放在冰冻层。温度达到40℃时红细胞也会遭破坏。热合留样管道的热合机所产生的高热会致热损伤。但是某些个体对温度的敏感性或受温度的影响明显要小。热损伤的红细胞在采集、离心、成分分离时会破裂。此外过冷环境或将血袋放入低于1℃的地方，此时白细胞过滤或过滤前混匀、处理过程都会发生红细胞溶血。血液运输时也可能意外冰冻。血液运输中必须确保保存温度在1℃—10℃。若献血者血浆中游离血红蛋白浓度出现异常，很可能是由于血液运输保存或采集时温度处理不当。 渗透压（低渗与高渗）和pH的变化 红细胞突然接触血袋中的高渗或低渗溶液、抗凝剂、添加剂或溶液pH发生骤变，都可能引起红细胞的破坏或溶解脆性增高。引起红细胞破坏的低渗和高渗溶液临界值会随着悬浮液温度的改变而降低。 细胞寿命与保存时限 输注的血液按常规可保存35—42天，这取决于抗凝剂和保养液的成分。先前有关血液保存作用的报道都表明保存期中红细胞的膜完整性和流动性有很大改变，游离的血红蛋白水平明显上升。很多学者对保存期内的压积红细胞的游离血红蛋白含量进行定量研究，证实保存期中游离血红蛋白量明显增加。保存于Adsol添加剂（Baxter Health Care Corporation; Fenwal Division, Deerfields, IL）存放2天的未过滤红细胞，游离血红蛋白含量为17.4mg/dl（范围为3.7到45.5 mg/dl），这个程度血浆略呈淡黄色的。储存26天其游离血红蛋白的含量升至90.2 mg/dl（范围为46.5-151.5 mg/dl）。储存40天其含量增至193 mg/dl（范围49.0—413.9 mg/dl），浓缩红细胞下层颜色由淡黄色至呈浅红色，上层为明显可见的红色（如表1所示）。Hogman 等报导保存血的容器对保存期中红细胞的溶血情况产生很大的影响。用BTHC增塑剂的PVC容器储存红细胞42天，上清血红蛋白平均为830 mg/dl（2.5%红细胞溶血），其上限约为1470 mg/dl（4.5%溶血）。 白细胞的影响 未过滤红细胞悬液中存在的白细胞可能导致增加保存期间的溶血。在保存期间，白细胞破损并释放出一些化学物质和酶如过氧化氢和蛋白酶等。已有报道指出，保存期白细胞释放的蛋白酶可造成红细胞溶血、破坏红细胞的代谢和活性。这些由白细胞造成的损害可通过用白细胞滤器过滤后而减轻或消除。 药物诱导的溶血 献血者在献血前服用高浓度的某类药物会导致红细胞溶血，主要是通过渗透压改变、氧化作用或免疫机制，如青霉素、维生素C、奎尼丁和甲基多巴胺等。服用此类药物的献血者未能在献血时被排除。因此发现红细胞溶血时应追溯献血者的药物史。许多药物会导致6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏的病人红细胞发生溶血，即便是健康献血者，在超量服用某些药物后也可导致溶血。 红细胞辐照 目前唯一被接受的防止输血相关性移植物抗宿主病（TA-GVHD）的方法是对全血或细胞成分进行辐照。有许多研究者报导，经γ—射线辐照的红细胞膜的完整性发生很大改变，其表现为渗透脆性增加、细胞裂解、K+外泄及24小时体内生存力降低。辐照的全血及红细胞悬液在过滤中或成分制备中易溶解及释放血红蛋白。另外形式的辐照如紫外线（UV-A，UV-B，及UV-C）辐照，其主要用于血液及血液成份中病原体的灭活，也会损伤红细胞。 补体激活及血小板激活 已有文献报道血小板或白细胞激活后释放的化学物质将损伤红细胞，使红细胞在保存期间或进一步的操作处理中容易发生裂解。此外血液中补体激活物也会明显损伤红细胞。 生化改变和溶血倾向 还有一些导致溶血的情况并不是前面所描述过的任何一项。现已知道，来自不同健康献血者的血样本呈现不同的溶血倾向。溶血率也随采集血液的时间而改变，如采自餐后献血者的血液比采自空腹献血者的血液更易溶血。 过滤对红细胞溶血的影响 少白细胞过滤 前面讨论表明有多种与过滤无关的可引起红细胞溶解的因素。文献公布的数据和我们研究数据表明，按厂家说明使用Pall 少白细胞滤器，不会产生超过的0.8%的溶血。与之形成对照的是，未过滤红细胞制品中的白细胞对保存期内溶血明显增加起重要作用。保存期间白细胞降解释放一些化学物质和酶如过氧化氢和蛋白酶。已有报道保存期白细胞释放的蛋白酶可引起红细胞裂解。一些研究表明保存前过滤白细胞的浓缩红细胞明显提高保存活性，包括溶血明显少于未过滤的红细胞。在一项全面协作的研究中，4家临床研究中心调查了过滤对溶血的影响。40位志愿者在两个不同的场合献血，在室温或4℃的情况下6到8小时后对血液进行处理。结果显示：与未过滤的对照比较，经Pall Leukotrap RC滤器过滤的红细胞在42天后溶血明显降低（P<0.0001）。其他研究者在全血和压积红细胞中进行了类似的实验，结果证实了我们的结论，过滤与未过滤的血制品相比溶血明显降低。 不同保存阶段过滤红细胞 一系列实验研究了在不同保存期过滤对红细胞溶血的情况。试验中红细胞比容平均为46％，保存在AS-1添加剂中，在不同的保存阶段依据厂家说明将红细胞经Pall BPF4少白细胞滤器（Pall公司，East Hill，NY）过滤，通过保存袋的一个插口无菌采集检测样本。结果显示保存期内过滤和未过滤的血样溶血率随时间延长而增长，这与先前的报道相符。虽然过滤制品比多存放2天的未过滤制品的游离血红蛋白浓度略高，但溶血率仍远低于1％或0.8％，而这分别是美国对添加剂的标准和欧洲标准。浓缩红细胞经少白细胞过滤后，可以保护红细胞不受白细胞介导的溶血影响，使保存期中溶血率低于1％。最近Gammon等研究证实了这些结果，并表明过滤血制品溶血明显低于上述严格标准。 溶血的标准和临床并发症 在美国，除了去甘油红细胞外，其他血液成份的血浆游离血红蛋白浓度还没有标准。一般来说血浆或红细胞悬液呈现粉红色，其游离血红蛋白浓度低于25mg/dl（相当于红细胞比容45%、血红蛋白为16g/dl的血样有0.09％溶血）。当游离血红蛋白浓度为100mg/dl时，上清液明显为红色。溶血是评价保存红细胞质量的重要参数。在体内游离血红蛋白分解为α二聚体，通过与结合珠蛋白结合，并经网状内皮系统清除。正常成年人结合珠蛋白的浓度为30-200mg/dl。结合珠蛋白是二聚糖蛋白，每分子结合2个血红蛋白二聚体或相当于血浆血红蛋白浓度为1g/l。成人输注大约３g游离血红蛋白（或大约10单位红细胞，每单位0.5％溶血）不会出现血红蛋白血症。血红蛋白在尿中不会明显出现，除非血浆中血红蛋白大于100mg/dl。由于结合珠蛋白的快速生成和新陈代谢的加快，实际上人体耐受能力很大。美国食品及药物管理局（FDA）尚未建立输注血液制品的溶血标准，然而FDA推荐去甘油红细胞最高溶血为1％，批准和许可的红细胞添加剂必须使压积红细胞保存期末溶血少于1％。与FDA不同，欧洲对输注红细胞制品的官方标准为溶血率不大于0.8％。 虽然没有大范围的临床试验调查游离血红蛋白对人体的毒性，但自体溶血输注仍有各种实验性调查。Spector和Crosby用溶血样本输注正常志愿者以诱导产生血红蛋白血症。静脉输注540mg/dl游离血红蛋白后5小时维持输注240mg/dl，志愿者无临床症状。进一步发现诱导中等程度的血红蛋白血症不会导致弥漫性血管内凝血。其他研究报道了更高浓度的血浆血红蛋白输注水平。Aaron等报道给关节内窥镜手术病人输注未洗涤红细胞，其血浆血红蛋白浓度在1000±625mg/dl（大约3％溶血），研究证实了此浓度的血红蛋白是可以耐受的，不会有后遗症，其研究对正常血容量病人适用，可能不能适用于其他类型的病人（如低血容量者）。 溶血的调查 溶血常通过红细胞悬液中存在游离血红蛋白而确认。过滤前、后红细胞制品或全血悬液中出现粉红色改变，则需要立即对溶血的因素进行调查。第一步应确保献血者红细胞在过滤前未被前面讨论的因素所破坏。例如暴露在过热或过冷的环境、高压下使用过细针管采集血液、接触不当的容器，均可导致在过滤或离心前，红细胞破坏释放出血红蛋白。白色的背景下肉眼观察血袋或管道中上清液可以看出由于红细胞溶血或破坏所出现的粉红色。红细胞放置在过冷的环境中会发生溶解而显紫红色，紫红色可以作为发生溶血的警示标志。虽然肉眼观察可鉴别出血浆血红蛋白浓度为25mg/dl的情形，此时其粉红色改变对肉眼已很明显，但为了进行合适的质控和建立输注红细胞拒收标准制度，游离血红蛋白浓度必须采用后面提到的方法准确检测。 调查过滤后的溶血必须详细询问献血的环境、制备红细胞的全程和过滤过程。其中与过滤相关的溶血可能与以下因素有关： 1．强行将红细胞或全血通过滤器，以完成过滤前滤器系统的初始化。 2. 拔去控制管进行留样分析。 3. 过滤器中的残留空气或混匀血液时产生的气泡 4. 过滤温度过高或过低。 5. 未按厂家少白细胞滤器或过滤系统的使用说明操作。 6. 过滤前红细胞经辐照。 为了测定血液中的溶血程度是否大于1％，建议使用恰当的方法定量测定血红蛋白的浓度。这将避免血液不必要的被退回，而这些血液本来可以加入添加剂，用于制备符合标准的可长期保存的红细胞。 过滤中预防溶血的指南 以下指南基于现有的文献资料，可以帮助减少白细胞过滤或血液处理过程中溶血的可能。值得注意的是许多调查表明这与常用标准或良好的管理相关。 1．严格按厂家说明使用白细胞滤器，实验人员的充分培训是很重要的。处理血液的人员必须经过必要的培训，并定期检测以保证设备的使用按厂家说明进行。 2． 全血必须加入推荐使用的抗凝剂量，避免采血量不足或过多。红细胞制品必须保存在FDA批准的添加剂中，有适宜的化学成分、渗透压和pH值。 3．过滤红细胞前，用比色计测定上清液的游离血红蛋白。如果比色计读数大于或等于25mg/dl，血液的处理过程应格外小心。避免将装有血液的血袋反复振摇、挤压。 4．确保连接血袋和滤器的管道完全伸开。如果滤器和血袋间的管道或连接部分扭结或部分闭合，就不要过滤血液或红细胞。 5．滤器与血袋间如果转移管道夹部分闭合或管道被部分夹住，不要过滤。 6．不定期抽查采血袋中红细胞添加剂的渗透压和pH值，并确保这些参数在采血袋保存或运输中没有改变。 7．保存超过1天的红细胞或全血，在处理过程中必须非常小心。例如保存7至42天的红细胞在过滤前可以用2次颠倒血袋方法来进行血液的混匀。 8．不要将血液储存在冷库的通风口，此处的温度会低于规定的1-6℃。 9．红细胞或全血必须在合适的容器中运输，此容器必须保持在规定的温度。 10．少白细胞过滤过程中避免气泡进入过滤系统。 11．避免用外力强行将红细胞或全血通过少白细胞滤器。滤器的初始化应采用自然重力，除非少白细胞滤器厂家另有推荐方法。 12．全血制备浓缩红细胞应避免高速离心（大于5000g×5分钟）。在添加剂中重新悬浮压紧的压积红细胞必须非常小心，避免红细胞破坏。 13．γ射线辐照前，用少白细胞滤器过滤红细胞制品。 14．防止红细胞转移至低渗或高渗溶液血袋中，低渗或高渗常发生在血袋灭菌过程。 15．血液在处理前必须完全抗凝。未经充分抗凝的血袋中会有可见凝块，切勿使用。 血浆血红蛋白的测定方法 游离血红蛋白测定对于评估全血和血液制品溶血的程度具有重要价值。在大多数血库和医院，通过观察和血袋相连的管道作为一种快速、简便的方法检测溶血。然而这类肉眼观察的方法不能精确测定溶血程度，而且管道和血袋中会有不同的结果。除了血袋和管道中血容量/塑料表面积比例不同外，应当指出的是血袋和管道所用的塑料也会不同。由此血袋和管道接触面的红细胞呼吸气道就是不相同的。 定量方法 评估血液制品溶血最好的方法是有效的定量分析方法。目前已发展有多种方法，大多基于血红蛋白吸收光谱的特性，包括不连续波长比色法、波长扫描分析、导数分光光度法。血浆血红蛋白定量方法可分为直接光学法，该技术定量是基于氧化血红蛋白在415、541、576nm存在吸收峰。直接波长扫描分析测定血浆样品，胆红素、血浆蛋白、白蛋白、脂类和其它吸收物质的本底水平对结果有强烈干扰。其它定量的方法是利用化学法，当样本与化合物如铁氰化钾或四乙基联苯胺混合，所有形式血红蛋白（除了硫化血红蛋白外）形成显色反应产物。国际血液学标准化委员会推荐氰化高铁血红蛋白法作为全血测定的标准方法。虽然直接光学比色方法只有少数机构使用，但在测定血浆血红蛋白浓度时，这种方法比化学法更为安全、简便、准确和精密。在Pall公司我们使用Cripps比色法测定未稀释血浆标本中氧化血红蛋白浓度，方法定量依据3波长（560，576，592nm）Allen基线校正法。本法利用560nm和592nm吸收的线性基线作参照，计算氧化血红蛋白在576nm的吸收值。此技术的优点在于，对分析测试中的干扰物质如胆红素成的干扰，可以利用吸收峰两侧波长的吸收值进行校正。 溶血百分比的计算 游离血红蛋白浓度取决于裂解红细胞的数量和液体的体积。同样的溶血程度，浓缩红细胞中游离血红蛋白浓度比全血要高4-6倍。因此常采用游离血红蛋白在总血红蛋白的百分比来表示溶血程度的高低。应当注意到必须采用红细胞比容校正，防止过高估计溶血程度。计算溶血百分比的公式如下，示例见表1。 溶血百分比（%）= （100－红细胞比容）×血浆或悬浮液游离血红蛋白浓度 血红蛋白总量     结论 红细胞在体外受保存条件和操作过程的影响。红细胞保存期间，即使不使用少白细胞滤器，溶血仍会随保存时间的延长而发生。临床上输注保存42天的红细胞已有数十年，不论红细胞有无过滤均未发生临床副反应。本文报道了存在大量与过滤无关的、导致血液或压积红细胞溶血的因素，为了防止溶血的发生，在血液过滤前必须小心注意这些因素。 不论是过滤或未过滤的红细胞制品，42天末游离血红蛋白最高水平也低于0.8%溶血的严格标准。0.8%和1.0%溶血相对应的血浆血红蛋白浓度分别为233和291mg/dl（假设红细胞比容为45%、总血红蛋白为16g/dl），此时上清血浆的颜色是深红色，很容易用肉眼观察。虽然上清液很红，但是1%的游离血红蛋白是可接受的，输注后无临床后遗症。 许多文献报道，使用少白细胞滤器过滤血制品，血浆游离血红蛋白水平远远低于最严格的0.8%溶血的标准。