REM期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质ATF

REM期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质ATF 第二军医大学 硕士学位论文REM期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质ATF-6α和CHOP蛋白表达的影响 及药物干预 姓名:林巧 申请学位级别:硕士 专业:神经病学 指导教师:赵忠新 20080501 ,,，,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,【和,,,,蛋白表达的影响及药物干预 英文缩略词表英文缩写 英文全名 中文全名,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, 睡眠剥夺,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,, 快速眼动,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,, 非快速眼动脚,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 改良多平台法,, ;,,, ;,,,,,, 正常对照,, ,,,, ;,,,,,, 环境对照,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, 未折叠蛋白应答,, ,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,, 内质网,,, ,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,, ,,,,,, 内质网应激,,,,, ,;,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,;,,,,, 激活转录因子,,,,,,，, ,,,;,,,—,,,,,,,,,, , ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,, 葡萄糖调控蛋白,,,, ,, ,,,,,,, 内质网应激应答元件,,,, ,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,, 内质网相关性降解,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,同源蛋白,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, 生长抑制和,,,损害 ,,,,,;,, , ,, 诱导基因,,,，,,,, ，,,,,,,, ,,？,,, ,,,, ,,,,,,, 抑制阻抗性酯酶,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,(,;,,,,,,, 双链,,,依赖的蛋白 ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,; 激酶样内质网激酶 ,,,,;,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,;,,,,， 移码转录因子一,,, ,,,,,,,(,,,, 蛋白质免疫印记,, ,,,,,;,,,,,,,, ,,,,,, 硝酸纤维素膜,, ,,,,;,, ,,,,,,, 光密度,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, 磷酸盐缓冲液,,,,, ,,;,,,,,,,,,,,,;,,,; ,;,, 对氨苯氧乙酸盐 ,第二军医大学硕士学位论文,,,, 二甲氨基乙醇 ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, 辣根过氧化物酶,,, ,;,,,, ,,,,,, 活性氧族,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, 超氧化物歧化酶,, ,,,,,,,,, ,,,,,, 氧化应激 , 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名: 日期:加脚,月叫日 学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名: 导师签名日期:,?密年,为?,日 日 期:, ,,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,和,,,,蛋白 表达的影响及药物干预摘要观察不同时间快速眼动(,,,)期睡眠剥夺以及盐酸甲氯芬酯干预对大鼠大脑皮质,,,(,(,,和内质网前凋亡因子,,,,,,,,,,,,蛋白表达的影响，探讨睡眠剥夺是否造成了内质网应激，是否启动了内质网应激相关的凋亡途径以及盐酸甲氯芬酯可能的神经保护;采用改良多平台睡眠剥夺法制备不同时间快速眼动期睡眠剥夺(,,,,,)大鼠模型，按随机数字表把大鼠分为正常对照组、环境对照组、睡眠剥夺模型组、盐酸甲氯芬酯干预组和生理盐水干预组。通过免疫荧光染色和,,,,,,,—,,,,实验检测,,,(, ,和,,,,蛋白的表达情况;免疫荧光法观察到,,,。, ,分布在细胞浆和细胞核，,,,,则主要分布在细胞核内，胞浆未见着色。免疫荧光染色和,,,,,,,,,,,,实验提示睡眠剥夺后,,,(, ,表达增多，呈现先升后降的趋势;而睡眠剥夺第,天开始出现,,,,蛋白表达，随着睡眠剥夺时间的延长，,,,,蛋白表达逐渐增加。腹腔注射盐酸甲氯芬酯后,,,一, ,和,,,,蛋白表达均明显下降;短期睡眠剥夺可诱导,,,(,通路活化，从而启动内质网应激的,,,通路，发挥自身保护作用。长时间睡眠剥夺可激活前凋亡因子,,,,，并可能最终导致细胞凋亡。盐酸甲氯芬酯可能通过减轻内质网应激反应程度和抑制细胞凋亡而发挥神经保护作用。 〔关键词〕快速眼动，睡眠剥夺，,,,(, ,，,,,,，内质网应激，盐酸甲氯芬酯，,,,,,,;,〕,, ,,,,,,, ,;,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,一, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,, , ,, ,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,),,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;, ,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, , ,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,(,,,),,,,, ,,,,,,,,,,,;,,, ,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,(,,,,)(,,, ,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,:;,,, ;,,,,,, ,,,,,(;;，,,, ,)，,,,,;,,,,,, ,,,,,(,,,,,, ,)，,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,(,,,,)，,,,,,, ,,,,,(,,,,),,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,(,,,,)(,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,一,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,;,,,,(,,, ,,,,—？,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,一,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,—,,,,(，,,,,,,,,,, ,,;,,;, ,,,,,,,, ,, ,,,?,, ,,,,,, ,,;,,,,,,,, ,,, ,,;,,,, ,, ,,, ;,,,,,，,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,, , ,,,?,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,;,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, , ,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,, ,, ,,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,和,,,,蛋白 表达的影响及药物干预摘要观察不同时间快速眼动(,,,)期睡眠剥夺以及盐酸甲氯芬酯干预对大鼠大脑皮质,,,(,(,,和内质网前凋亡因子,,,,,,,,,,,,蛋白表达的影响，探讨睡眠剥夺是否造成了内质网应激，是否启动了内质网应激相关的凋亡途径以及盐酸甲氯芬酯可能的神经保护机制;采用改良多平台睡眠剥夺法制备不同时间快速眼动期睡眠剥夺(,,,,,)大鼠模型，按随机数字表把大鼠分为正常对照组、环境对照组、睡眠剥夺模型组、盐酸甲氯芬酯干预组和生理盐水干预组。通过免疫荧光染色和,,,,,,,—,,,,实验检测,,,(, ,和,,,,蛋白的表达情况;免疫荧光法观察到,,,。, ,分布在细胞浆和细胞核，,,,,则主要分布在细胞核内，胞浆未见着色。免疫荧光染色和,,,,,,,,,,,,实验提示睡眠剥夺后,,,(, ,表达增多，呈现先升后降的趋势;而睡眠剥夺第,天开始出现,,,,蛋白表达，随着睡眠剥夺时间的延长，,,,,蛋白表达逐渐增加。腹腔注射盐酸甲氯芬酯后,,,一, ,和,,,,蛋白表达均明显下降;短期睡眠剥夺可诱导,,,(,通路活化，从而启动内质网应激的,,,通路，发挥自身保护作用。长时间睡眠剥夺可激活前凋亡因子,,,,，并可能最终导致细胞凋亡。盐酸甲氯芬酯可能通过减轻内质网应激反应程度和抑制细胞凋亡而发挥神经保护作用。 〔关键词〕快速眼动，睡眠剥夺，,,,(, ,，,,,,，内质网应激，盐酸甲氯芬酯，,,,,,,;,〕,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,一, ,;,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,, , ,, ,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,),,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;, ,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, , ,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,(,,,),,,,, ,,,,,,,,,,,;,,, ,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,(,,,,)(,,, ,,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,:;,,, ;,,,,,, ,,,,,(;;，,,, ,)，,,,,;,,,,,, ,,,,,(,,,,,, ,)，,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,(,,,,)，,,,,,, ,,,,,(,,,,),,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,(,,,,)(,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,一,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,;,,,,(,,, ,,,,—？,,,,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,一,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,—,,,,(，,,,,,,,,,,,,;,,;, ,,,,,,,, ,, ,,,?,, ,,,,,, ,,;,,,,,,,, ,,, ,,;,,,, ,, ,,, ;,,,,,，,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,, , ,,,?,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,,;,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, , ,,,,, ?洌澹穑颍椋觯幔簦椋铮睿 幔睿?,,,,, ,,,,;,,,,, ,, , ,,,,?,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,;;,;, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,;,,,,，,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,, , ,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,,,,,,, , ,,,?, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,, , ,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,, ,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,, , ,,,,?,,,,, , ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,:,,,,,—,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,(,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,,(,,,;, ,,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,, ,,,,,,(,,,, ,,, ,;,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,(，, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,;, ,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,, ,, ,,,,;,, ,,,,,,;,,, ,,, ,, ,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,,,,(【,,, ,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,,;,,,一,,,;,,,,;,,,,,,,,,,;,,,,;,,,, ,,,,,,;,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,【和,,,,蛋白表达的影响及药物干预 中文摘要 目的通过观察不同时间快速眼动(,,,)期睡眠剥夺及中枢性兴奋药盐酸甲氯芬 酯(,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,)干预后大鼠大脑皮质,,,一, ,(,;,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,;,,,,, ,)和前凋亡因子,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,—,,,,;,,,, ,,,, ,,,)蛋白表达的变化， 探讨睡眠剥夺是否造成了内质网应激，是否启动了内质网相关的凋亡途径以及盐 酸甲氯芬酯可能的神经保护机制。 方法采用改良多平台水环境,,,期睡眠剥夺法(删,,)制备大鼠,,,期睡眠剥 夺模型。成年雄性,,大鼠随机分为,,,期睡眠剥夺组(,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,， ,,,)、正常对照组(,,，,,,,)和大平台实验环境对照组(,,，,,,,)。,,,睡 眠剥夺组又分睡眠剥夺模型组(,,,,)，生理盐水干预组(,,,,)以及盐酸甲氯芬酯 (,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,,)干预组(,,,,)，睡眠剥夺组各分为睡眠剥夺,天 (,,,,)、,天(,,,,)、,天(,,,,),个时间点。盐酸甲氯芬酯干预组从睡眠 剥夺第一天开始按,,,,,,,,,,剂量腹腔注射盐酸甲氯芬酯;生理盐水组按同样 的时间和方式给予等量生理盐水。运用免疫荧光技术大鼠大脑皮质,,,,, , 和,,,,蛋白表达及其变化，运用蛋白质免疫印记 ,,,,)技术对大鼠 大脑皮质,,,,, ,和;,,,作(,,,,,,,— 半定量分析。 结果 ,、免疫荧光染色结果显示皮质区,,,一, ,在细胞浆和胞核均有分布。,,,一, ,在 正常对照组(,,)和环境对照组(,,)以胞浆表达为主， 其表达量在,,与,, 两组之间比较无统计学差异(,,,(,,)。睡眠剥夺第,天(,,，)起，大鼠大脑皮 质细胞的胞核中,,,,, ,表达开 ,呈密集分布，,,,组 细胞核内的,,,,始增多，,,,组可见,,,一, , ,蛋白表达仍较多，但比,,,组有所减少。,,组和,,组与,,，、 ,,,、,,,组相比,,,,, ,表达量均有统计学差异(,,,(,,)，,,，、,,,、,,,组 间两两比较也有显著性差异(,,,(,,)。,,,,,,,,,,,,实验结果与之一致; ,、免疫荧光染色显示大鼠大脑皮质,,,,为细胞核内着色，胞浆未见着色。,, 组和,,组未见明显的,,,,表达，睡眠剥夺第一天可见,,,,蛋白阳性表达，,,, 组,,,,蛋白表达明显增多，至睡眠剥夺第,天达到高峰，各组间差异比较均有 统计学意义(,,,(,,)。,,,,,,, ,,,,实验结果与之一致。 ,、盐酸甲氯芬酯干预后，大鼠睡眠剥夺,天、,天、,天三个时点的大脑皮质,,,, ,和,,,,的表达均被抑制，与生理盐水干预组比较有显著性差异。 结论第二军医大学硕士学位论文,、,,,期睡眠剥夺早期即可引发,,,,, ,表达增多，说明其可能启动了内质网应激中的未折叠蛋白应答通路之一的,,,一,途径，即诱发内质网应激。随着睡眠剥夺时间延长，,,,,, ,仍维持在高水平表达，提示,,,一,通路可能参与启动了内质网应激的凋亡程序。长时间睡眠剥夺(,天),,,,, ,降低可能与内质网功能障碍，不能继续适应新的细胞内环境变化有关。,、,,,,是一种前细胞凋亡因子，它的过度表达可导致生长停滞和细胞凋亡。随着睡眠剥夺时间的延长，,,,,表达增多，并持续在较高水平，意味着睡眠剥夺可能最终启动细胞凋亡程序，这或许就是睡眠剥夺造成机体各种损伤的机制之一。,、中枢性兴奋药物盐酸甲氯芬酯可以抑制睡眠剥夺后引起的大鼠大脑皮质,,,一,,和,,,,的表达升高，说明在睡眠剥夺导致内质网功能紊乱的情况下，盐酸甲氯芬酯可能是通过减轻内质网应激程度，抑制细胞凋亡而发挥神经保护作用。 〔关键词〕快速眼动，睡眠剥夺，,,,(,，,,,,，内质网应激，未折叠蛋白通 路，盐酸甲氯芬酯 , , ,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质，,,,, ,【和,,,,蛋白表达的影响及药物干预 ,,,,,,;, ,,, ,,,,;, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,一, , ,,, ,,,, ,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,, ，,,,,,,,,,,, 【,,,,,,,,,〕 ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,??, ,;,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,?,,,,,,,,,, ,,;,,, ,,,,,,,,, , ,, ,,,, ,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,),,, ,,, ,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,;, ,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,, ,,,一,, ,,, ,,,,,,,,, , ,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,),,,,, ,,,,,,,,,,,( ，,,,,,,,〕,,, ,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,,)(,,, ,,, ,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,:;,,, ;,,,,,, ,,,,,(,,，,,, ,)，,,,, ;,,,,,, ,,,,,(,,，,,, ,),,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,(,,,，,,,,)(,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,圮,,,,,,,,,，,, ,,,,, ,,,,,(,,,,)，,,,,,, ,,,,,(,,,,),,, ,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,, ,,,,,(,,,,)(,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, , ,,,，, ,,,, ,,, ,,,,,(,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,(, ,,,,,,,，,,),,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,(,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,,;,,,,,,, ;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,;,,;,(,,, ,,,,—？,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,(【,,,,,,,〕,(，,,,,,,,,,,,,;,,;, ,,,,,,,, ,, ,,,一,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,,, ,,;,,,,,, ,,, ;,,,,,，,,, ,,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,, ;,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,，,,,;, ,,,,,, ,,,,,,,,;,, ,,,,,,,;,,;,(,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,, , ,,,?, ,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, , ,,,?, ,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,, ,,,,;,,,,, ,, , ,,,?, ,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,, ,,,,,,,,;,, ,,,,,,,;,,;, ,, ,,,一,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,;,,;,(,(，,,,,,,,,,,,,;,,;, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,;,,,,(,,, ,,,, ,第二军医大学硕士学位论文,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,, ,, ;,,, ;,,,,,,(,,),,,,, ,,, ,,,, ;,,, ,,,,,,(,,),,,,,(,,,, ,,,,,,,?椋铮?,, ,,,, ,, ;,,,,,,, ;,,,,, ,,,,,,, ,,,, , ,,,?, ,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,;,,,,,, ,,,,, , ,,,,?,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, , ,,,,?,,,,, ,,, ,,,;,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,，,,,;, ,,,, ,,,,,,,,;,, ,,,,,,,;,,;,(,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,;,,;,(,(,,, ,,,,,, ,, ,,,?,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,, ,,,;, ,,,, ,,,,,,—,,,,,,, ,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,, ;,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,、,,,, ,,, ,,,,(,,,,, ,,, ,,,,,,,,;,, ,,,,,,,;,,;, ,,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,(，,,,;,,,,,,〕 ,(,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,, ,,,,,, ;,,,,,,, ;,,,,,，,,,;, ,, ,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,(，,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,;,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,; 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,,,,;,,,,,,,,,,， ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,, , ,,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,,和,,,,蛋白表达的影响及药物干预 第一部分,,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,和 ,,,,蛋白表达的影响 (、„?—,一、网『青 睡眠在人类生活中占有非常重要的地位，是机体不可缺少的生理需要。睡眠可促进大脑功能的发育和发展、巩固记忆、促进机体生长、延缓衰老等?。通过睡眠，精力和体力才能得到恢复，机体各系统功能才能趋于平衡。睡眠的发生和调控是脑特有的功能之一，并涉及到全身各个方面的变化。失眠(,,,,,,,,)是睡眠障碍中最常见的症状，也是不少病人就诊时最常提到的问题。失眠的发生率很高，表现为难以入睡、熟睡维持困难和醒后不能恢复精力和体力，从而影响白天的社会活动，长期慢性失眠还可能并发抑郁性情感障碍、免疫机制降低、加重原有疾病、加速衰老、影响整个身心健康等【,】。随着社会文明程度的提高，学习和工作压力不断增大以及社会环境因素的影响，失眠同渐成为困扰现代人的一大难题，并严重影响人们的生活、工作和健康。由于失眠既是医学问题，又是社会问题，因此，近年来引起人们的高度重视。睡眠剥夺是研究睡眠的生理功能及机制的重要方法，作为研究睡眠医学简便有效的手段被国内外学者广泛采用。长期睡眠剥夺可引起机体一系列学习记忆、情绪、免疫功能及体 内激素、递质的变化【,】，但具体作用机制仍不明，是目前研究的热门。 内质网应激(,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,, ,,,,,,，,,,)是指由于某种原因使得细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理过程。凡能影响内质网功能的因素，如缺血再灌注损伤、氧化应激、内质网钙代谢紊乱、化学物质处理、中毒及细胞营养物质缺乏等都能使细胞发生,,,，并激活未折叠蛋白应答(,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,)信号传导通路，后者是细胞内一种适应性保护机制【,】。但,,,持续存在或过强时，由于超过细胞自身处理能力，内质网会诱导特有的细胞凋亡通路，以消除受损又不能及时修复的细胞，并可能导致组织损伤〔,,。,,,有三条途径:，,,,通路、,,,(,通路、,,,,通路。内质网(,,,,,,,,,,;,,,,;,,,,，,,)功能受干扰可导致细胞损伤，最终死亡。为了在内质网应激条件下存活，细胞有自我保护装置应对应激。诱导,,驻留的分子伴侣，翻译减弱和,,相关性降解作用(,,(,,,,;,,,,, ,,,,,,,,,,,，,,, ”。当细胞处于严重和持续的内质网应激下，一,)，这些都称为“未折叠蛋白应答 种前细胞凋亡因子,,,,,,,,, , ,, (,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,(,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,,,,,,;,,,, ,,,, ,,,)被激活，并最终导致细胞凋亡【,“】。,,,,,,,,,,,,是,,,,,同源性蛋白，是一种内质网相关促凋亡蛋白，发挥转录因子的作用，参与调控和生存、死亡相关的基因的表达。,,,,在生理状态下 ,第二军医大学硕士学位论文低水平表达，但在内质网应激下在转录水平高度活化。转录诱导,,,,基因活化是导致细胞凋亡的一条重要途径【,,、,,。当细胞处于内质网应激下，内质网膜有三个重要的感受和转导蛋白，,,,,、,,,一,和,,,,被激活，,,,,存在于这三条通路的下游，它的过度表达导致生长停滞和细胞凋亡。据报道,,,,通过减少,;,(,的表达而增加内质网应激的敏感性，并增强氧化损伤【,】。实验证明内质网应激后期,,,,大量表达且进一步导致细胞生长停滞和细胞死亡，,,,,基因缺陷小鼠在长时间内质网应激时细胞凋亡反而明显减弱，表明,,,,介导了内质网应激时的细胞凋亡过程,,,,。综上所述，,,,,,,,,,,,,是联系内质网应激与细胞凋亡的重要中间信号分子，;唧船,蛋白水解酶是执行细胞凋亡作用的终末分子。 已知内质网应激和应激细胞死亡与多种神经系统疾病有关，睡眠剥夺亦是其中之一。睡眠剥夺作为一种强烈的应激原可对机体产生多种不利影响，所引起的应激反应涉及生物节律的破坏、心理状态的异常以及由此诱发的神经内分泌、过氧化反应、免疫调节等许多生理生化过程的改变【,,,，对人体健康的影响较大，已成为近年来应激医学非常关注的一个研究领域。国内外关于内质网应激和应激相关的细胞凋亡的研究是目前一大热点，但关于内质网应激与睡眠剥夺关系的文献较少。目前有研究指出睡眠剥夺可诱导内质网应激【,,,。但长期睡眠剥夺是否可以导致内质网应激相关的细胞凋亡呢,如果睡眠剥夺最终能导致细胞凋亡，那又可能是通过哪些机制呢,睡眠是一个复杂的节律性生理过程，按照睡眠过程中脑电图、肌电图、眼球运动情况可将其分为非快速眼动(,,,,)睡眠期和快速眼动 (,,,)睡眠期。,,,睡眠在记忆的巩固、脑内蛋白合成、基因表达、神经递质的合成和突触重建中起重要作用【,,。我科近两年对,,,睡眠剥夺后未折叠蛋白应 答通路，,,,途径和,,,,途径的相关蛋白进行研究，也已证实睡眠剥夺可引起内质网应激，其作用可能是通过激活内质网，,,,通路和,,,,通路实现的【,,?,,】。我科以往实验发现完全睡眠剥夺和,,,睡眠剥夺均能引发内质网应激反应，,,,睡眠剥夺大鼠的大脑皮层和海马可见到神经元细胞凋亡的形态学改变，免疫组化分析表明长期,,,睡眠剥夺能诱导;唧嬲(,,蛋白的表达，但在睡眠剥夺时内质网应激如何介导;,,,,,(,,蛋白表达的作用机制还不明确。 因此本研究拟通过观察,,,期睡眠剥夺后大鼠大脑皮质,,,(, ,蛋白表达变化，从而探讨睡眠剥夺是否可通过激活,,,(,通路引发内质网应激及相关的病理生理机制。本研究还拟通过观察不同时间睡眠剥夺后大鼠大脑皮层,,,,蛋白的变化进而探讨睡眠剥夺与内质网应激及内质网应激相关的细胞凋亡之间的关系，为睡眠剥夺后一系列机体病理生理改变提供可能的实验依据。 , ,,,期睡眠剥夺对大鼠大脑皮质,,,,, ,【和,,,,蛋白表达的影响及药物干预二、实验材料及方法 (一)实验材料 ,、实验动物 ,(,种系:,,,,,,, . —,,,,,,大鼠，简称,,大鼠。 ,(,质量:成