奶牛早孕诊断乳汁孕酮临界值的确定

奶牛早孕诊断乳汁孕酮临界值的确定 一 聊,彳鲁,矽季翻 24/’黄牛杂志1996年第22卷第4期 g3 摘要随机选择健康荷斯坦母牛63央.其中蛊情周期牛5头.配后l8—24天牛30头和 通过直桂确定的怀孕牛28头.格程序采集束乳乳群用放射免疫测定法(RLA)洲定乳汁孕酮 (MPI)戒度以发情第3天MP.戒度加上2倍标准差为未孕蓝界值的上限.以配后l8—24天怀 孕牛MP.戒度的平均值疽击1倍标准差为怀孕临界值的下限结果表明.奶牛MP.早孕诊断临 界值为:?7.19ng/m]为?Ig,孕.<4.72ng/m]为未孕,善问为可疑.据上述标准.配后22—24天的 怀孕峭诊丰均为92.3O,未孕的确诤丰为100.因此.配后22—24天为早孕诊断的最佳采 样时间.. 关键词孕酮早孕母断奶牛 引言 在奶牛生产中,繁殖力是决定牛群经济效益的 关键田索之一.繁殖力下降将会造成巨大的经济 损失.因此,为了提高牛群繁殖力,瑟时.准确地了 解母牛所处的生殖状态,就显得十分重要 乳汁孕酮(MP.)浓度的变化是标示母牛卵巢 活动的一唾特异指征.早在1971年-Laing和Heap 应用放射免疫测定法(RIA)测定MP..首次了 MP.的变化所反映的发情周期阶段与直硷卵巢的 评估结果相一致.因此.可通过MP.的浓度来监 测母牛的生殖活动.但由于R1A的设备要求高和 放射性危害等局限性.使其在生产中的应用和推广 受到限制.70年代以来,随着酶免疫测定(EIA)技 术的发展和完善.使得通过现场定性测定MP.成 为琨实.近几年.国外相继研制成功lO多种MP. 现场测定试剂盒(据P.含量的高或低来定性母牛 所处的生殖状态).其中以酶蛋白激活免疫测定 (ARIS)景为先进.它具有快速,简便,准确,经济等 优点. 就MP.现场定性测定而言,主要问题之一就 是MP.临界值的正确确定MP.浓度I疽着母牛所 处的生殖生理阶段不同具有特征性变他.其变化规 律为:发情期(0—3天).孕酮值处于基础水平; 后逐渐升高;9—16天达到相对平稳的峰值期18 , l9天来孕牛与孕酮值开始明显分离.未孕牛 的逐渐下降.并维持整个怀孕期.因此采集发情. 一 3天和配后h24天乳样并测定其MP.含量. 对早孕诊断MP.界值确定是切实可行的. 关于奶牛怀孕凹MP.临界值确定虽有一些报 导….但结果差异较大.这可能是由于对临界 值确定的方法各异.或者由于采样和测定方法及条 件不同所致.因此,程有必要寻求正确方法,准确地 测定MP.临界值 本试验的目的在于采用RIA测定发情周情, 配后18—24天和怀孕期母牛MP.含量.从而确定 出在不同生殖阶段MP|临界值,为孕酮一ARIS现 场测定方法学的建立提供理论蔽据和实验证据 与方法 l材料 1.1供试牛选择 干l995年4月一5月.从宝鸡地区柳林马场 和西北农业大学牛胚胎移植站.随机选择健康荷斯 坦奶牛63头.年龄6—8岁.胎趺4—6胎,其中发 情周期牛5头-配后18-24天牛30头和通过直检 确定的怀孕牛28头. 1.2试剂与器材 孕酮标准品购自上海内分泌研究所.L1.2.6-7 一 H]一P.购自上海原子能研究所.其放射性比活 度为96cilmmoL.P.抗血清为本研究室自制品.蔽 件闪烁计数器为FJ一2lD0.对H的探础效率为 *国家委高幢博士点基金资助项目’牛乳计孕酮--ARIS快建侧定方 法学的建立及应用研究的一部讣 科学试验25 46. 2方法 2.1采样方法 对发情周期母牛从发情当日起每隔2天采样 1次;配后I8—24天母牛每日采样1次I怀孕牛择 日只采样1次.13,30—15:30采末乳各5毫升, 乳样一律加l5重铬酸钾0.0Sin|,于一20c冰箱 保存,待铷. 2.2P.测定 根据西北农业大学家畜生殖内分泌研究室 (1987)建立的放射免疫测定法进行.,即在标准曲 线中增设非特异结台N:管.所做6批标准曲线的 拟度平均值为r=一0.9991I回收率为99.46% (标准乳中添加P.标准品)l批内变异系数为 9.6I批间变异系数II.4I灵敏度为4.85pg/m[ c水空白). 23统计和MP|临界值的确定 2.3.i统计夸析用非配对的t检验对发情周期 牛与配后l8—24天牛及怀孕牛MP.浓度的差异 进行显着性检验I用新复极法(SSR)Xt配后l8—24 天各天浓度间的差异性进行检验?. 2.3.2MP.临界值的峭定方法以配后l8—24 天怀孕牛MP.的平均值减去i倍的标准差为怀孕 临界值的下限I以发情第3天MP.的平均值加2 倍的标准差为未孕临界值的下限}其问波动范围为 可疑 结果 1直捡确诊怀孕牛的MP浓度 所铡2B头牛中,其中有5头牛的MP.处于 较低水平.平均为7.72q-I.05(ng/ml(6.53— 9.20ng/m1)I其余23头MP.处于较高水平.平均 为21.704-i0.57ng/ml(10.39--48.96ng/m1) 2发情周期和配后18—24天牛的MP浓 度 2.1发情.天至3天 MP娃于低水平波动,分别为1.31土0.36ng/ m『和2.78土o.9lag/m|;以后逐惭上升侬周期长 短不同,分别于9一l5天达到峰值I此后出现分离 现象.怀孕牛MP.仍维持较高水平,而未孕牛MP. 水平开始下降.在所测牛中,有3头牛(131号,86 号,22号1干分离点后MP.豫度陡然下降,恢复到 下一发情周期前的基础水平I其中6号和22号为 短周期发情牛.均在第9天达到峰值.MP.浓度分 别为16.85ng/m1和18.76ng/ml,而后下跌,到第 l5天降低到最低水平,分别为0.63ng/m1和2. 0Sag/ml;而另外2头牛(903和838号)发情后配 种,在配后的前l5天与上述3头牛MP.变化类型 相同,以后MP仍维持较高水平. 2.2配后l8—24天的母牛 MP|水平的变化有两种情况:?与发情周期 相同,MP.水平在后l8天下降,在2l,22或23, 24天降到下一周期开始的基础水平(0.63— 4.13ng/m],平均1.91土0.36ng/m|),?配后l8— 24天所测的母牛中有l3头牛MP.维持较高水平, 但于第22天有一十微小跌落.以后再次回升,其具 体变化特点见图i.经SSR检验,配后l8—24天 中.各天MP.浓度间差异不显着(p>005),与怀 孕牛的差异亦不显着(p>0.05),但极显着地高于 发情0天和第3天的MP水平(p~001). 3MP临界值的确定 由图l可以看蛊,配后l8,孔天怀孕牛MP. 仍维持高水平.以其MP.平均值减去I倍的标准 差(X--SD=7.i9ng/m])为怀孕临界值的下限;发 情第3天的MP.平均值加上标准差(X十2sD一 4.72ng/m]1为未怀孕临界值的上限.因此现场监 铡MP.临界值定为?7.19rig/m|以上为怀孕. 4.72ag/ml以下为未孕,界限区间刚为可疑. 4奶牛MP测值与临床检查的符合情况 以上述判定标准来衡量,28头经直检确定的 孕牛中有26头MP.>7.i9ng/ml,MP.鼬J值与临 床符合率为92.86%(26/28)I配后18—24天所测 牛以MP.>7.i9ng/m]为早孕诊断的判定标准,并 于配种后4050天经一Nt(Nt为GPBS 造成的非特异性结合和本底值等造成的计数) CPM加刊标准曲线Bi昔原CMP中之后,Bi管就 相当于受到乳汁干扰因索的影响.从而校正后Bi 管与样品管的条件一致-该方法与国内外现有方法 相比较.具有许多优点.?不经脱脂而直接剜定出 垒乳P的含量,不会因脱脂乳中P一含量很低造成 测值不准确或不可测I@乳汁中加P.标准品回收 率高,不仅测值准确,而且对含量程低的样品也可 测出I@标准曲续不受无激索乳的影响,因而拟合 度及由此计算出的样品含量准确.囤此本试验所 取得的MP测值具有较高的可信度. 1.2配后22--24天MP.有所下降的解释 配后第22天MP.有一个微小跌落.但与配后 18—24天各天间的差异不显着【p>O.0s).这很可 能与怀孕识别过程中孕酮与其它相关激索之间的 相互均衡状态有关. 2早孕诊断临界值的确定 已报道的有关乳汁孕酮临界值的确定方法及 判定标准并一致.郭爱珍(1992)..将母牛配后2l 天混台奶孕酮含量P.>8.00.g/mlt<2.Y0ng/m| 和2.70?P.?5.0Ong/m|分剐作为诊断妊娠,空怀 的准确率分别为84.s与95.9.董用威t1988) 等”“测定9l头荷斯坦母牛(配后2l一28天和42 天)混台乳的孕酮含量进行早孕诊断结果显示怀孕 牛之间的剜值差异极显着(p<001),据此确定垒 乳孕酮的判定标准是;P一>1lngim]为怀孕-P.< 8rig~m;为未孕.8.2一10.9ng/ml间为可疑.经直 检核实,用该标准衡量配后21,23,24天妊振牛的 确诊率分别为85.7,90.2%,91.4,未孕牛确 诊率为100.本试验采用配后l8—24天MP一测 值等于7.19ng/ml为辐羿值下限,未孕牛MP等 于4.72ng/m]为临界值上限.配后22—24天怀孕 阳性和阴性诊断准确率分别为92.3O和100. 阳性诊断准确率较上述报道有所提高.同时也表 明配后22,24天是根据P浓度进行早孕诊断的 最佳时间. 小结 1本试验结果表明:正确地确定出早孕诊断 的MP临界值.可以提高早孕的确诊率采样最佳 时间在配后第22—24天.以其MP.浓度来衡量, ?719nglmlt小于472ng/ml为未孕,7.19 科学试验 4.?2ng/ml之间为可疑.与其它方法相比较.车方 法确定的早孕诊断临界值比较理想. 2本试验确定的MP.临界值,为MP.一 ARIS现场涮定方法的建立提供了理论依据和实 II.zingJAandHeapRB.The V戗J197i1i27I247 验证据.同时对家畜繁殖生理和病理方面的研究 具有参考价值. (收稿日期t1995—07—24) 参考文献 ofprogesteroneinthemi]ko1”cowBduringtheDr.dll1ecycle.Br 2董伟主蝙家畜的生殖激素,农业出版杜,1986,PP272—334 3张怀玉.应用乳脂孕酮放射免疫测定法谚断奶牛早期未孕.中国兽医科技,1986,t6),45—46 4丁红.测定奶牛中孕酮的量作为奶牛早期妊娠谚断的研究.畜牧兽医,1986}16(3).9一i2 5石放雄.牛奶孕酮的酶免疫分析法及其l临床应用,浙江农业大学.1987Ii3910:13—2i 6张劲松.通讯采样的RIA测定奶牛早期妊蓐的验证,畜牧与兽医,i987;(8);208 7张彦田.弓智熹.乳汁17B一雌二醇放射免瘫测定方法的改进.西北农业大学,1987;18(2),47—55 B贵州农学院主编.生物统计学i甘试验设计,农业出版杜.~SSO(第二饭)tPP87一Sl S郭爱玲.奶牛情期乳什孕酮EIA测定及在妊娠谚断中的应用.畜牧兽医杂学,1992-(4);6—8 10董用戚等.奶牛早期妊蜒谚断一应用RIA测定MP?量的研究,畜牧 兽医科技.1988}(1)l0一l3 DeterminationofCOWmilkprogesteronecriticalvalue forearlypregnancydiagnosis ShiYuangangWuYinghuiZhouLeLiJianWangJianchen tDept.VeterinarySciencetNorthwesternAgrlctdturatUnitsityr Yangling712100一SAaanxi) AbstractTheendmilksampleswerecollectedfrom63randomselectedHolstein COWSincluding5inestrouscycle,30inseminatedafter18to24daysand28pregnant COWSdeterminedbyrectalpalpation,thentestingtheconcentrationofmilkprogesterone (MP’).TheMPJconcentrationplusing2timesstandarderrorat3rddayofheatwas consideredastheceilingofunpregnantcriticalvalue,theaverageMP.concentration subtractingltimestandarderrorofpregnantCOWSinseminatedafter18to24dayswas regardedasthelowerlimitofpregancycriticalvalue.TheresultsshowedthatcowMP. earlypregnancydiagnosiscriticalvalueisaboveorequalto7.I9ng/mlwithpre gnancy below4.72ng/mlwithunpregnancy,thecriticalvaluebetween7.19ng/mland4,72rig/ mlwithdubiouspregnancy.Accordingtoabovestandards,thedefinitepregnancydiag— nosisrateis92.30,definiteunpregnancydiagnosisrateis100forCOWSmatedafter 22to24days.Therefore.theoptimummilksamplecollectingtimeforearlypregnancy diagnosisis221o24daysafterinseminating. KeywordsProgesterone,EarlyPregnancyDiagnosis,Cow