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人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究

2017-11-12 8页 doc 22KB 56阅读

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人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其 性质的研究 一 舀 生物化学与生物物理进展1993年第20卷第l期 《6弓,f ?63? 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究 垫—塑.直盏俞惠新 (江苏省原子医学研究b无锟2i4063) 关键诃人胎盘耐热性碱?巨磷酸酶(P—FLSAP),P—HSAP的性质,P-HSAP的 地化,碱?j生磷酸酶sA}?镶撩 人胎盘耐热性谳髋磷酸酶(pl~oentMheBtstable 81kalinephosphatsse,p-...
人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究
人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其 性质的研究 一 舀 生物化学与生物物理进展1993年第20卷第l期 《6弓,f ?63? 人胎盘耐热性碱性磷酸酶的分离纯化及其性质的研究 垫—塑.直盏俞惠新 (江苏省原子医学研究b无锟2i4063) 关键诃人胎盘耐热性碱?巨磷酸酶(P—FLSAP),P—HSAP的性质,P-HSAP的 地化,碱?j生磷酸酶sA}?镶撩 人胎盘耐热性谳髋磷酸酶(pl~oentMheBtstable 81kalinephosphatsse,p-HSAP)是一种高度对热稳 定的碱性磷酸酶[AP)同工酶"',分子量为13000'0,由 两个相同曲亚基组成.P-HSAP由台体滋养细胞台成 后分珏进入母体血液,孕妇血清中P'HSAP的活性变 化是有规律的h叫,可以作为胎盘功能监担5的指标. 目前P-HSAP也已怍为精原细胞肿瘤的标志物被广 泛采用….制备高纯度p-HSAJ?是建立定量检测方 法的前提.本文报道从人胎盘中纯化P-HSAP的方 法以及对其一些性质的研究.. 1材料和方法 i.1材料人眙盘由解放军第1ol医院提供; DEAE—DE52,Seph~dexG一200为Pharmaci~产品; cM52为Whstman产品;考马斯亮蓝G25为Fluks产 品;等电点为LKB产品;十二烷基硫酸钠(SDS), 苯基磷酸二钠为上海化学试剂商店进口分装;其它试 剂均为国产分析纯和生化试剂. 1.2AP活力测定主要参考龅氏法"'铡定,但 有较大改进.以苯基磷酸钠为底物,反应缓冲液为 0.04mol/L巴比妥缓冲液,pH9.6,于37?保温 15rain后用三氯醋酸除去蛋白质,吸取0.1皿l上清加 人定磷试剂,经45?保温l0m1.后在660n皿进行比 色.酶的话力单位(u)定义为在此条件下每min产 生lg无机磷的酶量为lu. 1.3蛋白质舍量测定用考马斯亮蓝G250测 定…,略加改进(所加考马斯亮蓝试剂的体积增加1 倍).牛血清白蛋白为标准蛋白. 1.4聚丙烯酰胺凝腔电泳(PAGE),SDS—PAGE 和等电聚焦(IEF)均按LKB2117电泳手册进行. 1.5酶的分离纯化"胎盘的预处理和正丁 醇抽提接文献【8]进行.将正丁醇抽提波加热至65? 并保持10mia后离心除去热变性蛋白,所得上清为热 变性抽提液. 热变性抽提液对缓冲液^(0.01mol/LTri*一 HCI.pH7.6.0.00imol/LMl2.0.01mmol/LZnCIj) 充分透析后上DEAE—DE52柱(1.6cmx20cm),线 性梯度冼脱(含0—0.3mol/LNaCl的缓冲液A),分 部收集,合并酶活力峰,浓缩后对缓冲液C(o.01tool/ L柠檬酸一柠檬酸三钠pH6.0,0.001mol/LM!:, 0.01mmol/LZnCI;)透圻.h后上CM52柱(1.6cm× 17cm),用缓冲液C洗脱,分部收集,台井酶话力峰. 浓缩后直接上SephadexG-200柱(2.6cm×80cm), 用缓冲渡^洗脱,合并酶活力蜂,分装,冻干. 1.6氯蒸酸组成分析纯P—HSAP用6mol/L HCI固流水解24h后,在日立835—50型氨基酸自动分 圻仪上进行分析. 2结果与讨论 2.1酶的分离纯化人胎盘组织经正丁醇抽提, 热变性处理,离子交换柱层析(图1和2)和凝胶过滤 (图3)等步骤获得P-HSAP,酶的最终比括为4379U/ mg,酶活力回lI殳为57.996. 衰1P—HSAP的分离纯仡 步骤总活力总蛋白比话回收 (u)(mg)(u/mg)(%) 正丁醇抽提蔽29100025601l3.71O0 热空性抽提斌270900980276.493.1 DEAE柱层析lB640062.529B2.464.1 cM柱届析17447050.2{47,.560.0 ~ephsdexG一200屡析16860038.54379.257.9 中数据为两改提取的翠均值,每改提取所用胎盘组瓶 的重量为3OOg. 卫生部青年科学研究基盎资助项目. 收稿日期:1991-10-04怔回日期:1992-01-07 = 田2CM柱屠析纯他P—HSAP 实线:蛋白泼塞Am;虚线:酶活力U/ml 由3SePbldelG一200纯化P—HSAP 实线:蛋白浓度Am;虚线}酶活力u/mt , 喜 R 蝗 落 生物化学与生物物理进展1993年第2O卷第1朝 33 吾 2三 言 l星 2.2酶学性质由本法制各的P—HSAP,以苯 基礴酸=钠为底物,测得其米氏常数为2.5×10 mo|/L,最适反应pH为l0.5左右…',最适反应温度 在屯左右. 2.3酶的理化性质用SephadexG-200I主层 析测定P—HSAP的分子量约为130000'圈4),用SDS PAGE测得其亚基分子量为65000(图5),由两 千相同的亚基组成,与文献报道相符. -, J- 盱4凝睦过滤洼_厕定P—HSAP?的分子量 t蛋白i4403(102.过氧化氢酶(z3oooo);3.醛 缩配(160"000);4-牛血蒲白蛋白(7500D) 囝5P-HSAP的SDS—PAGE圉.诳 ^低分子量标准,从上到下依次为94D00,670D0, 43000,3O000和17500.B}P—HSAP 以等电点标准蛋白(pz0—.B)为标准,用薄' 层等电聚焦电泳测得p-HSAp的等电点为0.6,与文 献报遭""一致. 使用同一稀释酶液和反应体系,将酶分别置65?,' 75屯和90?保温30,60,90,i20,t50和t80mln后捌 定酶括力,以删值对保温时间作图(圈6),表明P— HSAP对热较稳定,纯酶在65?保蕊3h,活性仍保留 80%以上;当温度提高到90?时活性很快丧失.另 外纯酶在室温放置一和二个月后测定活性,发现话性 并未明显下降. 2.4酶的纯度和嚣基酸组成PAGE和SDS— PAGE均显示本法制备的P—HSAP为一条带.P— HSAP的氨基酸组成见表2. 文献报遭应用正丁醇拉挺,pH,丙酮,硫酸镀 分级分离,离于交换柱层祈和凝胶过摅,从人耐", 肝"Lq]胎盘.'等组织中可以纯化到电泳纯的高活 I - ,一 … IW E\f1一,恤,鞋一 .., — L { { 生物化学与生物物理进展!!至笙 . 札 嚣 0.2 O 置6P-HSAP的热穗定性 裹2P-H~AP的羞基酸组成 氨基酸百分含量氨基酸百分含量 ^.P10.{3Leu6.67 Tht5.16Trr er3.8DPhe{.,2 1 G1u9.D9Lrs6.7j lGly}.60NH, ^1-5.8BHis2.66 C?1.96&fgS,9l Va1,.34T印 Met1.19Pr0 lle4.77 牲^P.作者在此基础上进行丁改进,利用p-HSAP 曲耐热性",采用'5?加热变性正丁醇抽提液,除去 大量杂蛋白,上清液透析后直接进行离子交换和凝胶 过滤纯化,省却了pH,丙酮和硫酸铵的分毁沉淀步骤, 避免了酸碱,有机溶剂对酶活力的影噙缩短了纯化用 期,产品纯度为电泳纯.65?的加热变性可以有效地 使p-HSAP与组织非特异型和髓型AP分开,置为后 两种AP同工酶在;?时完全变性失活….通过本法 制备的p-IHSAP由两个相同的亚基组成,亚基分子量 为65000,等电点为4.6,以苯基磷酸二钠为底物的 值为2.×lO-*~nolf.L,其最适反应pH为10.5左右, ?65? 最适反应温度为65?左右,特别是诙酶对热的稳定睦 很高,在6s?保温几个小时仍保留大部分括力,宅温 放置二个月瑶性未见下降.这一热稳定性在应用匕具 有较大价值. 参考文献 lo口icaDRosend~hlK.atdenlindL.1nberJteJIreace ofaheastableatkatJnephosphataseintheabsLcoe 廿Iallgnentdisease.:C,~imI98918日:2 2ArnoldKTcPlaee*ttul,rlBee1in:SFrigor, I982:32—3B 宏虽抟凤全,阎国来等.测定辱?血中胎盘酶断胎 功能.中华妇产科杂志,1988;2262 4刘建,凌箩达,颐美礼等.高危妊振孕妇血清^KP, HS—AP,LAPr_GT沉淀的临床意义.中华妇产科杂 志,l9B9:24:66 SFi~hmanWHThe3dva口cementofalkalinephosph~tase isoeav/meCEnBiochem,19913;23:99 6上薄医学化验所主编.临床生化检验(上).上海:科学 技术出版往,t979;jsI一6 7ScopesRKProteineuriJicatlo~New~oxk:9pringot? Vrelag,1982:266 8HolmgeenP^.StigbranT.Purlfic~ttondpartial characterlzationo1tWOgeneticvariantsofplacental aIhlineDhospha:ase.Bioc~emGen~~Jl976:14:777 9Ooellga*tGTFishmanWHPurificationDfhuman DIa~cnTaIaIkalinc口ho:phata.Bioekem197}:14I: 440 0GPJ,$u~smanHHSIractu~icomparisonof eelnplcandnormalplacentalalkalinepl~osphatasePro~ ,"od3ci.i973:70:2936 I】SuginraM,IsnbeM.ttJeanoK"-Comparisont_Ipro_ pe~ticesofhumanintestinalandpla~emal.kalin~ phosphataseCplmrmBull,l97S?23:l54 】2&!gittraM.lsobeM.HirjnoKa1.ParificatiD口 humanintestina【alb【in0phosphata~ec^,…Bull 【975;23:l537 l{SuglttraM.Hi~anoK.1imoS"a/Purificationand prnpertJesofnliveralka]inePbosphatase.C,~em PharmBull,l979:23:2369 l4BdgKSussmnHH.StrlIcturevidencethat humanliverandplacentalalkalinephospl*atai' m口dedbvdifferentgenes.ProcNal1.gc~dSet ?.】976:T3:2201
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