昆白小鼠受精卵原核注射后微管和微丝的动态变化道

昆白小鼠受精卵原核注射后微管和微丝的动态变化道 Online system: 农 业 生 物 技 术 学 报 Journal of Agricultural Biotechnology 2013 217: 775782 DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2013.07.003研究论文Article昆白小鼠受精卵原核注射后微 管和微丝的动态变化马斌斌 孟永芳 谷建锋 贾洪响 魏强 赵晓娥 马保华西北农林 科技大学 动物医学院;农业部动物生物技术重点实验室，杨凌 712100通讯作者， mabhnwsuaf.edu.cn摘 要 受精卵原核注射技术作为制备转基因小鼠的常用方法，其 操作过程对受精卵造成的影响可能是导致原核注射卵发育能力不高的主要原因之 一。受精卵细胞骨架系统与受精卵的原核迁移及早期卵裂等发育过程密切相关，为 了研究受精卵微管、微丝在原核注射后胚胎发育过程中的动态变化，并为提高原核 注射卵发育效率提供基础资料，本研究采用免疫荧光技术与激光扫描共聚焦显微镜 技术，在原核注射后昆白小鼠Mus musculus受精卵第一次有丝分裂过程中对其α-微 管α-tubulin和微丝F-actin进行定位观察。结果显示:1原核注射后受精卵存活率为 75.11 ? 2.10，卵裂率为79.70 ? 1.75，囊胚率为44.85 ?3.21，与未进行显微注射的对 照组受精卵卵裂率90.37?0.65和囊胚率75.32?1.29相比，存在极显著差异Plt0.01。2 受精卵原核注射后，原核期微管在胞质内弥散分布，没有明显的星体结构，原核周 围无纤维状微管;在原核迁移、融合期，α-微管逐渐呈纤维状集中在原核周围，胞 质内出现星体结构，中体逐渐消失;在第一次有丝分裂开始时，α-微管参与形成纺 锤体;在卵裂完成后，α-微管集中分布于两卵裂球连接处的中体中。而对照组受精 卵原核期微管集中于原核周围呈纤维状分布，卵胞质内有星体结构;在原核迁移、 融合期、第一次有丝分裂期及卵裂完成后，其微管分布与原核注射受精卵无明显差 异。3受精卵原核注射后，原核期微丝在原核周围及皮质区域均有分布;随着原核的 迁移和融合，卵胞质内部微丝分布逐渐减少，明显趋于集中在受精卵皮质区域和原 核周围;第一次有丝分裂开始时，卵胞质内部微丝消失，微丝集中分布于受精卵皮 质部位;卵裂完成后，微丝主要分布于两卵裂球间的分裂沟处。对照 融合过程中， 组受精卵微丝在原核期及原核迁移、 微丝均集中分布于皮质区域;在第一次有丝分 裂及卵裂完成后，其微丝分布与原核注射受精卵无明显差异。研究结果明，原核 注射操作对受精卵微管网络的影响主要集中在原核期，在原核融合期前微管网络得 以恢复，而对微丝网络的影响主要集中在第一次有丝分裂开始前，并且对皮质区域 的微丝分布没有显著影响。关键词 微管，微丝， 原核注射， 激光扫描共聚焦显微 镜技术， 小鼠Dynamic Changes of α-tubulin and F-actin in Pronucleus MicroinjectedEmbryos in KM MouseMus musculusMA Bin-Bin MENG Yong-Fang GU Jian-Feng JIA Hong-Xiang WEI Qiang ZHAO Xiao-E MA Bao-HuaCollege of Animal Veterinary Medicine Northwest Agriculture and Forestry University Key Laboratory of Animal Biotechnology Ministry ofAgriculture Yangling 712100 China Corresponding author mabhnwsuaf.edu.cn基 金 项 目 : 基 因 生 物 新 品 种 培 育 重 大 专 项 No. 2011ZX08010- 001 和 西 北 农 林 科 技 大 学 博 士 科 研 启 动 基 金 No. 转201104050373 2012-11-29收稿日期: 接受日期:2013-01-22 农业生物技 术学报776 Journal of Agricultural BiotechnologyAbstract Pronucleus microinjection is a commonly used method for the preparation of transgenic mice. Theinfluence of its injection process may be one of the main reasons for low developmental capacity of the pronucleusmicroinjected embryos. And that the cytoskeleton system is closely related with the pronucleus migration and earlycleavage etc. To observe the dynamic changes of α-tubulin and F-actin during the embryonic development in KMmouseMus musculus embryos after pronucleus microinjection and lay the foundation for improving thedevelopmental capacity of the pronucleus microinjected embryos immunofluorescence and laser confocalmicroscopy were used to detect the location of α- tubulin and F- actin in the first meiotic division of themicroinjected zygotes. The results indicated that: 1The survival rate was 75.11 ? 2.10 the cleavage rate was79.70 ?1.75 the blastocyst rate was 44.85 ?3.21 and those were highly significant lower Plt0.01 than thatof the control groupthe cleavage rate: 79.70 ? 1.75 the blastocyst rate: 44.85 ? 3.21 of the microinjectedzygotes. 2At the pronucleus stage of the microinjected zygotes α-tubulin got a diffuse distribution. Meanwhilethere was no obviously cytaster in cytoplasmic and fibrous α-tubulin didnt concentrate around the two pronuclei.During the stage of pronucleus migration and fusion fibrous α- tubulin gradually concentrated around the twopronuclei and the midbody dissolved gradually. At the beginning of the first mitosis α-tubulin participated in theformation of spindle. At the 2- cell stage α- tubulin concentrated in the midbody at the junction of the twoblastomeres. At the pronucleus stage of the control mouse zygotes fibrous α- tubulin composed midbody andcytaster remodeling around male and female pronucleus to pull the pronuclei to get close. With furtherdevelopment the distribution of α-tubulin had no significant differences from the stage of pronucleus migration andfusion until the 2-cell stage. 3At the pronucleus stage of the microinjected zygotes F-actin distributed around thetwo pronuclei and the cortex regions. Following the pronucleus migration and fusion F- actin distributed incytoplasmic gradually decreased obviously tended to concentrated around the two pronuclei and the cortexregions. At the beginning of the first mitosis F- actin distributed in cytoplasmic almost disappeared while thedistribution of F-actin was concentrated in the cortex regions. At the 2-cell stage F-actin mainly distributed in thecleavage furrow. As for the normal mouse zygotes F- actin concentrated in the cortex regions before the firstmitosis. Following the development the distribution of F-actin had no significant differences from the first mitosisuntil the 2-cell stage. Our study indicated that the effects of pronucleus microinjection on the microtubule networkmainly concentrated at the pronucleus stage. However it could recover before the stage of pronucleus fusion whilethe effects of pronucleus microinjection on the microfilament network mainly concentrate at the beginning of thefirst mitosis moreover it has no significant effect on the distribution of the cortex regions.Keywords α-tubulin F-actin Laser confocal Pronucleus microinjection Mouse 小鼠Mus musculus作为主要的转基因模式动 泛 应 用 的 制 备 转 基 因 小 鼠 的 方 法 王 洪 梅 等物，被广泛应用于转基因动物遗传育种及生物医药 2011。但是，原核注射技术制备转基因小鼠的效领域。由于其遗传背景清楚，个体 小，成本低，繁殖 率较低，原因除外源基因拷贝数和整合位点难以控力强，周期短， 易于饲养，遗传转化效率高，可用于 制，整合效率低以外左珂菁等 2010，原核注 射操多种表达载体验证、抗性验证和转基因动物生物安 作过程对受精卵的影响也可 能是造成转基因效率全检测等方面的工作。 较低的主要原因之一。在原核注射操作 过程中，需 受精卵原核注射技术是经典的制备转基因小 要利用直径为 1 μm 左右 的注射针刺穿受精卵透明鼠的方法，此法是利用显微操作仪将基因直接注入 带、卵 质膜及核膜，不可避免地会造成受精卵损到受精卵原核中，待其进一步发育并移入 假孕母鼠 伤。其中微管α-tubulin和微丝F-actin等细胞骨体内，最终获得转基因小鼠 Gordon et al. 1980。 架 系 统 在 动 植 物 细 胞 中 发 挥 重 要 作 用 佘 玮 等原核注射技术无需外源表达载体，基因片段长度限 2010，尤其是作为遍布于受精卵胞质中的复杂蛋制不高，直接获得纯系后代，实验周期短，是目前广 白纤维网络，原核注射后其组织和结构可能会发生 昆白小鼠受精卵原核注射后微管和微丝的动态变化 Dynamic Changes of α-tubulin and F-actin in Pronucleus Microinjected Embryos in KM MouseMus musculus 777一系列变化，从而影响受精卵原核迁移及早期卵裂 射对细胞骨架系统影响的研究甚少。原核注射技等一系列发育事件。 由于其本身的操 术作为制备转基因小鼠的常用方法， 微管和微丝在哺乳动物受精卵和早期胚胎中 不可避免的对受精卵造成损伤。本研究应用 作特点，具有其独特的分布特点和功能，参与精子形成杨 对小鼠受精 免疫荧光与激光扫描共聚焦显微镜技术，莉等 2009、受精、原核形成和迁移、原核融合、卵 卵原核注射后到第一次卵裂的发育过程中微管和微裂等过程。研究表明， 三种微管蛋白，即α-tubulin、 丝的分布变化进行追踪， 以分析原核注射对小鼠受精β-tubulin 和γ-tubulin，在排卵期的卵母细胞中合成 卵及早期发育过程中细胞骨架系统的影响。冯秀清等 2006。β-微管主要参与纺锤体的组装、 1 结果与分析染色体的牵引、中体结构的形成及原核的迁移等。成熟卵母细胞在受精前其减数分裂停滞于第二次 1.1 原核注射后胚胎发育结果成熟中期M?期，卵母细胞受精后，即恢复第二次 实验选取双原核清晰可见的受精卵图 1A用减数分裂，其纺锤体微管牵拉染色体向两极迁移; 于原核注射，注射针刺穿核膜，注入约 12 pL 的 TE在第二次成熟分裂末期，微管分布于去凝集的母源 缓冲液至原核轻微膨胀图 1B;将原核注射后存活染色体之间;第二极体排出后，胞质中的母源染色 的 154 枚受精卵存活率 75.11 表 1在 mKSOM 培体去凝集形成雌原核。精子染色质在受精后 58 h 养液， ? 、 CO2、 37 5 饱和湿度条件下进行培养，培也发生去凝集形成雄原核。在原核形成的同时，胞 养 24 h 后 124 枚受精卵发生卵裂发育至 2-细胞，卵质星体在雌、雄原核的周围重组形成长的微管，负 70 裂率为 79.7表 1。培养 72 h 后， 枚受精卵发育责雌、雄原核的迁移靠近冯秀清等 2008。微丝 至 囊 胚， 胚率 为 44.85 图 1C表 1; 照 组为 囊 对对于卵母细胞减数分裂纺锤体位置的维持和旋转、 267 枚受精卵用上述相同条件进行培养，培养 24 h受精锥的形成、第一和第二极体的形成和排放、原 后 242 枚受精卵发生卵裂发育至 2-细胞，卵裂率为核迁移及胚胎卵裂等都具有重要作用。受精卵时 200 90.37表 1。培养 72 h 后， 枚受精卵发育至囊期，微丝分布于受精卵皮质区，并集中于受精卵和 胚，囊胚率为 75.32表 1;将原核注射后正常卵裂第二极体连接处，发生第一次卵裂后，微丝则集中 的 2-细 胞胚胎移植到 ICR 假 孕鼠输卵管中，1921分布在两个卵裂球的分裂沟处，参与构成缢缩环 d 后产仔 9 只图 1D。徐营等 2008 武迪迪等 2011。 由于微管和微丝在小鼠受精卵早期发育中的 1.2 原核注射后受精卵中微管的动态变化重要作用，已有很多文献报道了微管和微丝在体外 受精后微管、微丝参与原核迁移和融合、有丝 孤雌发育及核移植胚胎中的动态变化冯秀清受精、 分裂纺锤体的形成等过程，原核注射操作中注射针等 2008 张庆华等 2008 Xu et al. 2011，但原核注 需要刺穿胞质和核膜，势必对微管、微丝的分布和 A B C D图 1 原核注射后胚胎发育和移植结果Figure 1 Development of mouse zygotes after pronucleus microinjection and embryo transferA: B: C: 原核注射前受精卵箭头指示原核; 原核注射后受精卵箭头指示原核 原核轻微膨胀; 原核注射 TE 缓冲液后 72 h D:发育至囊胚; 移植原核注射后发育至 2-细胞期胚胎 到假孕母鼠输卵管产仔 9 只A: Zygotes before pronucleus microinjectionarrowhead denotes pronuclear before microinjection B: Zygotes after pronucleusmicroinjectionarrowhead denotes pronucleus after microinjection C: Blastocysts cultured for 72 h after pronucleusmicroinjection D: Nine pups after pronucleus microinjection and embryo transfer. Scale bar 20 μm 农业生物技术学报778 Journal of Agricultural Biotechnology表 1 小鼠受精卵原核注射后体外发育结果 Table 1 Development of mouse zygotes after pronucleus microinjection分组 受精卵数/ 枚 存活受精卵数 卵裂数 囊胚数Groups No. of zygotes No. of survived zygotes No. of cleavages No. of blastocysts原核注射组 Microinjection 204 15475.11?2.10 b 12479.70?1.75 b 7044.85?3.21b对照组 Control 267 267100.00 a 24290.37?0.65 a 20075.32?1.29a同列不同字母间表示差异极显著Plt 0.01The different lowercases in the same column show highly significant differencePlt 0.01功能造成影响。激光扫描共聚焦 显微镜观察显示， 在受精卵皮质区域、雌雄原核周围、第二极体内图在原核注射后 的原核期，雌原核体积较小，位于靠 3A。随着原核的迁移和融合，卵胞质内部微 丝分近第二极体的胞质部位，雄原核体积较大，位于远 布逐渐减少，明显趋于集中 在受精卵皮质区域和原离第二极体的胞质部位图 2A，α-微管集中在第二 核周围图 3B、C。第一次有丝分裂开始时，原核次减数分裂的纺锤体残余结构中体中，中体 一端为 消失，染色质凝集呈染色体并排列在赤道板上，卵第二极体，另一端为雌原 核。在胞质内，α-微管弥 胞质内部微丝消失，微丝集中分布于受精卵皮质部散分布， 星体结构不明显图 2A。随着原核的迁移 位图 3D。卵裂完成后 微丝主要分布于两 卵裂球和融合，α-微管逐渐集中在原核周围并呈纤维状， 间的分裂沟处图 3E。胞 质内出现星体结构， 中体逐渐消失图 2B、C。 而在对照组中， 原核期、原核迁 移和融合期、第一次有丝分裂开始时，原核消失，染色质凝集成 第一次有丝分裂中 期微丝均分布于受精卵皮质区染色体并排列在赤道板上，α-微管参与纺锤体微管 域， G、 在原核周围未见微丝的集中分布图 3F、 H、的组装并形成纺锤体图 2D。 卵裂完成后 α-微管 I。卵裂完成后 微丝主要分布于两卵裂球间的分集中分布于两 卵裂球连接处的有丝分裂纺锤体残 裂沟处图 3J。余结构中体中图 2E。 比较原核 注射组和对照组激光扫描共聚焦图 而在对照组中，原核期α-微管主要分布于原核 片，对照组中，在第一次有丝分裂中期之前的各个核膜边缘区域、卵胞质与第二极 体连接处的中体结 发育时期，微丝均分布于受精卵皮质区域，原核周构中，卵胞质 内可见星体结构图 2F。随着原核的 围未见微丝的集中分布。而原核注射组除了皮 质迁移和融合，α-微管主要以纤维状分布于原核周 区域有微丝分布外，原核周围都 有微丝分布。而随围，胞质内出现星体.