柞蚕丝复合氨基酸的提取研究

柞蚕丝复合氨基酸的提取研究 研发前沿柞蚕丝复合氨基酸的提取研究贾艳梅武汉科技学院化工学院湖北武汉430073柞蚕是我国的优势资源世界上约90的柞蚕资源集中在中国。每年的缫丝下脚料及绢纺落棉数量可观从节约资源和综合利用的角度出发成功提取并有效利用蚕丝复合氨基酸是蚕丝综合利用的一个主要途径。柞蚕复合氨基酸是从天然柞蚕丝中提取的氨基酸混合物含有18种氨基酸其中8种氨基酸是人体必需而又不能自身制造的80以上为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸这些氨基酸具有较高的生理活性和人体相容性极易被组织吸收对人体具显著的保健作用。如甘氨酸和丝氨酸可降低血液中胆固醇浓度、降低血糖值有防治高血压和糖尿病作用丙氨酸能促进血液中酒精的代谢有解酒保肝功能酪氨酸促进甲状腺素和肾上腺素的合成可防治老年痴呆等等1。蚕丝复合氨基酸也是一种高活性的美容护肤原料2具有天然保湿、营养肌肤、抑制黑色素形成、促进皮肤组织再生、防止龟裂和化学损害等作用在化妆品中应用广泛是一种不可多得的功能性生物材料。利用丝厂下脚如茧衣、蛹衬、挽手及绢纺落棉等提取氨基酸不仅可以变废为宝物尽其用减少制丝废弃物的污染更为食品、保健品、化妆品等行业提供天然的氨基酸原料促进其向天然绿色环保的方向发展。本实验采用磷酸水解工艺提取复合氨基酸探讨各因素对水解工艺的影响确定合理的工艺参数以期研制一种符合食品、化妆品的蚕丝氨基酸产品为柞蚕丝氨基酸提取工艺的优化提供实验依据。实验部分1提取原理蚕丝是蛋白质纤维基本结构单元是氨基酸其分子组成为链状结构肽链可在一定条件下发生水解反应肽键断裂得到不同相对分子量的蚕丝蛋白产品复合氨基酸是蚕丝最终水解产物。其反应原理为2工艺流程柞蚕废丝?前处理?磷酸水解?沉淀分离?树脂脱盐?喷雾干燥?成品3实验方法在反应器中投入计量的磷酸及蒸馏水搅拌加热至一定温度加入经前处理的柞蚕废丝反应一定时间降温用氧化钙中和沉淀过滤除渣滤液经树脂脱盐浓缩后经喷雾干燥即得复合氨基酸产品。结果及讨论1水解用剂选择可用于水解蚕丝的方法主要有3种即酸水解、碱水解和酶水解法。由于酶具有很强的使用局限性单独使用很难使蚕丝水解成所需分子量而必须借助于酸法酶的活性受环境条件限制工艺难以掌握更重要的是目前国内还没有找到一种适合于柞蚕丝水解的蛋白酶。而碱法水解常常使氨基酸消旋化3产品不易被吸收影响其生理活性。因此实验采用酸法水解分别选用H2SO4、HCl、H3PO4这3种酸进行水解反应实验表明HCl水解蚕丝氨基酸收率高、成本低但盐酸易挥发、污染环境、腐蚀设备、工艺过程排酸困收稿日期2009-02-25作者简介贾艳梅1967-女教授级高工研究方向为蚕丝资源综合利用及精细化学品。HNCHRCONHCHRCOOH NCHNCHRCONHCHRCONHCHRCONHCHRCONHCHRnCOOH HNCHRCONHCHRCOOHHNCHRCHRCOOHHNCOOH……末端末端蚕丝大分子……肽键肽氨基酸262009年6月21日第十七卷第12期研发前沿难、产品颜色较深H2SO4和H3PO4比较氧化钙中和产物硫酸钙的溶度积7.10×-5比Ca3PO42的溶度积2×0-33大得多磷酸法可最大限度地清除剩余的酸根离子磷酸属中等强度的无机酸水解条件温和、挥发性低、无毒制备的产品色泽浅、质量好。实验选择磷酸为水解用剂。2水解工艺采用磷酸为水解剂对影响水解的各种因素如水解时间、水解温度、磷酸浓度、料酸质量比进行探讨四因素三水平L934正交实验表表1对正交实验结果进行表2优化水解工艺确定最佳的柞蚕丝水解工艺参数。表2表明磷酸浓度对蚕丝的水解率影响最大随磷酸浓度提高水解程度提高料酸比对水解影响最小。水解 反应为吸热反应升高温度可以使化学平衡向正反应方向移动水解百分率提高反应速度也快对水解有利但温度过高会使产品颜色加深影响质量在实验温度范围内120?水解率最高但所得产品颜色太深故选择水解温度为100?。根据正交试验结果确定最佳水解条件为温度100?、时间15h、H3PO4浓度5mol/L、料酸质量比为?5。3中和沉淀及树脂除盐水解液中含大量的PO43-离子必须除去实验采用中和沉淀分离的方式将其除掉。在中和工艺中分别试用了氧化钙和碳酸钙进行中和反应实验发现氧化钙中和反应时不产生大量泡沫操作方便可以控制反应终点pH657使残留PO43-降至最低同时生石灰用量也比碳酸钙节省约5且价格比碳酸钙便宜生产成本更低。因此实验采用氧化钙中和沉淀、抽滤的方式除掉PO43-制得蚕丝复合氨基酸溶液。中和沉淀工艺对产品质量的影响极为显著特别是对灰分含量的影响起决定性作用。不同pH值对灰分的影响见表3。实验发现中和pH值过低灰分含量低但整个反应料液呈酸性PO43-去除不完全中和pH值过高氧化钙过量产物中灰分过高。因此选择中和pH值在6.57.之间并进一步利用离子交换树脂脱盐。实验采用强酸强碱型的732、77树脂混床对水解液进行脱盐将中和、抽滤后的水解液以一定流速通过732、77混床收集流出液测定含盐量结果见图。实验发现水解液流速低脱盐彻底但氨基酸损失严重流速加快氨基酸回收率提高脱盐率降低但降低幅度较小。当水解液流速在5倍柱体积时脱盐率达86.3氮回收率也在7.3综合效果最佳。图1水解液流速对氮回收率及脱盐率的影响4喷雾干燥复合氨基酸溶液在喷雾干燥之前一般需进行浓缩处理使其达到一定的浓度。为节约能源提高效率制得浅颜色的氨基酸产品采用减压浓缩工艺。浓缩后物料在进口22?、出口8?下喷雾干燥即得到粉末状的复合氨基酸产品。5蚕丝复合氨基酸组成及理化指标氨基酸组成氨基酸含量采用日立835-5型氨基酸自动分析仪测定上机浓度为3.76μg/5μL测试结果见表4。序号A温度/?B时间/hC磷酸浓度/mol/LD料酸比8933224432555序号水解温度/?水解时间/hH3PO4浓度/mol/L料酸比水解率/8933523282446883855572349456465253743653458797295474288223569292543799K 62634957286452K26443667465646499K36873673672346576极差R6623875624因素主次CABD注每次水解柞蚕落棉100g蚕丝水解百分率计算公式×100水解液体积氨基氮含量样品重量总氮含量水解率pH值456657758灰分/35837545424324953427研发前沿图3发酵过程酶活变化对比由以上实验数据对比知缓冲实验取得了非常理想的效果发酵过程中pH控制在5.58.5之间且腈水合酶的活性保持在较高的水平发酵生产周期也缩短了近20h。由于第三组分X在发酵过程中不仅有pH缓冲作用而且能够促进菌体对葡萄糖的吸收改善体系的电极电位从而更有利于各种生物酶的合成而碳酸氢根在发酵生产过程中有抑制菌体生长的副作用因此确定采用加入第三组分X来控制发酵生产中pH。通过对比实验发现在发酵基础配方中加入第三组分X的适宜的量应为015。结论通过对以上几个方面的研究获得了腈水合酶生产菌种发酵培养基组成的确定方法及最佳含量并提出了培养基的灭菌控制方法、种子质量的控制以及发酵过程中pH的控制方法并在生产实际应用中取得了显著的效果发酵周期可缩短2h以上酶活提高4以上。由于影响发酵过程的因素太多而且有些因素还是未知的特别是影响发酵的主要因素也会发生变化因此本文只从以上4个方面进行了研究。目前腈水合酶生产菌种工业发酵生产的程控调节只是依靠经验进行大范围的调控很少实行实时监测调控而发酵过程的在线检测和自动控制技术水准完全能达到实时精确调节的程度。自动实时调控已成为今后工业发酵程控的发展方向并对实现发酵过程的全程可控具 有显著的作用。参考文献〔1〕 RebeccaACDonC.Molecularcharacterizationofanovelthermiphilicnitvilehydratasa 〔J〕.BiochimicaetBiophysicacta19991431:249260〔2〕 MasanariTsujimuraNaoshiDohmaeMasafumiOdakaetal.Structureofphotoreactiveironcent erofthenitvilehydratasafromrhdocollusSp.N-77〔J〕.TheJournalofBiologicalChemistry997272:2945429459〔3〕马武生马同森杨生玉.腈水合酶及其在丙烯酰胺生产中应用的研究进展〔J〕.化学研究2004507580〔4〕陈坚堵国成李寅等.发酵工程实验技术〔M〕.北京化学工业出版社20039300〔5〕陈跖孙旭东史悦等.微生物法生产丙烯酰胺的研究?〔J〕.生物工程学报20028:5558pH参考文献柞蚕丝水解制得的复合氨基酸共含有8种氨基酸包括人体必需的8种氨基酸含量最高的氨基酸种类是甘、丙、酪、丝、天门冬氨酸5种占8左右。产品指标实测值结论水解反应中磷酸浓度对氨基酸提取影响最大酸料比影响最小最适宜的水解条件为磷酸浓度5mol/L、温度?、时间5h、料酸比?5。2氧化钙中和沉淀的最佳pH值为657此时中和效果较好利用732、77树脂除盐水解液流速在5倍柱体积时除盐率达到863氮回收率73可制得低无机盐含量的复合氨基酸产品。3采用磷酸水解、氧化钙中和、沉淀分离、树脂脱盐、喷雾干燥的工艺可提取柞蚕复合氨基酸产品产品质量稳定符合食品及化妆品原料要求。氨基酸名称含量/mg100mg氨基酸名称含量mg100mg天门冬氨酸8.08亮氨酸86苏氨酸58酪氨酸37丝氨酸6苯丙氨酸74谷氨酸87赖氨酸5甘氨酸2767组氨酸98丙氨酸93精氨酸44缬氨酸42脯氨酸蛋氨酸49色氨酸微量异亮氨酸43胱氨酸微量注带者为人体必须氨基酸项目标准值实测值外观白色或淡黄色粉末淡黄色粉末pH值水溶液57652干燥失重/?53灰分含量/?423总氮量/?443汞含量/mg/kg?0.1未检出砷含量mgkg?1.0未检出铅含量mgkg?0.5未检出〔〕朱良均姚菊明李幼禄.蚕丝蛋白的氨基酸组成及其对人体的生理功能〔J〕.中国蚕业9974244〔2〕贾艳梅.柞蚕丝蛋白的护肤特性及其在化妆品中的应用〔C〕.第五届国际野蚕学术会议论文集20089283〔3〕李岩亮刘影贾延华.硫酸水解制备柞蚕丝素肽的研究〔J〕.辽宁丝绸2004489上接第25页h28