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_增免散_对ND疫苗免疫雏鸡抗体效价和胸腺发育的影响

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_增免散_对ND疫苗免疫雏鸡抗体效价和胸腺发育的影响_增免散_对ND疫苗免疫雏鸡抗体效价和胸腺发育的影响 本文由zd725188贡献 pdf文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT,或下载源文件到本机查看。 第 27 卷第 2 期 2006 年 6 月 扬州大学学报 ( 农业与生命科学版) Journal of Yangzhou U n iversity (A gricultural and L ife Science Edition V o . 27 N o. 2 l J un. 2006 “增免散” ND 疫苗免疫雏鸡抗体效价和 对 胸腺发育的影响...
_增免散_对ND疫苗免疫雏鸡抗体效价和胸腺发育的影响
_增免散_对ND疫苗免疫雏鸡抗体效价和胸腺发育的影响 本文由zd725188贡献 pdf文档可能在WAP端浏览体验不佳。建议您优先选择TXT,或下载源文件到本机查看。 第 27 卷第 2 期 2006 年 6 月 扬州大学学报 ( 农业与生命科学版) Journal of Yangzhou U n iversity (A gricultural and L ife Science Edition V o . 27 N o. 2 l J un. 2006 “增免散” ND 疫苗免疫雏鸡抗体效价和 对 胸腺发育的影响 姜国均1, 2 , 周帮会2 , 马清河2 , 史书军2 , 刘宗平13 关键词: 雏鸡; 增免散; 胸腺; T 淋巴细胞; 细胞凋亡 1, 2 (1. 扬州大学 兽医学院, 江苏 扬州, 225009; 2. 河北农业大学 中兽医学院, 河北 定 州, 073000) 摘 要: 将 300 只 1 日龄雏鸡随机分为空白对照组、 “增免散” 环磷酰胺组、 中药 组、 环磷酰胺组 + 左旋咪唑组、 环磷酰 胺+ “增免散” , 雏鸡 6 日龄时用鸡新城疫 (ND ) L a So ta 疫苗点眼滴鼻, 分别于 7、 、 、 日龄时测定鸡血液新城疫 组 14 28 35 抗体 效价、 胸腺器官指数、 胸腺组织中 CD + 、 + T 淋巴细胞浓度、 胸腺细胞凋亡率, 观察 胸腺的组织结构变化, 探索中 4 CD 8 药 “增免散” 的免疫增强机理。 结果表明: 中药 “增 免散” 不但能增强 ND 疫苗的免疫效果, 促进雏鸡胸腺发育, 提高胸腺 组织中 CD + CD + T 淋巴细胞比值, 而且对环磷酰胺诱导的免疫抑制、 免疫器官损伤和细胞凋亡有一定拮抗作用。 4 8 中图分类号: S 853. 9 文献标识码: A 文章编号: 1671 4652 ( 2006) 02 0059 04 Effect of Ch i ese herba l m ed ic i e“Zengm i n san ”on an tibody n n a titer of ND vacc i e and growth of thym us i ch icken s n n JI ANG Guo- jun , ZHOU Bang- hu i2 , M A Qi g- he2 , SH I Shu- jun 2 , L IU Zong- p i g1 n n (1. C oll of V et M ed , Y ang z hou U niv , Yangzhou, 225009, Ch ina; 2. C oll of T rad C h inese V et M ed , H ebei A g ric U niv , D ingzhou, 073000, Ch ina) . ABSTRACT: 300 one2day o ld ch icken s w ere random ly d ivided in to five group s, i e. , the con tro l group, Ch inese herbal m ed icine“Zengm ian san (Z S) ” group, Cyclopho spham ide group, Cyclopho spham ide+ L evam iso le and Cyco lpho spham ide M + Z S group. A ll ch icken s w ere i m un ized w ith L a So ta on the six day o ld, then the N ew castle d isease (ND ) an tibody, M m the grow th index of thym u s, CD + and CD + T lym phocyte, the cell apop to sis of thym u s, and the patho logical change of 4 8 7, 14, 28, 352day o ld ch icken, to exp lo re the m echan ism of the Ch inese herbalm ed icine thym u s tissue w ere ob served at the “Z S” M how to increase the i m un ity. T he resu lt ind icated that the Ch inese herbalm ed icine“Z S” ld no t on ly heigh ten m M cou the ND an tibody titer, p rom o ted the ch icken thym u s grow th, and increased the CD + CD + T lym phocyte percen tage, bu t 4 8 . also resisted the i m un ity supp ression cau sed by cyclopho spham ide m KEY WORD S: ch icken; Zengm ian san; thym u s; T cells; apop to sis 在养禽生产中, 许多传染性疾病虽然采用相应的疫苗进行预防, 但由于病原种类极其复 杂, 而且不 断产生变异, 致使免疫效果不理想, 甚至导致免疫失败[ 1 ] , 因此提高家禽的 内在免疫机能, 增强其自身 抗病能力, 研究免疫增强剂具有十分重要的意义。 现已发现具有免疫增强作用的物质多达数十种, 如干 扰素、 胸腺类、 脂质体和细胞因子等, 但均存在成本高、 不易提取等缺点[ 2 ]。 有研究[ 324 ] 认为, 一些中药具 有增强和调节免疫的作用, 且污染少、 资源丰富、 毒副作用小。 但也存在其作用机理不甚清楚、 效果不够 稳定等问题。 “增免散” 是由河北农业大学中兽医学院经多年研究、 具有增强鸡免疫功能的纯中药添加剂。 左 收稿日期: 2006 04 23 基金项目: 河北省畜牧局科技攻关项目 (2003 11) 作者简介: 姜国均 (1971- ) , 男, 重庆奉节人, 扬州大学博士研究生, 主要从事临床兽医学研究。 3 联系作者, E 2 ail: liuzongp ing@ yzu. edu. cn m 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 60 扬州大学学报 ( 农业与生命科学版) 第 27 卷 旋咪唑 (LM S ) 是一种非特异性化学免疫增强剂, 一些研究者已经把它作为免疫佐剂应用于疫苗的接 种, 获得了很好的效果[ 5 ]。环磷酰胺 (CY ) 是较强的烷化剂, 它能通过与 DNA 链交叉连接破坏 DNA , 在 免疫药理学上被广泛应用为免疫低下模型的造型剂[ 6 ]。 本试验以环磷酰胺为免疫抑制对照, 左旋咪唑为 免疫增强对照, 研究 “增免散” 对胸腺的组织结构、 细胞凋亡、 + 和 CD + T 细胞的影响, 为揭示其免疫 CD 4 8 增强作用机理提供理论依据。 1 材料与方法 1. 1 中药的制备 “增免散” 煎剂由黄芪、 羊红膻、 何首乌、 贯众、 青蒿、 常山、 神曲按一定比例构成, 采用煎煮法制备原 药水煎剂, 煎剂过滤去渣, 加热浓缩至每毫升含生药 1 g, 装瓶, 高压灭菌, 4 ?保存。 1. 2 试验动物的分组及处理 300 只 1 日龄海兰褐雏鸡购自河北省定州市种鸡场, 随机分成 5 组, 每组 60 只, 其中 组为空白对 照组, 组为中药 “增免散” , 组 组为环磷酰胺组, 组为左旋咪唑+ 环磷酰胺组, 组为 “增免散” + 环磷酰胺组。试验鸡喂全价饲料, 饲养至 6 日龄时用新城疫 L a So ta 疫苗点眼滴鼻免疫; 7 日龄时 、 ( 组灌服 “增免散”2 mL ?kg - 1 ) , 组灌服左旋咪唑 ( 10 m g ?kg - 1 ) , 、 组灌服常水作对照, 均连 续 7 d; 10 日龄时 、 、 组肌肉注射环磷酰胺 ( 80 m g ?kg- 1 ) , 、 组肌肉注射等量无菌生理盐水, 均连续 3 d。 试验期间采用笼养, 鸡自由采食和饮水, 1 14 日龄采用红外线灯保温, 全日制光照。 , 1. 3 试剂与仪器 鼠抗鸡 PE 2 + 、 2 + 单克隆抗体 ( 美国 Sou thern B io tech 公司) , 环磷酰胺 ( 江苏恒瑞医药公 CD 4 PE CD 8 司) , 盐酸左旋咪唑 ( 江苏淮安制药厂) ; 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司) 。 镜观察。 1. 5 数据处理 1. 4 检测项目与方法 1) 免疫器官指数: 于 14、 、 和 35 日龄时各组分别称重, 每组抽取 10 只鸡, 心脏采血 ( 2 mL 加 21 28 6 - 1 PB S 平衡液洗 3 次, 调整细胞浓度为 1×10 ?mL , 按说明加入单克隆抗体, 流式细胞仪检测。 4) 胸腺细胞凋亡: 从各组中随机取出 5 只鸡胸腺, 常规制备单细胞悬液, 流式细胞仪检测。 抗凝剂, 2 mL 不加抗凝剂, 备用) 后剖杀, 取胸腺, 用滤纸吸干表面水分后, 用电子天平称重, 计算器官指 数 [ ( 胸腺指数= 胸腺重量×1 000) 体重 ]。 2) ND 抗体效价: 各组随机取出 5 只未抗凝鸡血, 分离血清, 用 Β2微量法测定 ND 抗体效价。 3 ) 胸腺 T 淋巴细胞 CD + 、 + 亚群: 从各组中随机抽取 5 只鸡的胸腺, 按常规制备单细胞悬液, 用 4 CD 8 5) 胸腺组织学观察: 从各组中随机取出 3 只鸡胸腺, 波恩液固定, 石蜡包埋切片, H E 常规染色, 光 试验数据用 SPSS10. 0 软件以最小显著差数法进行处理。 2 结果 2. 1 “增免散” 对鸡血液 H I 抗体的影响 由表 1 可见, 14、 日龄时 组抗体水平高于其他各组, 、 和 组高于 组, 差异极显著 ( P < 21 0101) ; 28 日龄时 组抗体水平明显高于其他各组, 差异极显著 ( P < 0. 01) ; 35 日龄时各组抗体水平相 近, 差异不显著 ( P > 0. 05) 。 表明中药制剂 “增免散” 对环磷酰胺的免疫抑制具有一定拮抗作用, 能增强 鸡 (ND ) 疫苗的免疫效果, 使抗体水平迅速提高, 延长抗体维持时间。 2. 2 “增免散” 对鸡胸腺器官指数的影响 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 由表 2 可见, 14、 、 日龄时 组胸腺指数高于其他各组, 差异极显著 ( P < 0101 ) ; 14、 日龄时 21 28 21 、 组胸腺指数高于 组, 差异显著 ( P < 0. 05 ) ; 35 日龄时各组胸腺指数相近, 差异不显著 ( P > 0105) 。 表明中药制剂 “增免散” 在用药 3 周内能显著促进胸腺的发育; 2 周内与左旋咪唑效果相近, 对环 第2期 姜国均等: “增免散” ND 疫苗免疫雏鸡抗体效价和胸腺发育的影响 对 61 磷酰胺引起的胸腺抑制有一定的拮抗作用。 2. 3 “增免散” 对鸡胸腺 CD + CD + 的影响 4 8 由表 3 可见, 14、 、 日龄时 组胸 21 28 组别 14 日龄 21 日龄 28 日龄 35 日龄 腺 CD + 、 + CD + 高于对照组, 差异极显 4 CD 4 8 4. 70B + 0. 58 6. 10B + 0. 35 5. 20B + 0. 95 4. 90a + 0. 60 著 ( P < 0. 01 ) ; 组胸腺 CD + 、 + CD + 4 8 CD 4 5. 70A + 0. 70 7. 50A + 0. 55 6. 30A + 0. 30 5. 20a + 0. 55 C C B 4. 20 + 0. 35 5. 50 + 0. 70 5. 10 + 0. 75 4. 90a + 0. 65 高于 组, 差异显著 (P < 0. 05) 。 35 日龄时 4. 70B + 0. 50 6. 00B + 0. 75 5. 20B + 0. 85 5. 00a + 0. 90 + + + 各组胸腺 CD 4 、 4 CD 8 相近, 差异不显 CD B B B 4. 90 + 0. 40 6. 10 + 0. 90 5. 40 + 0. 75 5. 10a + 0. 70 著 ( P > 0. 05) 。表明中药制剂 “增免散” 在用 3 同列不同小写字母数值间差异显著 (P < 0. 05) , 不同大写字母 药后 3 周内能显著增加 CD + T 淋巴细胞数 及大、 4 小写字母数值间差异极显著 ( P < 0. 01) 。 + + 量和 CD 4 CD 8 比值; 2 周内与左旋咪唑作 表 2 雏鸡胸腺指数的动态变化3 用相近, 不能完全对抗环磷酰胺对胸腺的免 Tab. 2 D ynam ic change of growth in dex of thym us in ch icken 疫抑制作用。 组别 14 日龄 21 日龄 28 日龄 35 日龄 2. 4 “增免散” 对鸡胸腺细胞凋亡的影响 1. 35B b + 0. 16 3. 00B b + 0. 25 4. 01B + 0. 72 5. 22a + 0. 91 由表 4 可见, 14、 、 日龄时 、 、 21 28 2. 20A + 0. 12 4. 06A + 0. 82 5. 24A + 1. 29 5. 39a + 1. 78 Bd Bd B 0. 75 + 0. 19 2. 21 + 0. 27 3. 60 + 0. 56 4. 91a + 1. 71 组胸腺细胞凋亡率高于 、 组, 差异极 0. 96B c+ 0. 26 2. 66B c+ 0. 36 3. 80B + 1. 61 5. 01a + 0. 96 显著 ( P < 0. 01) ; 14、 日龄时 组胸腺细 21 0. 98B c+ 0. 28 2. 72B c+ 0. 41 3. 92B + 0. 89 5. 12a + 1. 37 胞 凋 亡 率 高 于 、 组, 差 异 显 著 ( P < 3 同列不同小写字母数值间差异显著 (P < 0. 05) , 不同大写字母 小写字母数值间差异极显著 ( P < 0. 01) 。 0105) 。表明 “增免散”在用药后 2 周内对环 及大、 磷酰胺导致的胸腺细胞凋亡有一定拮 表 3 胸腺 CD + 、 + T 淋巴细胞亚群的动态变化3 4 CD 8 . Tab 3 D ynam ic changes of CD + CD + T subsets in thym us 4 8 抗作用, 但与 组一样, 其胸腺细胞的 % 凋亡率极显著 高于正常组, 且对正常 组 别 14 日龄 21 日龄 28 日龄 35 日龄 鸡胸腺细胞凋亡无明 显影响。 55. 87B + 6. 25 60. 71B + 8. 17 56. 75B + 6. 82 53. 56a + 8. 76 CD + 4 2. 5 “增免散” 对鸡胸腺组织结构的 A A A 69. 33 + 7. 89 81. 29 + 7. 34 70. 63 + 7. 18 59. 42a + 6. 85 C B B 影响 41. 91 + 5. 48 58. 05 + 6. 75 56. 24 + 4. 67 55. 12a + 8. 47 58. 29B + 9. 17 63. 78B + 6. 82 59. 71B + 6. 39 55. 87a + 8. 29 14、 日 龄 时 组 与 对 照 组 相 21 60. 81B + 3. 46 76. 89A + 6. 91 70. 39A + 5. 79 52. 70a + 7. 26 A B B 比, 皮质厚, 皮质内淋巴细胞密集, 髓 CD + 53. 21 + 7. 18 50. 22 + 5. 23 59. 11 + 6. 97 59. 46a + 9. 89 8 56. 37A + 4. 53 61. 46A + 4. 37 64. 21B + 8. 15 62. 31a + 8. 76 质内有较多较大的胸腺小体; 组胸 42. 33B + 5. 28 51. 86B + 3. 28 63. 19B + 11. 08 64. 71a + 9. 05 腺皮质内淋巴细胞和胸腺小体的数量 55. 08A + 4. 76 52. 80B + 5. 37 63. 52B + 10. 75 64. 48a + 8. 29 少、 体积小; 、 组胸腺的皮质较 56. 89A + 3. 79 63. 02A + 6. 12 72. 57A + 9. 16 59. 91a + 9. 06 厚, 淋巴细胞较密集, 髓质内 的胸腺小 3 同列不同小写字母数值间差异显著 (P < 0. 05) , 不同大写字母及大、 体形态和数量变化不明显, 与对照组 小写字母间数值差异极显著 ( P < 0. 01) 。 相 近。 28 日龄时, 组胸腺的皮质占大部 表 4 胸腺细胞凋亡的动态变化 . Tab 4 D ynam ic change of apoptosis in thym us % 分, 淋巴细胞密集且多为中淋巴细胞, 髓质 14 日龄 21 日龄 28 日龄 35 日龄 内小体数量比对照组多; 组胸腺皮质比 组别 B B B 0. 93+ 0. 16 1. 38+ 0. 55 3. 46+ 1. 72 3. 42+ 1. 91a 例增大, 皮质内淋巴细胞密集, 多为中、 小淋 B B B 0. 79+ 0. 12 1. 12+ 0. 82 3. 06+ 1. 29 3. 13+ 1. 78a 巴细胞, 髓质比例减少, 胸腺 小体的数量少、 12. 30+ 4. 19A a 13. 51+ 4. 27A a 7. 85+ 3. 56A 4. 49+ 2. 71a 体积 亦小; 、 组胸腺的皮质占大部分, 7. 23+ 2. 26A b 9. 15+ 3. 36A b 6. 60+ 3. 61A 3. 78+ 1. 96a 6. 95+ 3. 28A b 8. 96+ 3. 41A b 6. 29+ 2. 89A 3. 65+ 2. 37a 皮质内淋巴细胞 密集, 中淋巴细胞多, 髓质 比例大于 组, 稍小于对照组, 髓质内小体 3 同列不同 小写字母数值间差异显著 (P < 0. 05) , 不同大写字母 数量多于 组。 及大、 小写字母数值间差异极显著 ( P < 0. 01) 。 表 1 血清 ND 抗体效价的动态变化3 . Tab 1 D ynam ic change of ND an tibody titer in blood serum log2 3 讨论 3. 1 “增免散” 对鸡胸腺 CD + CD + 的影响 4 8 CD 4 和 CD 8 分子是 T 细胞表 面 型跨膜糖蛋白, 也是 T 淋巴细胞的表面标志。 CD 4 和 CD 8 分子作 1994-2007 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 62 扬州大学学报 ( 农业与生命科学版) 第 27 卷 为 TCR 的辅佐受体参与对M HC 分子呈递抗原的识别。 + T 细胞能识别M HC 类分子呈 递的抗原, CD 4 而 CD + T 细胞能识别 M HC 类分子呈递的抗原。 显然, CD + 、 + T 淋 巴细胞浓度与鸡的免疫防御关 8 4 CD 8 系密切[ 728 ]。本研究结果显示, 服用 “增免散” , 14、 日龄时 CD + T 细胞和 CD + CD + 比值增加明显, 后 21 4 4 8 28 日龄有下降的趋势, 但仍显著高于同日龄对照组和环磷酰胺组, 这可能与方中黄芪等能上调 CD + T 4 + + [9] + 淋巴细胞的比例, 提高 CD 4 CD 8 比值有关 。 另外, 鸡 CD 4 T 细胞还具有辅助 B 细胞 产生抗体的作 用, 试验中服用 “增免散” 鸡的 ND 抗体效价高、 维持时间长, 可以推测 “增免散” 促进鸡新城疫抗体的产 + + 生, 可能与胸腺 CD 4 CD 8 T 细胞比值升高有关。 3. 2 “增免散” 对鸡胸腺细胞凋亡的影响 胸腺是机体的重要免疫器官, 胸腺细胞的凋亡 涉及 T 细胞发育、 免疫系统自身稳定以及与免疫有 关疾病的发生和治疗。 “增免散” 中 黄芪、 何首乌、 羊红膻等都具有免疫增强作用。已有试验证明, 黄芪提 取物可显著提高雏 鸡 T 淋巴细胞转化率, 加速免疫器官发育完善, 还对地塞米松引起的胸腺细胞凋亡 有明显 抑制作用[ 10 ]。黄芪和何首乌制剂能改善胸腺微环境、 促进胸腺细胞的分化和成熟, 对抗 环磷酰胺 引起的胸腺细胞凋亡[ 11 ]。何首乌醇提物和水提物均能不同程度地提高老年大鼠 胸腺胞浆蛋白和核酸的 含量, 提高胸腺器官指数, 促进胸腺细胞增生, 延缓老年大鼠胸腺 增龄性退化, 从而提高老年机体胸腺依 赖的免疫功能[ 12 ]。本研究发现, 环磷酰胺引起鸡 胸腺细胞凋亡率显著升高,“增免散” 对其引起的细胞凋 亡有一定拮抗作用, 但对正常鸡胸 腺细胞凋亡无明显影响。 结果表明, 环磷酰胺可能还通过某种机制诱 导免疫器官的细胞凋 亡, 而 “增免散” 有效地抑制和减少细胞凋亡的发生, 从而解除环磷酰胺的免疫抑 制, 起 到免疫增强剂作用, 与有关报道 [ 11 ] 一致。 3. 3 “增免散” 对鸡胸腺指数和形态结 构的影响 胸腺是中枢免疫器官, 为 T 淋巴细胞分化成熟的场所。病理组织学观察发现, 环 磷酰胺对雏鸡胸腺 显微结构的影响与文献报道基本一致, 均表现为胸腺淋巴细胞数量显著 减少, 排列稀疏, 表明环磷酰胺 严重影响雏鸡免疫器官的正常发育和形态结构。 本研究结 果表明,“增免散” 对环磷酰胺引起的免疫抑制 有一定拮抗作用, 且能增强对照组鸡胸腺的 发育, 胸腺淋巴细胞明显增多, 皮质增厚, 胸腺小体数目增 多, 体积增大。 这可能与黄芪、 何首乌、 羊红膻等具有免疫增强作用有关。 参考文献: [ 1 ] 解跃雄, 宋志勇 鸡新城疫免疫失败的原因及对策 [J ]. 畜禽业, 2005, 178 ( 2) : 21. . 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