【doc】沙门氏菌鞭毛抗原的快速提纯及其单抗反应性测定

【doc】沙门氏菌鞭毛抗原的快速提纯及其单抗反应性测定 沙门氏菌鞭毛抗原的快速提纯及其单抗反 应性测定 沙门氏菌鞭毛抗原的快速提纯 及其单抗反应性测定 杜元刨焦新安剜秀梵张如宽 (江苏裳学院牧匠系传染痢教研室) 在改良M一肉汤中培养3椿不同血清型沙门氏菌,离心沉淀后细菌悬浮于少量生理 盐水中,用1N盐酸将pH两至2.0,室温30分钟,离心去细菌,上清用67嘶饱和硫酸铵 沉淀,然后过SephacrylS-300柱,这三种鞭毛经电子显微镜,SDS—pAGE电泳和等电 聚焦试验表明纯度很高.在免疫电泳转移试验(WB)中,三株单抗E;广3,x:, F一23—103分别与转移在硝酸膜上的HaHb和Hd发生反应.试验测得鞭毛分手量分别 为Ha50000,Hb53000和Hd4600o,等电点为Ha5.1,Hb5.1和Hd4.9.提纯鞭毛50g /ml高浓度包板,甩相应O抗原单抗检测测不出脂多糖成份. 引言 沙门氏菌鞭毛具有很重要物理和化学特牲,它的免疫原性在生物学和致病机制研究 中具有重要的意义沙门氏菌的鉴定和检验需要特异H单因子血清,而高纯度鞭毛是高 特异抗体生产的前提.关于细菌鞭毛提纯方法报道很多,但大多是采用复合培养基和机 械法脱离鞭毛,再经繁复分级离心和柱层析提纯鞭毛,这掸提纯鞭毛总是含有或多或 少的脂多糖和其它杂蛋白我们经过多次试验,建立了一种鞭毛提纯新方法,并利用 提 纯鞭毛制备针对沙门氏菌鞭毛的单克隆抗体. 材料和方法 1.菌株和培养基:试验用菌株见表1,使用的培养基有半固体培养基牛心消化 汤,改良M一岗汤培养基(成份为;A掖.胰蛋白月示5葡萄糖5g,酵母浸出渡0.125g, Na~HPO2g,KHzPO44g,蒸馏水1000ml.B液:MgCh2.5g,FeCI~?7H2O0.2g,Mn— C12?7H2O1.4g,CaC1z0.5g溶解于100ml蒸馏水中,用时取A液1000mI加B液20m.I混匀即 可).所用菌株在接种前都在牛心消化汤中培养保存. 2.单竟瞳抗体和血清t沙门氏菌鞭毛Ha,Hb和Hd抗原的单抗和O抗原单抗是自 制,详细方法参考文献[1]O和H单因子血清购自上海生物制品研究所.单抗酶结 合物是按改良过碘酸钠法制备 5.沙门氏菌鞭毛抗原的箍纯:将试验用菌株在含有特异H单因予血清的半固体培养 基中进行单相诱导,连续诱导筛选三次,最后筛选出有活泼动力的单相苗株,然后将筛 选菌株接种10ml改良M一肉汤中培养37X318h,再接种到盛l50ml改良M一肉汤的250ml锥 现在工作单位:农业部动物检疫所 ? l? 形瓶中振荡培养18h(75rpm).每一株接种于1000ml改良M一肉汤中,培养后3000rpm 离心30分钟,将沉淀细菌悬浮于少量生理盐水中,用IN盐酸调悬浈盼pH=2?O,室温 搅拌30分钟,300Orpm离心30分钟,上清用INNaOH调至pH7.2,缓慢加入67呖饱和硫 酸铵(2.67M),混台物置4?过夜,然后以I5000rpm4?离心20分钟,沉淀溶解于 5m1蒸馏水中,过SephaarylS-3.0柱,0.0IMpH7.2PBS洗脱收集第1蜂即为提纯鞭毛 蛋白. 4.电镜现寨;将覆有耩尔马膜的铜网经0.02%戊二醛室温处理30分钟,吸干,滴加 提纯鞭毛,再用pH7.41%磷钨酸染色1分钟,晾干后电镜观察. 5.SDS—PAGE电泳;将提纯鞭毛按Laemmli方法在非降解和2一琉基乙醇降解条件 下进行lo铀SDPAGE垂直板电泳.25mA/扳恒流1o?电泳5h左右,然后将分子 量蛋白带和被检样品切下,测出样品带迁移率,计算出Ha,Hb和Hd鞭毛抗原的分子 量.' 6.等皂聚焦试验(tsoelectricfocusing=IEF):取6Op-g提纯鞭毛溶解于9M尿素 和1%巯基艺醇中,在4骺聚丙烯酰胺凝胶上点样(22.2%Act,1.4%Bis),凝胶含 有2嘶pHg.5-9.5Ampholine(两性载体)和6M尿素,在LKB1型多功能电泳仪 4?4mA恒流等电聚焦至电压达250—300V为止(4—6h),电泳后固定染色确定pH 梯度,计算样品的等电点. 7.单抗的反应性测定;利用免疫电泳转移试验测定单抗与鞭毛反应性,将上述SDS— PAGE电泳凝胶取下后立即放在转移缓冲液中浸泡(缓冲液25mMTris,192mM甘氨 馥,20%甲醇)室温3o分钟,然后按硝酸纤维素膜,凝胶和三层滤纸次序组装在转移支 架上,注意硝酸膜光面与凝胶接触,不留有气泡.8O伏恒压转移I8h,转移后,凝胶再 用考马斯亮兰G一260染色.按Maul氏方法进行免疫酶试验测定单抗针对蛋白,大至步骤 为转移后硝酸纤维素膜用5~SA-O.05%NP404%2过夜封闭,再用1:200稀释腹水单抗 37=C作用2h,用PBSO.05晒Tween20洗涤3次,再与1:2000稀释抗鼠Ig酶标抗 体(Sigma 公司产品)37?作用2h,用PBST洗3次,然后放/klmg/mlDAB(100ragDAB, 0.02H2O2100mlpH7.4Trls—HC1缓冲液)染色25分钟,取出后蒸馏水冲洗即可. 8.问接ELIs^试赣:用提纯鞭毛抗原501/孔(50g/m1)包板,据常规方法进行 间接ELISA试验,用相应H和O抗原单抗进行检钡I鞭毛成份., 结果 沙门氏菌血清型培养和鞭毛产量;将诱导单相沙门氏菌在改是M一肉汤和复合培养 基中培养,从摄终培养物吸光度(OD55O)上看没有明显差异,改良M一肉汤培养细菌 后溶液pH在8?I.1变化,这说明M一肉汤有一定缓冲能力避免培养液过酸(<3)而发 生鞭毛解离.从三种沙门氏菌分离的鞭毛含量差异较大,提纯Ha27?9mg/Sg菌泥,Hb 18.7mg/Sg菌泥,Hd23.1mg/gg菌泥. 提撕鞭毛鉴定:通过电镜观察只能看到聚合鞭毛,不见杂质.利用SDS—PAGE电 泳和等电聚焦试验,降解后在凝胶都只出现一条清晰蛋自带,经免疫电泳转移试验,这 些带都与相应鞭毛单抗发生发应,它们的分子量和等电点详见表1. ?2' 袭T.三种沙门氏茸鞭毛的分子?等电点和与单抗的反应性. 菌株H抗原型抗原相分子量等电点与单抗反应性 甲型剐伤寒沙门氏苗?——H —1:20, aI500005.1E2l一3 乙型剐伤寒沙门氏苗HbI530005.1X:一b1:20I 伤寒沙门氏苗HdI460004.9F-23-1031:40I ? 注:(D使用茵株筛选为单相茵,都为I相抗原. ?与单抗反应性是指提纯靴毛与已制备鞭毛单抗反应. @1:200和l400为单抗稀释度. 鞭毛抗原与单抗的反应性:在WB试验申,利用单抗Ez一3,Xz-b,F一23—103与提纯 鞭毛反应见表1.这些单抗通过细菌的排谱反应已确定E-3针对HaI相抗原,X:_b针 对HbI相抗原,F-23-103针对HdI相抗原.从wB结果看提纯物确为鞭毛成份而且I 相鞭毛都是由同一的鞭毛素组成.另外利用相应O抗原单抗同提纯物做间接ELrSA试 验显示提纯物不含有相应的脂多糖成份. 讨论 I.该法同以前提取鞭毛方法相比有以下优点.(I)方法简单,不需高质仪器. (2)处理量太.回收鞭毛蛋白多.(3)提纯周期短,从接种细菌到分离提纯只需3 天时间.(4)饱和硫酸铵沉淀后如不需要特别纯鞭毛制品不必过SephacryIs一300柱, 不含有脂多糖成份. 2.我们利用改良M一肉汤代替复合培养基进行培养,避免复台培养基多蛋白成份的 干扰,因为改良M一肉汤含蛋白成份少,含有丰富无机盐成份.通过细菌生长密度和 OD.o,ODzao分光光度计检测细菌在营养丰富的复合培养基中和改良M一肉汤中生长没 有明显差异. 3.提纯鞭毛经SDS—pAGE和IEF试验表明纯度高,"WB试验证明提纯物确为相应 鞭毛成份.并测出各种鞭毛素的分子量和等电点,详见表1,这些结果与Ibrahim和 Sm{ttl报道基本一致.但Ibrah~m报遭Hd鞭毛索分子量为51100~与我们提取S.typhi~ Hd分子量46000相差很大,这可能是因为不同菌种或不同菌株间同种鞭毛的一缀结构不 一 样.另外与沙门氏菌分类有关的H抗原决定簇只占整个鞭毛素的一小部分氨基酸,因 此即使都含有Hd鞭毛素,其分子量亦可有很犬差异. 4.由于沙门氏菌血清型很多,已报道就有2000多个.对沙门氏菌的鉴定需要O,H 单因子血清,但由于免疫动物制备过程繁琐费时,且质量不稳定,存在一定程度柏交叉 反应.单抗是解决这一问题的主要途径.高纯度鞭毛是鞭毛H单抗制备前提,因为提纯 鞭毛避免脂多糖免疫优势作用,简化制备程序,加快眇门氏菌诊断试荆盒的生产.总 之,沙门氏苗鞭毛提纯方法的建立将对细菌鞭毛的研究和临床检验提供美好前景. 参考文献(1]:杜元钊等t江苏农学院5:1l—l3,1989 . 3