免疫组化

免疫组化 免 疫 组 化 (Invitrogen Histostain-Plus Bulk Kit) 免疫组化是利用抗原抗体特异性结合的原理，采用已知抗体检测组织或细胞内的抗原性物质，然后通过恰当的方式显示其结合信号以证明组织或细胞内是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量研究。 1.烤片:将选取的石蜡包埋组织以3-4μm厚度连续切片，贴于硅化防脱玻片上，4?冰箱冷藏保存，使用前恒温箱中60?烘烤3h或58?烤片过夜。 2.脱蜡:置于二甲苯I中浸泡15分钟, 再在二甲苯II中浸泡10分钟，最后在二甲苯?中浸泡5分钟。使用宏兹实业的Van-Clear 环保透明剂，可以为10分钟×3次，脱蜡时间也可适当延长，在环境温度较低时尤其如此，因为Van-Clear对石蜡的溶解度与温度相关。温度越高溶解度越大，36度左右为最佳。 3.水化:无水乙醇I中浸泡10分钟，无水乙醇II中再浸泡10分钟，随后依次在95%?70%?50%乙醇中浸泡5分钟,最后在蒸馏水中浸泡5分钟。 4.放入3%H2O2(30% H2O2用甲醇稀释至250ml,现用现配，配好后4?避光保存)孵育10分钟，封闭内源性过氧化物酶活性。 5.蒸馏水冲洗后，PBST(1L PBS加入1ml Tween-20)浸泡2分钟×3次，涮洗后将其甩干。 6.抗原修复:由于石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联反应而使抗原决定簇隐蔽。所以在进行免疫组化染色时，需先进行抗原修复，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，从而恢复抗原的原有空间形态。 A.微波修复:EDTA (PH8.0)或10mM 柠檬酸盐(PH 6.0):高火5min，解冻2min， 低火20min (注意平衡，修复液体积尽量加满，因为加热过程中会有大量损失);在修复液中自然冷却10min，流水冷却15min(或室温冷却30min以上)。 B.高压修复:将1500ml-3000ml的抗原修复液放入压力锅中，对齐锅盖但无需盖紧，加热至沸腾。切片置于切片架上，放入锅内，使切片组织位于液面以下，盖紧锅盖，加上压力阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5-6分钟后)，计时3分钟， 在修复液中自然冷却20min后打开压力锅，室温冷却20min, 再流水冷却20min以上。 抗原修复后的冷却是必须的:1.如这一步省略，对有些抗体而言，会降低IHC染色强度;2.突然从高温到低温可导致组织片脱片;3.可能引起组织的形态学变化。 6.纸巾吸去多余液体(勿碰到组织)，放在湿盒中，PAP 笔划境线，一遍擦干一边画，画完后放入修复液中以免干燥。 7.PBST浸泡2分钟×3次，涮洗后将其甩干。 8.玻片滴加血清封闭液(Reagent A)100ul，室温孵育10min后将其甩干,无需冲洗。如使用非生物素二步法则无需封闭。 9.滴加一抗100ul，玻片置于湿盒上37?温箱静置40分钟-1小时或4?冰箱过夜。如4?冰箱孵育过夜则使用前需37?复温45分钟。 10.PBST浸泡2分钟×3次，涮洗后将其甩干。 11.滴加生物素化二抗(Reagent B)100ul，37?度孵育10分钟，如一抗是兔抗的话需要孵育20分钟。 12.PBST浸泡2分钟×3次，涮洗后将其甩干。 13.滴加Enzyme Conjugate(Reagent C)100ul，37?度孵育10分钟。 如使用非生物素二步法则11-13步改为加入100ul相应检测试剂，37?度孵育30分钟(相应检测试剂是标记有辣根过氧化物酶和抗兔及抗小鼠免疫球蛋白的多聚体分子，相当于二抗，它与兔抗或小鼠抗一抗结合。结合后的大分子即标记有辣根过氧化物酶，再与DAB 反应，得到棕色显色。由于该系统不含生物素和链亲和素，所以不受内源型生物素干扰)。 14. PBST浸泡2分钟×3次，涮洗后将其甩干。 15.滴加100ul DAB工作液(1.5毫升DAB底物液中加入一滴DAB浓缩液)，显色5-10分钟(二氨基联苯胺是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物为不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物)。 16.显色完成后，蒸馏水浸洗以终止显色反应。 17.苏木精复染2分钟(形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位)，甩干后蒸馏水漂洗2次，在盐酸酒精溶液(1ml盐酸加入99ml 75%乙醇)浸洗数秒(动作一定要快);流水冲洗40分钟，甩干。 18.脱水:50%-70%-95%-100%乙醇浸泡10秒-3分钟，烘干。 19.透明:二甲苯中浸泡10秒-3分钟，烘干。宏兹实业的Van-Clear 环保透明剂也可使用。 20.封片:中性树脂，滴3-4滴在组织上湿封，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，室温静置过夜。 使用Van-Clear环保透明剂时，建议配合Van-Mount环保封片剂一起使用。因为含有二甲苯的封片剂与Van-Clear不相溶(如中性树胶)，会有乳白沉淀产生。 21.镜检、拍照。用已知的试剂公司提示的阳性组织切片作为阳性对照，以一抗稀释液代替一抗作阴性对照。 如组织切片背景深则与下列因素有关: (1)石蜡切片脱蜡不干净; (2)第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高; (3)显色剂DAB浓度过高; (4)抗体不纯; (5)抗体孵育后切片清洗不干净。