实验六：血清谷丙转氨酶活力测定

实验六：血清谷丙转氨酶活力测定 200906034010 唐丹 200906034021 郭力 血清谷丙转氨酶活力测定 实验 1、学习测定谷丙转氨酶活性的原理。2、掌握分光光度法定量测定技术。 实验 转氨酶又叫氨基转氨酶,它催化转氨基反应。转氨酶在氨基酸的分解、合成及三大物质的相互联系、相互转化上起很重要的作用。转氨酶种类很多,在动物的心、脑、肾、肝细胞中含量很高,在植物和微生物中分布也很广,其中以谷丙转氨酶,GPT,和谷草转氨酶,GOT,活力最强,GPT在肝细胞中含量最丰富,它催化a-酮戊二酸和L-丙氨酸反应生成L-谷氨酸和丙氨酸。正常人的血清GPT含量很少,活性很低,但当肝细胞受损时,如肝炎等病变,,酶从肝细胞释放到血液中,使血清中的GPT活性显著增高。测定GPT是临床上检查肝功能是否正常的重要指标之一。 GPT作用于L-丙氨酸和a-酮戊二酸后生成的一种产物——丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙。2,4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕红色,其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比,可用分光光度法进行丙酮酸定量测定。因此在一定的条件下,可进行GPT活力的测定并计算出血清中GPT的活力单位数。 实验试剂 1 试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、坐标纸、新鲜人血清或兔血清。 2、试剂 (1)0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4, 称取Na2HPO4.2H2O 2.8844g(或Na2HPO4.12H2O 5.8028g)和NaH2PO4.H2O 0.5244g(或NaH2PO4.2H2O 0.5930g)，溶于200ml蒸馏水。 200906034010 唐丹 200906034021 郭力 (2)2μmol/L丙酮酸钠标准液 取酮酸钠22mg，溶于100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4,中。 (3)GPT底物液 称取a-酮戊二酸29.2mg和L-丙氨酸0.891g(或D, L-丙氨酸1.782g)，溶于适量的0.1mol/L磷酸缓冲液中，用1mol/LNaoH调至pH为7.4，再以0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4,定溶至100ml，冰箱中保存。 (4)2,4–二硝基苯肼液 取2,4–二硝基苯肼19.8mg，加入到7 ml浓盐酸中不断摇动，待溶解后加蒸馏水定溶至100ml，棕色瓶保存。 (5)0.4mol/L NaOH溶液 操作步骤 1、标准曲线制作 (1).取试管6支,标号，进行操作。 试剂/试管0 1 2 3 4 5 编号 V(0.1mol/L0.10 0.10 O.10 0.10 0.10 0.10 磷酸缓冲 液)ml V(GPT0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 底物液)/ml V(丙酮0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 酸钠标准 液)/ml 200906034010 唐丹 200906034021 郭力 相当于丙酮0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 酸实际含量 /μmol (2)混匀后，置37?水浴预温5分钟，再分别加入2,4–二硝基苯肼液0.5ml，混匀，保温20分钟，各加入0.4mol/L NaOH 5ml，混匀继续保温10分钟，取出，冷至室温。 (3)以0号管为对照，在520nm波长下用分光光度计测定各管的吸光度(A520)。 (4)以丙酮酸的实际含量(μmol)为横坐标，各管的吸光度(A520)为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2.血清GPT活力的测定。 (1)取试管两支，标明测定管和空白管，各加入GPT基质液0.5ml，37?水浴保温5分钟。 (2)向测定管中加入血清0.1ml，混匀后立即计时，继续在37?水浴中保温30分钟。 (3)至30分钟后，向测定管和空白管各加入2,4–二硝基苯肼液0.5ml，混匀，向空白管补加0.1ml的血清。 (4)2支试管各加入0.4mol/L NaOH 5ml，混匀，保温10分钟后，取出，冷至室温 (5)以空白管为对照，读取520nm波长下测定的吸光值A520。 (6)在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数，并换算出丙酮酸的μg数。 (7)血清GPT活力计算:本方法规定在37?，PH为7.4时，血清中的GPT与GPT底物液作用30分钟每生成2.5μg丙酮酸的酶量为1个酶活力单位(U)。据此计算每1ml血清中GPT的活力单位数。 要点提示 1、 制作标准曲线时，需加入一定量的GPT底物液(内含a-酮戊二酸)，以抵消由 于a-酮戊二酸与2,4–二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙的消光影响。 200906034010 唐丹 200906034021 郭力 2、 当酶浓度较低时，测定值与空白值相差很小，准确性较差。 3、 为防止测定中造成的误差，少量液体的加入最好用准确度很高的可调移液器代 替移液吸管。 4、 实验用人血清的制取。 供血者早晨空腹，由专业医务人员抽取血液5-7ml，放在干燥洁净的试管中，于30-35?的恒温箱中自然血凝，3-5h即得血清。 5、一般正常人1ml血清中GPT的活力单位测定值小于40U。