四溴联苯醚BDE47对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应研究（可编辑）

四溴联苯醚BDE47对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应研究（可编辑） 四溴联苯醚BDE47对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与 毒性效应研究 谨以此论文献给我的导师、家人和我的朋友;钆 一 ,;四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因 表达与毒性效应的研究 学位论文完成日期:塑如二手./厂 指导教师签字:毒引 答辩委员会成员签字::刍瓣 甄 ?罄塾 ?必哞 ?酊独创 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其 他人已经发表或撰写过的研究成果, 也不包含未获得 注:如没有其他需要特别声明的,本栏可空或其他教育机构的学位或证书使 用过的。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明 确的并表示谢意。 学位论文作者虢许越毕字慨知牌绷。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,并同意以下 事项: 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许 论文被查阅和借阅。 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学 “中 国学术期刊光盘版电子杂志社’’用于出版和编入《中国知识资源总库》, 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据 库》。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签字 谭超群 签字日期:知卜年‘月/日 签字日期:勘,年月习日四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒 性效应的研究 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与 毒性效应的研究 摘要 ,是一类新型的溴系阻 多溴联苯醚 燃剂,广泛应用于电子产品、涂料和各种纺织品中。由于具有难降解性、 稳定性、高脂溶性和生物放大作用,能够通过食物链的转移,使处于高位营养 级 的生物受到毒害,最终导致对人体的神经、内分泌、生殖系统造成危害。近 年环 境中的浓度不断上升且已在世界各地普遍存在,又因的化学结构与 多氯联苯 ,和滴滴涕,一一 ,,,非常相似,因此的环境毒性越来越受到学 者们的关注。菲律宾蛤仔是我国沿海重要的滩涂贝类。 本论文以菲律宾蛤仔为研究对象,分别从分子生物学和酶学水平全面系统的 研究 了.对菲律宾蛤仔相关解毒代谢酶基因,解毒代谢酶活力及损伤的影 响,初步探讨了.在菲律宾蛤仔体内的毒性效应过程。 菲律宾蛤仔细胞色素基因的克隆、序列及组织 特异性 本研究通过相近物种氨基酸序列的同源性比对,根据保守氨基酸序列 兼并引物,成功调取的核心片段 。根据已知片段分别设计扩增’ 和’核酸序列的特异性引物,利用改良的末端加尾法和技术成功克隆 了菲律宾蛤仔基因的完整序列。菲律宾蛤仔基因全长 , ,长 ,编码个氨基酸。将菲 开放性阅读框 律宾蛤仔的氨基酸序列与其它物种的氨基酸序列进行同源性比较发 现,具有较高的保守性。通过技术研究发现,基因只在菲律 二’ 宾蛤仔鳃,消化盲囊及闭壳肌中表达,而外套膜和足中没有表达。 菲律宾蛤仔谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆、序列分析及 组织特异性 本研究通过相近物种氨基酸序列的同源性比对,根据保守氨基酸序列四溴联 苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 设计兼并引物,利用成功调取的核心片段 。根据已知片段 分别设计扩增’和’核酸序列的特异性引物,利用改良的末端加尾法和 技术成功克隆了菲律宾蛤仔基因的完整序列。菲律宾蛤仔 、 ? 全长 ,包括 的:,并编码个氨基酸。将菲律宾蛤仔 的氨基酸序列通过进行过后发现,菲律宾蛤仔基因隶属于 的相似性 亚族,且具有较高的保守性,其中和栉孔扇贝 高达 %。通过技术研究发现,基因在菲律宾蛤仔鳃、消化盲 囊、闭壳肌、外套膜和足中均有表达,且消化盲囊中的表达量相对较低。 一对菲律宾蛤仔鳃及消化盲囊中解毒代谢酶基因表达的影响 本实验将菲律宾蛤仔暴露于不同浓度,.肛/和.“/的一, , , , , , , 并于 分别取鳃和消化盲囊组织,提取总 后通过半定量技术分析两组织中,,和妒基因 表达量的变化。结果表明,.对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊,, 和基因表达量变化影响显著.,而对照组无明显变化。菲律 宾蛤仔鳃组织中的基因暴露于不同浓度的.后呈明显的峰值变化, 而消化盲囊组织中基因在低浓度处理条件下被显著诱导升高,高浓度处理 条件下则直接被抑制,这与两组织中基因的变化趋势基本类似。.“/ 时被显著诱导升高并保持稳定,而. 一处理组鳃组织中基因于 /处理组基因则呈明显的峰值变化,消化盲囊中基因在低浓度处理 组呈持续升高状态,而在高浓度组于 时被显著诱导升高后不断降低,最终低 于对照组水平,但差异不显著.。本研究表明,.可以通过影响相 关解毒代谢基因表达量的变化而影响其在菲律宾蛤仔体内的代谢过程。 .对菲律宾蛤仔组织解毒代谢酶活力与损伤的影响 研究了不同浓度,.,.,.和.?/一对菲律宾蛤仔 鳃和消化盲囊芳烃羟化酶、谷胱甘肽硫转移酶、超氧化物歧化酶 活力和还原型谷胱甘肽含量、损伤值的影响。结 果表明:.对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊、、活力和含 量、,值影响显著.,而对照组无明显变化。在实验时间内,除.肛/ 处理组鳃丝活力与对照组无明显差异外,其它处理组组织活四溴联苯醚对菲 律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 力表现为显著的诱导作用,且在 内呈峰值变化, 后趋于稳定;低浓度 .,.和. /处理组组织、活力和含量均呈现先升 高后下降的趋势,分别于 或 达到最大值, 后保持稳定,表现为恢复 至对照组水平或被诱导和抑制,而高浓度.和.“/处理组则呈逐渐 下降趋势,均被显著抑制,至 或 后变化平稳。除.肛/处理组外, 各染毒处理组组织值均被显著抑制,呈明显下降或峰值变化,至 后均保 持稳定。同时各处理组组织、、活力和含量、值在稳定后 分别与.浓度呈显著的正、负相关性.。由此表明,在 染毒作用下菲律宾蛤仔组织解毒代谢指标和损伤表现出明显的时间、剂量 效应性,经相关性分析提出菲律宾蛤仔鳃、消化盲囊活力和组织损 伤可作为污染评价的生物标志物。 关键词:四溴联苯醚;菲律宾蛤仔;基因克隆;基因表达:解毒代谢酶;生物标 志物;四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究一 . , . , . ? . , ’ ,, , 一一,,. , 淅谢 , .. ,矿 . . .’’ ,,, 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应 的研究 ..,. , , ’ ,. ? ,. : 矿.? . ’ ‘, ’, , 、析廿 . ..、析 ? . , ., ,, ,. 形 , . /,. / , , , , , , . , . ., 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 ./. 、殖形..熠几 妒. .,, 。. ?.. , , ,西形. . 、析 . . / 印 秘 扩. ,?.,.,. .. ?.,.烬几 , ,. 仃 . ? /,, . ? .. :; ; ; ; ;四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究四溴联 苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 目录 第一章文献综述??. 性质、来源及危害?. . 的物理化学性质? .海洋环境中的来源及分布. ..海洋环境中的来源??. ..海洋环境中的分布. 的危害.. 对生物体毒性效应的研究进展“海洋污染监测现状??. . 污染的化学监测法. 污染的生物标志物监测法?. 本研究的目的和意义 第二章菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因的克隆与序列分析??. 第一节菲律宾蛤仔细胞色素酶基因的克隆与序列分 析?.. 材料与方法? .实验材料?.. .实验方法?.. ..调取基因的核心片段...总提取...组织样品总中的消除??. ... 合成?. ... 扩增条件? ..末端加尾法技术扩增.’??.. ...总提取?四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研 究 ...组织样品总中的消除?.. ...末端加尾法的合成? ... 扩增条件。 .. 技术扩增.’??.. ...总提取?.. ...组织样品总中的消除?.. ... ’. 合成... 扩增条件.. ..目的基因的回收纯化?. ..目的基因的克隆与测序. .. 的组织特异性分析 .序列分析与系统进化树构建实验结果 .菲律宾蛤仔基因全序列分析??. .氨基酸同源性分析与结构功能域比较? .系统进化树构建?.. .组织特异性分析? 讨论. 第二节菲律宾蛤仔谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆与序列分 析??.. 材料与方法.. .实验材料? .实验方法..调取基因的核心片段...总提取...组织样品总中的消除?.. ... 合或?. ... 扩增条件? ?四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 ..末端加尾法扩增’??. ...总提取? ...组织样品总中的消除.. ... 合成?. ... 扩增条件.. .. 技术扩增’。 ...总提取? ...组织样品总砒蛆中的消除?:. ... 合成? ... 扩增条件? ..目的基因的胶回收纯化一 ..目的基因的克隆与测序? .. 基因的组织特异性. .序列分析与系统进化树构建实验结果 .菲律宾蛤仔基因全序列分析.:??.. .氨基酸同源性分析与结构功能域比较? .系统进化树构建? .组织特异性分析??。?. 讨论? 第三章四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达的影 响.:. 材料与方法. .实验材料? .实验方法? ..实验梯度设置?. ..样品制备?.. .. 反应体系及程序?. 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 .数据处理与分析? 实验结果?一 . .对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊中基因表达的影响.. . .对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊基因表达的影响? .对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊基因表达的影响. . .对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊基因表达的影响讨论 第四章四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔组织解毒代谢酶活力与 损伤的影响? 材料与方法 .实验材料? .实验方法? ..实验梯度设置? ..样品制备 ..解毒代谢酶活力的测定. .. 损伤的测定? .数据统计分析实验结果??. . .对菲律宾蛤仔组织解毒代谢酶活力的影响?。 . .对菲律宾蛤仔组织损伤的影响? .菲律宾蛤仔组织解毒代谢和损伤指标与.的相关性?一 讨论.. . .对菲律宾蛤仔组织解毒代谢酶活力和损伤的影响.基于菲律宾蛤仔的生物 标志物的探讨. 结 论??. 参考文献致 个 发 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 第一章文献综述 多溴联苯醚 ,是一系列含溴原子的芳 香族化合物。根据苯环上溴原子的个数和位置的不同,多溴联苯醚总共有 种同分异构体。其最大的用途是作为阻燃剂,在制造过程中被人为添加到复 合材 料中去,一般占总量的%一%,主要为了提高产品的防火特性。目前, 已被广泛用于电子电器设备、自动控制设备、建筑材料和纺织品等商品化产 品。 对的研究已证实低溴类如.,,等生物毒性明显,可导致 内分泌紊乱,具有神经行为毒性,且其某些同源物可能具有致癌性等效应 ,。 ,:陈敦等,;周俊等,; 年联合国环境规划署将列入持久性有毒化学污染物 ,研究清单中江桂斌,,年月《关于持久性 有机污染物的斯德哥尔摩公约》缔约方大会第四届会议上将含有 个溴原子的种列入受控范围。 性质、来源及危害 . 的物理化学性质 图. 结构式 ..四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 是一类包含有种同系物的溴代二苯醚类化合物。其化学通式为 卜卜?,化合物的结构式见图.,依溴原子数量不同分为个同系 组,共有种同系物,和多氯联苯一样都按编号系统编号。 具有相当稳定的化学结构,很难通过物理、化学或生物方法降解,是一种 新型的持久性有机污染物 ,,并且随着溴 原子数的增力的蒸汽压线性降低。等报道在水中的溶 随溴含量的增加而增加。在高 解度一般随溴含量的增加而减小, 温分解时产生溴原子,溴原子可以捕获羟基自由基、氧自由基等燃烧反应的核心 游离基,达到阻燃灭火目的薛铮然等,。多溴联苯醚阻燃效率高,热稳 定性好,添加量少,对材料性能影响小,价格便宜,因而作为一种添加型阻燃剂 被广泛地应用在电子、电器、化工、交通、建材、纺织、石油、采矿等领域中。 .海洋环境中的来源及分布 ..海洋环境中的来源 的直接排放是海洋环境中污染的主要来源。沿海地区生产 和使用作阻燃剂的工厂,如阻燃聚合产品生产厂,塑料制品厂,纺 织品生产厂等,通过直接污水排放将释放到海洋环境中。另外,一些垃 圾回收厂特别是电子垃圾回收厂,长期堆放的垃圾经过雨水的渗透和冲刷,将电 子产品所含有的带入到海洋中。河流入海口是海洋环境中一个主要 的输出源。由于具有低水溶性和极易吸附于颗粒物中,所以陆源的 可以通过河流底泥转移到海洋环境中。这其中主要的是高溴代联苯醚,因为低溴 代的联苯醚相对于高溴代的水溶性比较强,并且低溴代联苯醚易于被水体生物所 吸收。陆地上的面源在河流入海口处汇聚成点源,进而通过潮水的稀释和 扩散作用转移到整个海洋环境中。 大气沉降是海洋环境中的另一主要污染来源。是作为添加型阻 燃剂不受到化学键的束缚,因此在含有的产品中、城市医院垃圾的焚烧以 及意外的火灾中都会不同程度的释放到空气中。由于的蒸汽压比较 低,在空气中会有少量的低溴代联苯醚以气相的状态存在,适于远距离迁移。 等人报道在年采集的北极和美国大湖地区的空气样品中测到 了。其中.最多,其次,但.并未检测到。大部分 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 是吸附在空气粉尘中,通过大气环流作用进行远距离搬运,最终沉降到海 ’ 洋环境当中。 ..海洋环境中的分布 多溴联苯醚的使用主要以高溴代物为主。高溴代联苯醚在海洋环境中比较稳 定,并且大部分都沉积在海洋沉积物当中,海洋生物体很少检测到高溴代联 苯醚 的存在。而低溴代联苯醚因为具有比高溴代联苯醚高的挥发性、水溶性和生 物富 集性,所以底泥、水生生物、水中都有低溴代联苯醚的存在。, 年在美国的土壤和污泥中首次发现了的存在 ,自此,不断有关于在水环境中检出存在的报道。如已有研究表明’ 香港近岸海域表层水体和珠江口水体中浓度最高可达. /和. ,;罗孝俊等,,珠江三角洲和南海北部海域表层沉 / 积物中的含量高达./陈社军等,已属 的高污染区域。高溴代联苯醚由于具有低挥发性、低水溶性而容易吸附于泥土和 颗粒上,海水中仅有少量的低溴代联苯醚,所以绝大部分的联苯醚最终归宿都沉 降在海洋沉积物当中。 默 由于海洋生物对低溴代联苯醚尤其是溴代联苯醚吸收强且代谢慢,生物 富集性强,所以海洋生物是醚的又一归宿。生物体内主要以.,。, 垮 ,,为主,其中以为最多,一般占总的%以上,并且 随着食物链关系的上升浓度增大,而.却很少检出。 等对全球各海域非海岸区域中正鲣肌肉中的含量进行了测定,其中报道了 我国东海及南海的污染状况,结果表明中国海域取的三个点是除台湾海之外检出 最高的海域。 等人报道在荷兰采的条比目鱼和鲷鱼以及个 贻贝中虽然.,的浓度在/干重的级别,但一还没有达到检出 限。由表看出,我国的东江、珠江一带受的污染比较严重,是目前世界 上已报道沉积物中含量最高的区域之一,其次是香港。渤海湾、青岛近海处于较 低水平。总体上,随着时间的推移部分国家和地区海洋沉积物在海洋环境 中的含量呈现出明显上升的趋势。从表.调查结果看出,海洋生物体内 含量最高的是香港的海豚,其次是瑞典的鱼。青岛近海及渤海贝类体内 含量是以干重计算,结果处在较低水平,说明这两处受污染较轻。如表. 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 是目前中国及世界上部分国家关于海洋环境的调查结果。 表.世界部分国家关于海洋环境中的调查结果 . ?. 报道/ 研究地 . 参考文献 环境介质 调查时 点 间香港 近岸海水 . . . / / .?. . 珠江口 水体 罗孝俊 / /香港 .. 沉积物 ../ /.. ? 新加坡 沉积物 / 渤海湾 沉积物 吕杨王立宁 .?./ ./ 青岛 沉积物 . 杨永亮 .?./ / .. 环渤海 沉积物 林忠胜等 / 湾入海 口 .?. .. 珠江河 鱼类 向彩虹 / / 口香港 贝类 ?./ 青岛 贻贝 杨永亮等 ./ . .?. 环渤海 软体动物 刘汉霞等 / 注:没有范围标志的为平均值,参考文献中未提及的数据未空白。 . 的危害 多溴联苯醚作为一种新型的全球性的环境污染物,已成为当前环 境科学的研究热点,尤其是在海洋领域的研究最为活跃。结构类似于 和甲状腺激素。曾广泛用作电子绝缘材料,因被发现可导致学习记忆能力 损害、免疫失调、致癌性等,在二三十年前已被禁用,由取代。但目前研 究认为同样具有生物毒性,破坏甲状腺功能、削弱学习和记忆能力,改变 行为举止,令听觉神经受损,积聚于靶器官如睾丸、卵巢等,降低精子数,造成 畸形胎儿,甚至引发癌症等。 对生物体毒性效应的研究进展 近几十年已有大量学者对在海洋生物中的毒性效应进行了研究,认为 其在动物体内的代谢有两个过程 ,,如图.所示:其中第 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 一个过程主要是在混合功能氧化酶系,如.乙氧基..异吩恶唑酮.脱乙基 酶等的作用下转化为更具极性的相代谢产物,这些代谢产物在相 代谢酶的催化下进一步与内源物质分子结合,如谷胱甘肽..转移酶催 化的谷光甘肽结合,使代谢产物水溶性增强加速了毒物排出体外的速度, 同时在生物转化过程中会产生氧化还原循环,这样一方面母体化合物产生 的活性中间产物本身是自由基代谢物,可与、蛋白质共价连接生成加 合物和蛋白质加合物,产生加合物的位点会通过自身碱基切除而进一步形成 链断裂;另一方面,在氧化还原循环中还产生大量的活性氧,在一定范围 内,这些活性氧能被体内抗氧化防御系统包括超氧化物歧化酶 ,、谷光甘肽过氧化酶 ,和过氧 化氢酶,等清除,但当抗氧化防御系统不能消除这些活性氧时, 会造成脂质过氧化 ,、和蛋白质氧化损伤等毒性效 , , ,; ,。 应 目前对毒性的了解主要来自动物实验。如等将淡水双贝壳 暴露于一定浓度的.下,发现.可导致损伤,具有遗传毒性, 但与剂量无正相关;等用.干预体外培养的肝癌细胞, 提示.可促进活性氧自由基产生,诱导凋亡,抑制肝癌 细胞增值,且与暴露时间及浓度呈正相关,而加入抗氧化剂可抑制 的生成。徐八一等将一定剂量的作用于人神经母细胞瘤. 后发现,可诱导.细胞微核和核浆桥的形成,具有致突变作用。 等研究显示.可引起蓝贝类腮染色体异常如微核、核芽。同 样,等发现暴露于.的鱼其外周血红细胞微核率增加。以 上研究表明,一定浓度的可以引起机体发生氧化应激,产生活性氧,并对 机体造成一定的氧化损伤。 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 排出胞外 细胞外细胞内 ..........一 代谢途径 诱 排 导 出 相代谢酶 相代谢酶 通 抗 胞 路 氧 外 化 清除 防 活性氧类 御 活性中间产物 系 统 加合物 氧化损伤 链损伤 图. 在细胞内代谢过程与损伤效应. 相对于酶活水平的的研究而言,关于对生物体分子生物水平影响的 研究尚鲜见报道。 海洋污染监测的现状 . 污染的化学监测法 随着科技进步和人们生活水平的不断提高,大量的通过工业废水或生 活污水等方式排放到水体中,其造成的环境问题及对人类健康的影响引起人们的 广泛关注。美国是最早开展化学污染物监测的国家,而我国对毒害有机污染物的 环境科学研究起步较晚。目前,国内的化学监测的常用指标包括水体及沉积物中 污染物的含量和化学耗氧量等,主要是通过化学分析了解环境中污染 物的浓度,难以反映污染物对生物体的毒害作用,因而其环境风险很难被合理的 评估。年,美国斯克里浦斯海洋研究所 .教授在海洋污 染通报评论中首次倡仪在全球尺度实施海洋环境监测计划一贻贝监测计划。贻贝 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 监测 就是利用双壳类软体动物体内的污染物残留量,监测和评 价海洋化学污染状况及化学浓度空间和时间分布趋势的一种监测方式。 . 污染的生物标志物监测法 严格来讲,贻贝监测计划仍是一种以指示生物作为监测介质的化学监测,必 须与生物学效应监测技术相结合才能更全面的反映污染物潜在的环境风险。 生物 标志物是指生物材料与接触有关的一切变化,包括生理、生化、免疫、细胞和分 子水平的改变。年美国国家科学院国家研究委员会将生物标志物 定义为“生物学体系或样品的信息指示剂”。亦有些学者认为生物标志物的概念 非常广泛,指在任何生物学水平上用于测定污染物暴露和效应的指标,包括亚个 体、个体、种群、群落和生态系统 ,。然而,当有机体受 到环境胁迫或是毒物干扰时,首先会引起基因和分子水平的变化,接着是细胞、 组织、器官以及整个机体水平的变化,最终导致种群、群落以及生态系统的变化。 运用个体水平上生物标志物进行监测,可以避免在更高水平的毒害作用和不利影 响,为环境污染提供早期的报警信号,因此目前普遍赞同和应用的概念则是基于 在年提出 亚个体和个体水平,其中最为经典的是 的:通过测定体液、细胞或组织,可在生化或细胞层次上揭示污染物存在或生物 ,。 体所产生的反应指标 本研究的目的和意义 海洋环境中的污染日益严重,其中是生物样本中存在最多的 单体,其对海洋生物的毒害作用以及对人类健康的影响引起世界各国的广泛关 注,多种的单体以及一些单体的混合物陆续被禁用。而菲律宾蛤仔是我 国沿海重要的滩涂贝类,对海洋环境中的有机污染物具有很强的生物富集作用, 是海洋表层沉积物重要的指示生物。本研究通过克隆分析菲律宾蛤仔的解毒代谢 酶基因和测定菲律宾蛤仔暴露于后不同水平上解毒代谢酶指标的变化, 初步探讨对菲律宾蛤仔的毒性效应和致毒的机制,为的海洋环 境监测和在生物内体的代谢机制提供一定了的理论依据。 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 第二章菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因的克隆与序列分析 第一节菲律宾蛤仔细胞色素基因的克隆与 序列分析 细胞色素是细胞色素力氧酶系的重要组成部分, 这是一类广泛存在于动物、植物、微生物中的血红素铁结合蛋白超基因家族冷 欣夫等,。与细胞色素即.细胞色素还原酶和.细胞色 素共同构成了这个酶系。作为酶系的主要组成部分,细胞色素在生物体 内主要分布于线粒体和微粒体膜上,主要功能区域是血红素铁结合区。细胞 色素 在哺乳动物中参与代谢类固醇化合物如前列腺素、白细胞三烯等物质已见 报道 ,,其中的.家族主要参与代谢环境污染物、致癌 ,。 物质、细菌内毒素等外源化合物冷欣夫等,; 细胞色素已报道有多个家族,在动物、植物和微生物中共克隆发现了 多个基因,但作为家族,目前仅在斑马鱼膨,.训、中国对虾 、海兔螺 、栉孔扇 ,,在菲律宾蛤仔中的克隆 等中被克隆鉴定 尚未见报道。菲律宾蛤仔在分类上属于真瓣鳃目 、帘蛤科、 蛤仔属,是我国沿海重 要的滩涂贝类,常埋栖于~ 深的泥沙中,营滤食性生活,代谢率低,对海 洋环境中的有机污染物具有很强的生物富集作用,是海洋表层沉积物重要的 指示 生物。近年来,海洋环境的污染日益严重,分子生物标志物监测技术应运而 生。 本研究成功的克隆和鉴定了菲律宾蛤仔基因,为双壳贝类体内基因的 功能研究及监测海洋环境污染提供了基础的理论参考。 材料与方法 .实验材料 实验所用菲律宾蛤仔购于青岛市红岛贝类养殖场,壳高.?.锄, 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 温度为.?.,连续充气,日换水~/,养殖密度为~个/,并投 喂螺旋藻粉,日投饵量约为贝类软体部鲜重的.%。 .实验方法 ..调取基因的核心片段 ...总提取 以下操作过程中所用离心管、枪头及溶液需经.%焦碳酸二乙酯 高温 ,水处理,玻璃仪器及金属器皿需经 烘烤 以上或 过夜。 将菲律宾蛤仔置于冰盘中解剖,取鳃组织立即置于液氮预冷的研钵中,倒入 液氮研磨成粉末。称取~ 离心管 粉末于水处理过的. 。 中,加入 ,充分混匀,于 离心 ,室温 , 收集上清液,加入. 氯仿,用漩涡振荡器混匀样品 于 。 离心 异丙醇,充分混匀’,室温放置 将水相转移到一新的离心管中,加入. 。然后于 收集沉淀。 离心 。 %乙醇用水配涡旋洗涤沉淀, 用 离心 重复一次。 ~ 吸尽残存乙醇,真空干燥 ,沉淀溶解于此水中。 紫外 测试浓度和纯度:取此溶液稀释倍, 分光光度计测定浓度以及光吸收、,当/在..时, 表明所提总质量较好。取此总溶液用%琼脂糖凝胶电泳检测 . 其完整性。其余可置于. 长期保存。 ...组织样品总中的消除 为了防止基因组的污染,取 总进行无酶活性的 。 处理。无酶活性的 试剂购自 处理如下: .在一无酶的离心管中配制此的反应液: 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 组分 用量 无酶的酶 /肛. /此 总 昭 水 补足至“ 。 .反应 。 .加入止的 .加入 等量的苯酚/氯仿/异戊醇::,充分混匀。 .离心,取上层水层移至另一微量离心管中。 .加入此等量的氯仿/异戊醇:,充分混匀。 .离心,取上层水层移至另一微量离心管中。 .加入 /量的.。 。 放置~ .加入此.倍量的冷无水乙醇,. .离心回收沉淀,用%的冷无水乙醇清洗沉淀,真空干燥。 .用适量的 溶解,琼脂糖凝胶电泳确认是否除去基因组,然 后进行后续实验。 ...反转录反应第一链的合成 .将反应液按顺序加入到无酶和酶的 薄壁离心管中: 药品 用量 备注补足至终体积 . ; 反应体系 : 厶 .?. 模板 不能改变模板和引物的比例浓度一般 为. ‖? 将离心管置于仪中 加热 ,取出立即 冰浴 ,稍离心。 .继续按顺序加入一下药品: 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 药品 用量 备注 ×反转录 ? “ /. 反转录酶。 涡旋混匀,稍离心。将离心管置于仪中加热 ,加热 保存, .将制备的分装,并用.检验的质量可用后 用于调取基因。 . ... 扩增条件 参考上收录的已知物种的氨基酸设计兼并引物。参考物种如 , 下:家鼠 ,紫贻贝 ,翡翠贻贝 斑马鱼 ,沙蚕 等。通过 ,非洲爪蟾 比对选取保守氨基酸区域,利用 按照如下几点设计 .和 兼并引物: 选择同源性高且兼并度低的氨基酸区域,兼并程度最好不要超过; 根据生物使用密码子的偏好性,选择使用率最高的密码子,进一步限定引物 ’’ 的兼并度; 引物的’端不应存在兼并; 双链形成所需的自由能应该以’端向’端递减,’端最好不要 . 高于./; ,, .. 引物长度一般为 ,常用的是 ,含量一般为%,以 ~%为宜。 . .兼并引物: :’..’ :’ .反应体系如下:四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应 的研究 成分 用量 补足到皿. . . 聚合酶 模板 肛 .程序: 预变性 , , 变性 ,退火温度为. ,。延伸 。 . 个循环后 延伸 ..末端加尾法技术扩增?’ ...总提取,方法同本节.... ...组织样品总中的消除,方法同...。 ...末端加尾法的合成 纯化. ~ 。 用 .。步骤如下: 向反应液中加入倍量的 若需加入的 量不足 此时应加入 ,然后混匀; 安于上,加入步骤液体, 离心 ; 重新将步骤滤液再 ,弃滤液; 离心 加入 , ,弃滤液; 离心 , ,弃滤液; 加入皿 离心 重复步骤; ; 曲将安于新管上,在膜中央加入~此灭菌水,室温静止 ,洗脱。 离心 热变性 在. 的管中加入四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研 究. 此.嵋 .% .此 超纯水 合计 : 热变性 ,至于冰上 ,稍离心 , .? 加尾 保温 加入酶此,混匀, 保温 ,灭活,置 保存,该样品用于’ ,. ...扩增条件 根据已扩增出的核心片段,参照特异性引物设计的基本原则设计扩增 ’. .’端的引物,实验中所用到的引物序列如下: 囊 引物名称 序’一’ . ’ . .。 ’. :不 .一次扩增: 反应体系: 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 程序: .二次扩增:将一次扩增的模板稀释倍后作为二次扩增的模板. 聆反应体系: 成分 用量 . 此 ’. . .此 ’ 程序: 四溴联苯醚对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 .. 技术扩增.’ ...总提取,方法同.... ...组织样品总中的消除,方法同.... ... ’. 合成.所用试剂盒为 ,具体方法如 下: .在无核酸酶的管中按顺序加入如下成份: ’ 水 补足到此 ’ 旺 至少 样品此 ,立即冰浴 。 .轻轻吹吸混匀,。孵育 .轻轻吹吸混匀稍离心后按顺序加入如下成分: 用量 成份×.皿吐 肛 。 轻轻吹吸混匀稍离心, 热盖孵育. 稀释产物 .用? 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 根据起始反应加入的量 确定. 用量 此 此。 加热 ’样品分装保存在一。。 .所得 ... 扩增条件 根据已扩增出的核心片段,参照特异性引物设计的基本原则设计扩增 .’端的引物,实验中所用到的引物名称及序列如下所示: 引物名称 序’.’ . 册 . 江 。卫蛆 .一次扩增反应体系: 用量 成分 . .此 . ‘. .“ . 模板 , 程序: 预变性,. 变性 ,退火温度为 延伸,个循环后 延伸。 .二次扩增巢式反应体系: 将一次扩增的模板稀释倍后作为二次扩增的模板 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 成分 用量 .止 . ...肛 模板 “ 程序; 预变性, , 变性 ,退火温度为 延伸,个循环后 延伸。 . ..目的基因的回收纯化采用 回收凝胶中的目的片段,具 ’ 体步骤如下: 使用新配制的缓冲液制作琼脂糖凝胶,然后对产物进行琼脂糖凝 ”~ 胶电泳。 在紫外灯下切出含有目的的琼脂糖凝胶,注意尽量切除不含目的 部分的凝胶,尽量减少凝胶体积。 称量胶块重量,计算胶块体积,以 进行计算。 , 的加量如下表: ?向胶块中加入胶块融化液 凝胶浓度. 使用量 .% 个凝胶体积重 .‰.% 个凝胶体积重 .%.% 个凝胶体积重 均匀混合后 加热融化胶块,期间上下颠倒离心管以使胶块充分融化约 。 向上述胶块融化液中加入 量的/体积量的 ,均匀 混合。当分离小于 的片段时,应在此溶液中再加入终浓度为 %的异丙醇。 上。 安置于 将试剂盒中的 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 ,弃滤液。 中,, 将上述操作的溶液转移至 离心 重复一次。 将 中,, ,弃滤液。 的加入 离心 将 的 预先加入指定体积的%醇加入 中,, ,弃滤液,重复一次。 离心 安置于新的. 的膜中央处 将 的离心管上,在 。 加入“的灭菌蒸馏水,室温静置 , 洗脱。 离心 重复步骤和。 ..目的基因的克隆与测序 .大肠杆菌感受态细胞的制备: 将大肠杆菌. 下甘油保存在平板上划线, 过夜培养,从 平板上挑出个直径为~ 大小的单菌落,移至含 培养基中 过夜培养。 震荡 按:的接种量转移到 的培养基约 菌液, 培养 ,使在..之间,使细菌到达对数生长期或对数生长前 期。 取. 菌液到. 冰预冷的离心管中,冰浴 ,使培养物冷却至 。 下 ,收集菌体,倒掉上清,将管倒置 离心 . 以使最后的痕量培养液流尽。然后加入新鲜配制的冰预冷的. /的,用移液器缓慢悬浮,置于冰上 ,使细胞致敏。 。下 ,收集菌体,加入新鲜配制的冰预冷的 离心 . /的,用移液器缓慢悬浮,冰浴几分钟,即为感受态细胞。若 不马上转化,可加甘油%于. 保存。 .连接转化反应: 在. 的微型离心管中配制反应体系: 四溴联苯醚.对菲律宾蛤仔解毒代谢酶基因表达与毒性效应的研究 皿 一载体 纯化产物. 旺 连接酶液 . 总体积 “ 至过夜。 连接反应 ,。 全量 转化至感受态细胞此中,冰浴 热激 , ,冰浴 后加入】 液体培养基,置于 震 。 荡培养 取此均匀涂布于含有.、、的琼脂平板培养基上, 置于生化培养箱中 过夜培养。 挑选白色菌落,使用菌落法确定是否是目的重组子。 目的基因片段的测序: 挑取单个目的重组子接种于 液体培养基中, 震荡过夜培养后, 送往上海联众基因研究院进行目的基因的测序。 .. ‰’ 的组织特异性分析 选取健康有活力的菲律宾蛤仔只,取组织鳃、消化盲囊、闭壳肌、外套膜、 足个组织,分别提取总,酶处理后用 进行反转录,以得 到的为模板,具体试验方法见.....,根据目的片段参考..中引 物设计的具体要求设计.和的特异性引物,以.做内参。 上游引物 下游引物声汀 扩增反应遵循酶促反应定律,扩增产物最初呈指数累积,产物与模板 呈线性关系,但是随着酶活性下降和溶液中反应物的消耗,扩增反应会进入 平台 期,在平台期继续扩增,低水平表达的目的可能会增加,并与高水平表 达的目的浓度相近,因此进行半定量时应在线性范围内选择合 适的循环数。 反应体系及程序如下: