分析HPLC 同时测定通脉丸中6 个指标性成分的含量

分析HPLC 同时测定通脉丸中6 个指标性成分的含量 通脉丸是全国周围血管专业主任委员崔公让教授的经验处方，由制附子、黄芪、两头尖、制马钱子、丹参等多味中药组成，现为河南中医学院第一附属医院院内制剂，具有祛风湿、通经络、消肿痛之功效。用于治疗血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症、风寒湿痹、四肢惊孪等肢体缺血性疾病，临床疗效突出。查阅目前文献报道，对通脉丸的含量测定主要是针对单一成分，本课题在前期的试验中建立了通脉丸中竹节香附素A 和总皂苷的含量测定方法，本次采用高效液相色谱法测定通脉丸中士的宁、马钱子碱、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸B 6 个成分，为下一步考察物料性质对通脉丸体外溶出的影响以及通脉丸的新药研发提供了完整全面的测定方法。 1 材料 1. 1 仪器 e2695 型高效液相色谱仪( 包括2695型泵，2996 型二极管阵列检测器，Empower 色谱工作站，美国Waters) ，ZRS-8C 型智能溶出试验仪( 天津大学无线电厂) ，CP225D 型1 /10 万分析天平( 德国Sartorius 公司) 。 1. 2 试药 甲醇、乙腈( 色谱纯，美国Fisher 公司，磷酸( 色谱纯，迪马公司) ，超纯水( 自制) 。阿魏酸( 批号110773-201012) 、丹酚酸B( 批号111562-201212) 、马钱子碱( 批号0706-201136) 、芍药苷( 批号110736-201136) 、橙皮苷( 批号110721-201014) ，以上对照品均购于中国食品药品检定研究院。士的宁对照品( 批号101207) ，纯度> 98%，购于上海融合医药科技有限公司。通脉丸由河南中医学院第一附属医院中药制剂室提供( 批号20130301) 。 2 方法与结果 2. 1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-Aq 色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，加Agilent SB-Aq C18保护柱( 1. 0 mm × 20 mm，5 μm) ，流动相乙腈-甲醇-0. 1%磷酸水梯度洗脱，检测波长: 士的宁、马钱子碱、芍药苷、橙皮苷、丹酚酸B 为260 nm，阿魏酸316 nm，流速1 mL?min - 1，柱温35 ?，进样量20 μL，系统适应性试验。 2. 2 溶液的制备 2. 2. 1 供试品溶液取通脉丸约7 g、研细，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加水10 mL，精密称定，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用水补重，摇匀滤过，取续滤液即得供试品溶液，进样量20 μL。 2. 2. 2 对照品溶液分别精密称取士的宁、马钱子碱、阿魏酸、芍药苷、橙皮苷、丹酚酸B 对照品9. 14，9. 80，2. 50，9. 38，9. 40，9. 36 mg 置于6 个10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再分别精密量取上述对照品溶液1，1，1，2，3，6mL 加甲醇定容至25 mL，即得混合对照品溶液。 2. 2. 3 稳定性试验取通脉丸( 批号20130301) 约7 g，按2. 2. 1 项下的方法来制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24 h，按2. 1 项色谱条件进样测定，测得士的宁、马钱子碱、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸B 含量的RSD 分别为1. 3%，1. 5%，1. 3%，0. 8%，0. 9%，0. 8%，表明6 种成分在24 h 内稳定。 2. 2. 4 重复性试验取通脉丸( 批号20130301) 约7 g，平行取6 份，精密称定，按2. 2. 1 项下的方法制备供试品溶液，按2. 1 项色谱条件进样测定，测得士的宁、马钱子碱、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸B 含量的RSD 分别为2. 8% ，1. 6% ，1. 3% ，2. 4%，2. 1%，0 . 9% ，表明本方法重复性良好。 2. 2. 5 加样回收率试验取重复性试验项下已知含量的通脉丸样品6 份，每份约7 g，分别加入一定量的对照品溶液，以2. 2. 1 项下方法进行制备，按照2. 1 项色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，计算回收率及RSD，本方法回收率、准确度较好。 2. 2.6溶出液含量测定通过前期的考察本实验采用桨法，以超声脱气处理30 min 的900 mL 纯水做为溶出介质，设定溶出仪的转速为100 r?min - 1，温度为( 37 ? 0. 5) ?，分别在10，30，60，120 min 时取溶出液10 mL，立即补充相同体积相同温度的溶出介质，溶出液滤过，取续滤液，根据已经确定的色谱条件，测定溶出液中指标成分含量。 2. 3 方法学考察 2. 3. 1 线性关系分别精密量取上述混合对照品溶液1，4，8，12，16，20，30 μL 注入高效液相色谱仪，按2. 1 项色谱条件进行测定，记录色谱峰面积，绘制标准曲线，回归方程。 2. 3. 2 精密度试验取通脉丸一批( 批号20130301) ，按照供试品制备方法和已确定的色谱条件，连续进样5 次，测得士的宁、马钱子碱、芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、丹酚酸B 峰面积的RSD 分别为0. 6%，1. 5%，1. 3%，0. 7%，0. 7%，0. 6%，表明仪器精密度良好。 3 讨论 由于检测指标成分较多，梯度洗脱时流动相及流动相比例的选择需要较大的工作量。参考文献和本课题前期实验首先选择乙腈-0. 1%磷酸水梯度洗脱，但重复性不好，特别是士的宁、马钱子碱、芍药苷分离度达不到要求。经过多次调整乙腈的比例，发现芍药苷出峰时间和乙腈比例的变化关系较密切，乙腈 比例增加，芍药苷出峰时间提前与士的宁的峰部分重合，乙腈比例降低，芍药苷出峰时间推迟与马钱子碱的峰部分重合，最终发现只调整乙腈的比例很难使士的宁、马钱子碱、芍药苷完全分离。由于甲醇的洗脱能力小于乙腈，考虑把一部分乙腈换为甲醇，由原来的两相乙腈-0. 1% 磷酸水流动相换为三相乙腈-甲醇-0. 1% 磷酸水，通过调整乙腈-甲醇-0. 1%磷酸水的比例找到士的宁、马钱子碱、芍药苷的最佳分离效果。 ,