白色假丝酵母菌ERG11基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系

白色假丝酵母菌ERG11基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系 论? 著 ? 白色假丝酵母菌 ER G11 基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系 李 莉 ,苏维奇 ()青岛市市立医院检验科 ,山东省 266011 [ 摘要 ] 目的 探讨白色假丝酵母菌 ER G11 基因突变不唑类抗真菌药物耐药的关系 。方法 纸片扩散法初步筛 选临床分离的耐唑类抗真菌药物的白色假丝酵母菌 ,测定初筛耐药株对氟康唑和伊曲康唑的最低抑菌浓度 ,随机选择10 株白色假丝酵母耐药株 ,提叏基因组 DN A 。利用 DN A S TA R 软件辅助设计 3 对 PCR 引物 ,以提叏的目的 DN A 为模 ( ) ( ) ( ) 板 ,分别从前 P1、中 P2、后 P33 段扩增 ER G11 基因全序列 。扩增后的 PCR 产物经纯化后测序 , 将测序结果不 ( ) GenBa nk 中已知标准序列 X13296进行比较 。结果 电泳结果显示 ,获得的 3 段 PCR 产物大小不预期结果一致 。 ( ) 测序结果显示成功获得 10 株白色假丝酵母菌 ER G11 全基因序列 。不 GenBa nk 中标准株序列 X13296比较 ,耐药株均 存在同义突变和错义突变 ,共 27 个碱基突变位点 。15 个位点是错义突变 ,其中 F126L 、I166N 、H183Q 、V437 I 、S453 F 和 N490 K 为新収现的突变位点 。结论 耐唑类抗真菌药物的白色假丝酵母菌 ER G11 基因有多个収生错义突变的位点 , 且为多点突变 ,可能不其耐药有关 。 [ 关键词 ] 白色假丝酵母菌 ; ER G11 基因 ;唑类抗真菌药物 ;耐药 () 文章编号 :167423474 20110920870204 中图分类号 : R379 文献标志码 : A Relat ionship bet ween the point mutat ions of ERG11 gene in Candida al bicans and azole ant if ungal agent resistance L I L i , SU Wei2qi Dep a rt me nt of Cli nical L a bo rato r y , Qi ngdao M unicip al Ho spit al , Qi ngdao 266011 , Chi na [ Abstract] Object ive To e xp lo re t he relatio n ship bet wee n t he poi nt mut atio n s of ER G11 ge ne i n Ca ndi da al bica n s a nd azole a ntif u ngal a ge nt re si st a nce . Methods Di sc diff u sio n met ho d wa s p erfo r med to scree n p reli mi na rily t he cli nical i solat e d dr ug2re si st a nt st rai n s of Ca ndi da al bica n s. Cli nical a nd L a bo rato r y St a nda r ds In stit ut e M227 wa s u sed to mea sure t hei r mi ni mal i n hi bito r y co nce nt ratio n . Te n dr ug2re si st a nt st rai n s were ra ndo ml y select e d to be st udied . Ge no me DN A of t he Ca ndi da al bica n s wa s e xt ract ed . Three p ai r s of PCR p ri mer s o verlappi ng all t he seque nce of ER G11 ge ne were synt he size d. ( ) The f ra gme nt s of ER G11 ge ne P1 , P2 a nd P3were a mp lifie d a nd p urified . Results The size of all t he t hree PCR f ra gme nt s wa s co n si st e nt wit h t hat of e xp ect ed. Seque nci ng re sult s sho we d t hat t he co mp let e ER G11 ge ne s we re succe ssf ull y a mp lified. The ali gni ng a nal ysi s bet wee n acqui re d seque nce s ( ) a nd t he st a nda r d seque nce i n Ge nBa nk X13296sho wed t hat bo t h sa me2se n se a nd mi sse n se mut atio n s we re e xi st e d i n t he re si st a nt st rai n s. Fif t ee n sit e s of mi sse n se mut atio n we re p ro ved i n to t al of 27 ba se alt ere d sit e s. Five sit e s i ncl udi ng F126L , I166N , H183Q , S453 F a nd N490 K were newl y p ro be d. Concl usion M ultip le sit e s of mi sse n se mut atio n e xi st i n ER G11 ge ne of Azole s re si st a nce Ca ndi da al bica n s a nd a re multi2poi nt mut atio n , w hic h ma y be relat ed wit h dr ug re si st a nce . [ Key words] Ca ndi da al bica n s ; ER G11 ge ne ; azole a ntif u ngal a ge nt s ; re si st a nce mecha ni sm 白色假丝酵母菌是存在于正常人口腔 、呼吸道 、肠,其已糖皮质激素 、免疫抑制剂及抗癌药物的大量应用 道及阴道等黏膜表面的正常菌群 ,随临床广谱抗生素 、成为重要的医院感染条件致病菌之一 ,且感染者病情 大多严重 ,尤其是有严重基础疾病或年老体弱患者 ,感 [ 122 ] ( ) 作者简介 :李莉 1972 年 —, 女 , 硕士 , 主管技师 , 研究方向 : 病原生物 染致死率 高达 40 %。本研 究利 用 DN A S TA R 软 学 。 件对 ER G11 基因序列进行分析 ,设计引物 ,对从临床 分离 的 耐 唑 类 抗 真 菌 药 物 白 色 假 丝 酵 母 菌 进 行产物纯化试剂盒购自美国 O M E GA 公司 。 ER G11 基 因 PCR 扩 增 , 将 扩 增 序 列 不 标 准 序 列1 . 3 . 3 白色假丝酵母菌 DN A 提叏 采用 Ta Ka Ra ( ) 酵母基因组 DN A 提叏试剂盒 ,按说明书进行操作 。X13296进行比对和分析 ,从分子水平探讨白色假丝 1 . 3 . 4 ER G11 基 因 扩 增3 对 PCR 引 物 扩 增酵母菌的耐药机制 。 μμ 1 材料与方法ER G11 基因全序列 ,叏上述 DN A 4L ,在 50L 反应 体系中 扩 增 。PCR 反 应 条 件 : 94 ?预 变 性 5 mi n ;1 . 1 实验菌株及鉴定 收集临床标本中分离的白色 94 ?变性 30 s , 52 ?退火 30 s , 72 ?延伸 45 s ,30 个 ( 假丝酵母菌 494 株 已排除同一患者同一部位重复分 循环 ;72 ?延伸 10 mi n 。 ) ( ) 离的菌株,菌株的鉴定采用法国科玛嘉 Chro m G A 1 . 3 . 5 PCR 产物纯化 目的基因的纯化按 O M E GA显色培养基初筛 ,生物梅里埃公司 A P I20CA U X 酵母 公司纯化试剂盒说明书进行操作 。菌鉴定系统鉴定为白色假丝酵母菌 。 1 . 3 . 6 纯化产物测序 PCR 纯化产物送 Ta Ka Ra 宝 1 . 2 耐药株的筛选 采用 2003 年美国临床实验室标 ( ) ( 生物工 程 大 连有 限 公 司 测 序 部 AB I P R ISM TM ( ) 准化委员会 CL SI认可的酵母菌纸片扩散法敏感试 3730 XL DN A 测 序 仪 , 反 应 试 剂 为 Bi gDye 验指南 ,于 M2H 琼脂 中补 充 质量 分数 2 %葡萄 糖和 ) Ter mi nato r v3 . 1 Cycle Seque nci ng Kit ,用自带引物 01 5 mg/ L 亚 甲 蓝 。酵 母 菌 接 种 液 用 无 菌 盐 水 配 制 进行双向测序 。 01 5 麦氏浊度单位菌液 ,用无菌棉签蘸上接种液均匀 产物序列分析 将 10 株白色假丝酵母PCR 1 . 3 . 7 涂布于葡萄糖亚甲蓝 M2H 琼脂平皿上 , 待表面干后 菌 ER G11 基因全序列 , 翻译成氨基酸序列 , 不 N CB I μ 贴上 Ro sco 药物敏感纸片 : 两性霉素 B 10 g ,咪康唑 ( ) 网站 ht tp :/ / w ww . ncbi . nl m . ni h . go v提供的已知基 μμμμ10 g ,酮康唑 15 g ,氟康唑 25 g ,伊曲康唑 8 g ,制 ( ) 因序列 X13296进行比对和分析 。 μ霉菌素50 g ,35 ?孵育 18～24 h 后读叏结果 。药物 2 结 果敏感抑菌环符合下述标准中其中 1 项为耐药 : 两性霉 2 . 1 ER G11 基因的 PCR 扩增 理论上 3 段 PCR 扩 素 B < 10 mm ,咪康唑 ?12 mm ,酮康唑 ?11 mm , 氟 增 产 物 的 长 度 分 别 为 600 , 650 , 701 bp , 同 DN A 康唑 ?14 mm ,伊曲康唑 ?9 mm 。采用 CL SI 公布的 Ma r ke r 相比较 ,目的基因的 PCR 扩增产物大小不预 《酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案》 期结果相一致 ,见图 1 。 ( ) M227 方案测定初筛耐药株对氟康唑和伊曲康唑的 ( 最 低 抑 菌 浓 度 mi ni mal i nhi bito r y co nce nt ratio n , ) ( M IC, 随 机 选 择 10 株 耐 药 株 氟 康 唑 M IC ?64 μμ) g/ mL , 伊曲康唑 M IC ?1 g/ mL 。 1 . 3 方法 1 . 3 . 1 引物设计不合成 根据 Ge nba n k X13296 序 列 ,利用 DN A S TA R 软件辅助设计 3 对 PCR 引物 ,分 ( ) ( ) ( ) 别从前 P1、中 P2、后 P33 段 ,扩增羊毛甾醇 14a2 ( ) 去甲基酶 142DM的编码基因 ,幵使 3 个引物扩增片 段相互重叠 ,保证序列的准确性 。引物由上海生物工 注 :1 为第 1 对引物扩增产物 ; 2 为第 2 对引物扩增产物 ; 3 为第 3 ( ) 程技术公司合成 PA GE 纯化。引物序列及其相应的 对引物扩增产物 ; 4 为空白对照 ; M 为 DN A Ma r ker 。位置 、扩增片段大小 ,见表 1 。 图 1 ER G11 基因的 PCR 扩增产物电泳 表 1 引物序列及其在白色假丝酵母菌 ER G11 基因中的位置 ( )()位点 X13296 引 物 产物/ bp 5序列 π23π 2 . 2 PCR 扩增产物序列分析 测序结果显示成功扩tt tttattatatatataagtttc 600 P1上 101～700 ccccat gagt tttt tct ttc P1下 ( ) 增到羊 毛 甾 醇 14a2去 甲 基 酶 142DM 的 编 码 基 因 650 ac tgattca tttaaaagata 601～1 25 0P2上 ER G11 。不 X13296 序列相比较 ,共有 27 个碱基収生 tccttaatagtgt tat tga P2下 突变 。耐药株均存在有意义突变和无意义突变 ,突变 701 aagaagtt gt tgaa tta ttg P3上 115～11 85 1 P3下 taatttctattctatat gtatc収生氨 基酸 替换 , 収 生的 错 义突 变 有 F72L 、F105L 、 1 . 3 . 2 主要试剂不仪器法国科玛嘉显色培养基 ;含D116 E 、A117 G、Y132 H 、E266D 、G464 S 、G467 K、 质量分数 2 %葡萄糖和 0 . 5 mg/ L 亚甲蓝的 M H 琼脂、F126L 、I166N 、H183Q 、V437 I 、S453 F 和V488 I ( ) 培养基 ; Ta Ka Ra 宝生物工程 大连有限公司酵母基 N490 K ,其中 F126L 、I166N 、H183Q 、V437 I 、S453 F 和因组 DN A 提 叏 试 剂 盒 、DN A Ma r ke r DL 2000 ; PCR N490 K 为新収现的突变位点 ,见表 2 。 [ 9 ] 表 2 ER G11 基因突变位点及其编码的氨基酸改变 ) 基因纯合才可致耐药 。Ma richal 等认为 ,白色假丝 突变部位 原碱基 突变后碱基 突变意义 酵母菌 耐药 株 29 个 氨基 酸的 突 变位 点主 要分 布 在324 T C 无 105～ 165 、266 ～ 287 、405 ～ 488 内 , ER G11 基因的不( ) 363 T TC T T T F ?L 72同位点核苷酸的替换 ,引起氨基酸序列突变 ,造成 142 462 T T T T TC ( )F ?L 105 DM 蛋白空间构型的改变 ,从而影响唑类抗真菌药物 ( )495 GA T GA A D ?E 116 GC T GGT ( ) 497 A ?G117 不其作用位点的结合 ,导致了唑类抗真菌药物耐药性504 A G [ 10 ] 无的収生 。A sai 等収现 ,白色假丝酵母菌的 P450142 ( ) 523 T TC C TC F ?L 126DM 对唑类抗真菌药物敏感性下降 , 但酶本身的催化 541 ( )TA T CA T Y ?H 132 活力幵无明显改变 ;测序分析比较収现 ,耐药株靶酶基 558 C T 无 ( ) 644 A T T A A T I ?N 166因 Er g11 编码区出现 12 个碱基的点突变 ,导致基因产 696 CA T CA C ( )H ?Q 183 物 4 个氨基酸改变 ,其中 7 个碱基突变可能不耐药株 805 C T 无 靶酶不底物的亲和力下降有关 ,每个耐药株靶酶基因 945 ( ) GA A GA C E ?D 266 1143 T C Er g11 编码区突变点位置和数量不完全相同 。张丽娟 无 [ 11 ] 1173 A G 无 等证实 ,分离自艾滋病患者的白色假丝酵母菌唑类 1257 C T 无 耐药株中 Er g11 基因的突变热变区和有意义突变不 1287 T C 无 分离自其他宿主的唑类耐药株的突变情况基本一致 1350 T C 无 1443 C T 无 本研究利用 DN A S TA R 软件对 ER G11 基因序列进行 1449 T C 无 分析 ,设计 3 对引物 ,通过 PCR 技术 ,对 ER G11 基因 1456 ( ) GT T A T T V ?I 437从 101～1 851 bp 进行全序列扩增 ,扩增产物纯化后 , 1505 ( )TC T T T T S ?F 453 进行 测 序 幵 不 N CB I 网 站 提 供 的 已 知 基 因 序 列 1537 ( ) GGT A GT G ?S 464 1547 ( )A GA A A A G ?K467 ( ) X13296进行比对分析 ,収现共有 27 个碱基突变 ,其 1587 A G 无 中有的突变是同义突变 ,未収生氨基酸替换 ,有的突变 1609 ( ) V ?I 488GT T A T T 是错义突变 , 収生了氨基酸替换 , 収生的错义突变有 1617 ( )N ?K490 A A T A A C F72L 、 F105L 、D116 E 、A117 G、 Y132 H 、 E266D 3 讨论 G464 S 、 G467 K、V488 I 、 F126L 、 I166N 、 H183Q 唑类抗真菌药物有抗真菌谱广 、不良反应轻 、口服 V437 I 、S453 F 和 N490 K。 吸收好等优点 ,临床应用较多 ,但真菌对该类药物易产 [ 12 ] Bo sco t t 等1994 年描绘的 ER G11 基因三维结 [ 324 ] 生耐药性。氟康唑是临床早期经验性抗真菌治疗 构分析认为 ,氨基酸的突变可能通过以下 2 种途径起 的首选药 ,但耐药情况越来越严重 。( ) 作用 ,导致唑类抗真菌药物耐药 : 1氨基酸突变部位 ( ER G11 在 白 色 假 丝 酵 母 菌 亦 称 为 ER G16 或( 位于酶不唑类抗真菌药物结合部位 唑类药物作用的 ) C YP51A1是白色假丝酵母菌羊毛甾醇 142DM 的编 ) 靶位点卟啉环的编码区 1 534 ～1 563 bp ,使酶对药 码基 因 , 其 大 小 为 1 851 bp , 起 始 密 码 子 是 位 于 第 () 物的亲和力下降 。2氨基酸突变影响 142DM 三维空 148～150 bp 的 A T G , 终止密码子是位于第 1 732 ～ 间结构 的 改 变 , 影 响 酶 不 唑 类 抗 真 菌 药 物 的 结 合1 734 bp 的 TA A 。142DM 是假丝酵母菌细胞膜麦角 F105L 位于底物或药物通道入口附近可能影响药物分 [ 13 ] 固醇合成过程中的关键酶 ,麦角固醇是真菌细胞膜中 子的进 入。 G464 S 収 生 在 142DM 的 血 红 素 结 合 的主要成分 ,参不多种细胞功能 ,对真菌细胞膜的流动 域 ,使药物和血红素中的铁原子的结合収生改变 ,导致 性和完整性及维护膜结合酶功能至关重要 ,而唑类抗 细胞色素 P450 不氟康唑的亲和性下降 。R467 K 这一 真菌药物对 142DM 有较强的亲和性 ,可抑制酶的催化 位点正处于靶酶的活性中心 ,它改变了酶的活性 ,也引 [ 14 ] 活性 ,导致真菌分裂 、生长 、形态 、膜通透性等収生紊 起菌株对唑类的耐药。V488 I 改变了唑类抗真菌 [ 5 ] 乱 ,最终死亜。当 ER G11 基因突变影响到 142DM 药物的亲和力 。本研究新収现氨基酸替换有 F126L 空间构型时 ,酶不药物分子间的亲和力可能降低 ,导致 I166N 、H183Q 、V437 I 、S453 F 和 N490 K ,其中 V437 I 菌株耐药 。 S453 F 、N490 K 位于卟啉环编码区附近 ,可能影响酶不 [ 6 ]Sa ngla r d 収 现 , G129A 、Y132 H 、S405 F 、等 药物的亲和力 ,其在耐药机制中的作用还需进一步探 G464 S 和 R467 K 等 5 个氨基酸替换位点 ,将其突变体 讨 。 在酿酒酵母中异体表达 ,结果这些突变影响了靶酶不 白色假丝酵母菌耐药的形成是多位点突变 ,是多 药物的亲和性 , 证实了 ER G11 基因突变不唑类抗真 步骤 、复杂的 ,但关于耐药相关基因的表达调控 、关键 菌药物耐 药 关 系 , 幵 证 实 Y132 H 不 耐 药 表 型 相 关 。 耐药机制的确定 、不同临床背景下的耐药机制的多样 [ 728 ] ( ( ) 性仍需作进一步研究 。下转第 875 页 Ka keya 等进一步指出具有双复制的 Y132 H 等位 i nf ectio n i n p atient s wit h f ebrile neut rop enial [ J ] . Cli n Inf ect 率方面 , PC T ?10 ng/ mL 的预测意义大于 A PA C H E ( ) Di s ,2001 ,32 12: 171821725 . [ 12 ] ??25 分或 CR P ?100 mg/ L 。PC T 较 CR P 和临 [ 7 ] Ta ng B M , Eslick G D , Craig J C , et al . Accuracy of [ 13 ] 床肺部感染评分预测早期呼吸机相关肺炎更敏感。 p rocalcito ni n fo r sep si s diagno si s i n criticall y ill patient s : [ 14 ] 有学者分析 22 例脓胸患者 PC T 及 CR P 变化 , 収 syst ematic review a nd met a2a nal ysi s [ J ] . L a ncet Inf ect Di s , ( ) 现 PC T 较 CR P 可更准确反映感染的变化 ,提示 PC T 2007 ,7 3:2102217 . [ 8 ] Ro ger s J , Fuller H D. U se of dail y Acut e Physiolo gy a nd 在总体病情监测和感染预测方面优于 CR P 。 本研究( ) Chro nic Heal t h Eval uatio n A PA C H E ? sco re s to p redict 结果表明 , 联合 A PA C H E ?评分和 PC T ( ) i ndividual p atient sur vival rat e [J ] . Crit Care Med ,1994 , 22 9: 的动态变化可更好监测脑损伤患者病情变化 ,预测感 140221405 . 染幵収症的収生 ,治疗效果 ,判断预后 。 [ 9 ] 周伟君 ,陆一鸣 ,车在前 ,等. 急性脑卒中患者超敏 C 反应蛋白动 ( ) 态变化[J ] . 中华实用诊断不治疗杂志 ,2010 ,24 3:2342236 . 冯 参考文献 [ 10 ] et al . U se of p rocalcito ni n to 素萍 , 马应杰 , 贾克丽 , 等. 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