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拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用的研究

2017-11-19 39页 doc 69KB 46阅读

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拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用的研究拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用的研究 拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白 质相互作用的研究 兰州大学 博士学位论文 拟南芥线粒体中交替型NAD(P)H脱氢酶活性复合体的蛋白质相 互作用研究 姓名:徐晓丽 申请学位级别:博士 专业:植物学 指导教师:安黎哲 20100501?蔺哪虫害 兰州人学博十学位论文 摘要 细胞是生命的基本单位,而线粒体是细胞的重要的产能单位,它通过氧化磷 酸化合成,为细胞生命活动提供能量。植物线粒体中具有多种交替途径所介 导的能量耗...
拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用的研究
拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用的研究 拟南芥线粒体中交替型NADPH脱氢酶活性复合体的蛋白 质相互作用的研究 兰州大学 博士学位论文 拟南芥线粒体中交替型NAD(P)H脱氢酶活性复合体的蛋白质相 互作用研究 姓名:徐晓丽 申请学位级别:博士 专业:植物学 指导教师:安黎哲 20100501?蔺哪虫害 兰州人学博十学位论文 摘要 细胞是生命的基本单位,而线粒体是细胞的重要的产能单位,它通过氧化磷 酸化合成,为细胞生命活动提供能量。植物线粒体中具有多种交替途径所介 导的能量耗散系统,主要包括未端交替氧化途径,解偶联途径和交脊型 脱氢途径。交替型脱氧途径由一类交替型脱氧酶催化,能 够催化电子沿电子传递链传递给,但是不伴随质子跨膜梯度形成和产生, 因其不能被鱼藤酮所抑制,又被称为鱼藤酮非敏感性脱氢酶。近年来 在分离交替型脱氢酶方面取得了很多进展。对于蛋白质的研究近年末 又成为焦点,在蛋白质复合体水平上的研究,不仅可以揭示未知功能蛋白的 功能, 还可以在探索己知蛋自在不同复合体中的新的功能。本论文以模式植物拟南 芥为 研究对象,从拟南芥线粒体可溶性部分中分离到一种具有类似于交替型 脱氢酶活性的复合体。通过质谱鉴定和蛋白质复合体研究手段确定了 陔复合体巾蛋白质~蛋白质相互作用。取得了以下研究结果: .利用.从拟南芥线粒体可溶性部分中分离得剑一个具有交替 型脱氢酶活性的复合体。利用.质谱鉴定发现,在这个复 合体巾除了硫辛酰胺脱氢酶以外,还存在两个主要的哑基,.乙酰一.谷氨 酰磷酸还原酶和分子伴侣,为拟南芥交替型脱氢酶的 研究作了补充。 .利用免疫共沉淀技术.研究拟南芥脱氢活性复合体中各 亚皋之’的相互作用关系。抗体免疫共沉淀发现和可以得 到其纯化,但是在抗体免疫共沉淀和免疫共沉淀中只分别得到了 和,而没有被共沉淀。这些结果说明在这个类似交替型 脱氢酶复合体中,和之问有直接相互作用,而, 和的之间的相互作用还需要进一步验汪。 .在烟草瞬时达系统中进行串联亲和纯化实验。在烟草瞬时转染系统中, 。和.表达水甲理想,说明重组的真核表达载体中目的基 因没有发生任何突变,而且实现了和串联亲和纯化标签的融合表达。但是在 烟:草 瞬时表达系统中经过串联亲和纯化过程得到的.和.复合?蔺嘲虫害 兰州人学博学位论文 体在.中显示出显著的非特异性条带,这说明炯草瞬时表达系统/适 合用来进行外源性蛋白复合体及外源性蛋白质.蛋白质相互作用关系的研 究。 .在拟南芥稳定表达系统中进行串联亲和纯化实验,体内分析, 和之间的相互作用关系。.的转基因拟南芥全蛋白经过 纯化,.分离和.检测,以.为阴性对照,在 .复合体中检测到了的存在,但是未检测到;在 纯化,.分离和 .的转基因拟南芥全蛋白经过 .检测,在.复合体中未检测到的存在,同时通过 .阴性对照的对比,证实与的结合为非特异性结合,两 者之问没有特异性相互作用。 以上研究结果表明,在拟南芥线粒体可溶性部分中分离得到的具有交替型 脱氢酶活性的复合体中,作为复合体亚基,和亚基之间 存在特异性相互作用,它们结合在一起,存在于一个复合体中。这是首次揭示 他 们之间的相互作用。我们推测可能协助进入线粒体后正确折叠,此 外,他们之、只的相互作用很可能与的独特功能,例如作为交臂型 脱氢酶在植物的产热作用,抵抗逆境,减少活性氧生成,调节细胞内氧化还原 状 念平衡中的鼋要作用相关,或者保护在逆境胁迫下的活性不受影匈,参与 了植物对逆境胁迫的应答。 关键词:拟南芥,线粒体,交管性脱氧酶,拟南芥转基冈,蛋白质复 合体,蛋白质相互作用◎麓嘲虫害 兰州人学博:学位论文, . . ,. ., , , ,. ,., ., . . . ? , ,丫一? , . , ??. ?, . . ,◎麓婀虫害 兰州人学博十学位论文 / .? , . ,,? .. . ?. , ?,, ?. . . , . . , , ,,. ,, : , , ,? ◎蔺嘶虫害 兰州人学博十学位论文 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文全称 ? 支链.酮酸脱氢酶复合体钙凋素结合多肽部分. 免疫共沉淀乙二醇二乙醚二胺四乙酸 电子传递链 异丙基...硫代半乳糖苷 ? 【酮戊二酸脱氢酶复合体 【硫辛酰胺脱氢酶线粒体丙酮酸脱氢酶复合体 一乙酰.谷氨酰磷酸还原酶 ??氧化磷酸化作用 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 蛋白 质体丙酮酸脱氢酶复合体 十二烷基磺酸钠 串联亲和纯化 烟草蚀刻病毒 原创性声明 本人郑重声明:本人所呈交的学位论文,是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或末发表的 成果、数据、观点等,均己明确注明出处。除文中已经注明引用的内 容外,不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对 本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式 标明。 本声明的法律责任由本人承担。 日 期:鲨上. 型 论文作者签名:垒塑旦关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的,同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版,允许论文被 查阅和借阅;本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索,可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时, 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名:毪塑曲师签名:魈日期:地墨边?蔺哪矢孥 型人学博十学位论文 第一章研究背景及立题依据 .线粒体概述 生命的基本单位是细胞,而线粒体的主要功能就是进行氧化磷酸化,合成 ,为细胞生命活动提供卣接能量 .,因此在人们对细胞活 动的探究和理解中,线粒体占据了中心位置。从一开始对线粒体的研究不仅 揭示 了详细资料,并且涵盖了从生物物理学到细胞生物学和遗传学等研究领域的 基础 而重要的理解。线粒体在疾病中的作用已经被阐明。尤其足在神经退行性疾 病, 包括帕余森氏症’ 、阿尔兹海默症’ 、肌 萎缩性侧索硬化症 和亨廷顿症’ 等,线粒体功能障碍,能黾代谢异常,已成为共识的早期病理现象 。这些正同益受到人们的关注,成为相当热门的研究领域。 .线粒体的功能合成供给能量 线粒体是细胞氧化的重要部位,足糖类,脂肪,氨基酸最终氧化释能的场所, 是产生的主要场所。细胞,上命活动所需的能量约有%来自线粒体,其功 能障碍叮影响心肌、骨骼肌、肝脏等细胞的功能 。维持钙稳念 除了合成外,线粒体可以利用呼吸代谢产生的电化学梯度,通过膜上 协同转运体将钙摄入基质。线粒体具有两条摄取途径:?。单向转运体; ?快速模式;叫条释放途径:?依赖性释放途径;?不依赖性释放途径; ?线粒体通透性转换孔;?单项转运体逆向转运 .。线粒 体通过对的摄取和释放来调节钙离子的动态平衡,维持钙稳态,参与细』地? 蔺嘲虫害 兰州人学博十学位论文 内许多相关的生理活动,如细胞信号转导。细胞凋亡调控 有研究表明在仓鼠成纤维细胞凋亡的早期阶段能观察到线粒体的降解 .,后来又有报道凋亡受到线粒体和核相互作 用的双重调控,产生凋亡效应 。线粒体膜问腔的许多蛋白都有 潜在危害,当线粒体渗透性发生变化或外膜破裂,这些蛋白就会释放到胞浆 内, 诱导细胞凋亡。此外,线粒体还能够汇聚多种凋亡信号,然后将这些信号放 大, .。因此, 释放出膜间腔内的凋亡蛋白调节物,最终导致细胞凋亡 线粒体对细胞凋亡有着重要的调摔作用。 除此以外,线粒体还与细胞中氧自由基的生成有关。线粒体既是自由基的攻 击靶点,也是自由基产生的源头。细胞内%以上的活性氧来自线粒体氧化磷 酸化作用,是电子传递的副产物。 ..电子传递与氧化磷酸化 需氧细胞内糖、脂肪、氨基酸等通过各自的分解途径被氧化分解,在这个分 解途径中生成的还原性辅酶,包括和,通过电子传递途径被重新 氧化。在这个过程中还原性辅酶上的氢以质了形式脱下,其电子沿着一系列 的电 子传递体转移,最后转移到分子氧,质子和离子型氧结合生成水,在电了传递过 程中释放出来的能量则使和无机磷结合生成。 ..电子传递链 电子传递链 ,在真核细胞中位丁线粒体的内膜, 是典型的多酶氧化还原体系,有多个组分组成。参加呼吸链的氧化还原酶仃:? 以或为辅酶的烟酰胺脱氧酶类;?以黄素单核苷酸或黄素腺 嘌呤二核苷酸为辅基的黄素脱氢酶类;?铁硫蛋白类,通过铁的化合价的 互变进行电子传递;?辅酶类,是一种脂溶性的醌类化合物,具有三种彳同 的氧化还原状态,即氧化念,还原念和介于两者之间的半醌;?细胞◎蔺嘲虫雾 型人学博:学僦仑文 色素类,是一类以铁卟啉为辅基的色蛋白,主要功能是通过铁的化合价的互变传 递电子。等人首先将呼吸链拆成四种功能复合物~。复合物是 .还原酶,又称为脱氧酶。它是呼吸链中最大最复杂的酶复合 物,其作用是催化的两个电子传给辅酶,同时发生质子的跨膜运输, 因此复合体既是电子传递体又是质子移位体。复合物是琥珀酸.还原酶 琥珀酸脱氢酶,其作用是催化电子从琥珀酸通过和铁硫蛋白传给辅酶, 它不能使质子跨膜移位。复合物是.细胞色素还原酶,能够催化电子从 辅酶传给细胞色素,同时发生质子的跨膜输送,所以复合物还是质子移 位体。复合物使细胞色素氧化酶,催化电子从细胞色素传给氧,同时发生 质子跨膜输送,因此复合物既是电子传递体又是质子移位体。 ..氧化磷酸化 电子传递和形成的偶联机制称为氧化磷酸化作用 ,。氧化磷酸化作用是电子在沿着电子传递链传递过程中所 伴随的将磷酸化成的全过程。电子传递和的生成住正常细胞内总 是州偶联的,的生成必须以电子传递为前提,而呼吸链只有生成/‘能 推动电子的传递。氧化磷酸化的偶联机制一直是研究氧化磷酸化作用的关键, 主 要有三种假况都试图揭示其机理问题。这三种假说分别为:化学偶联假说 ,结构偶联假说 ,化学渗透假说 。化学渗透假说 由英网牛物化学家提,他认为电子传递的结果是将离子从线 粒体内膜基质泵罕膜隙,由于膜对离子是不通透的,从而使膜隙的 离子浓度高于基质,因而在内膜两侧形成电化学质子梯度。这个梯度中含自 ‘的渗透能 或者叫做质子动力势 和合成。这一假说很好地说明了线粒体内膜中,电子传递,电化学 质子梯度和合成的关系。这一假说得到了人量的实验支持,因此获得了 年诺贝尔化学奖。◎掬嘲矢害 型人学博十学位论文 .植物线粒体中交替型脱氢酶 植物线粒体电子传递链能够高度适应性的氧化胞质和基质中的, 对植物线粒体的生化研究指出他们在许多方面具有显著特点,比如除了在许多组 织中广泛存在的电子传递链外,植物还能通过不同的脱氢酶氧化和 . ; ; :; ; .; 。 植物线粒体是由两层单位膜套叠而成的封的囊状结构,主要由四部分组成:外 × 膜含有相对较少的蛋白,其上的孔蛋白容许分子量小于 的小分子物质自 由穿过,包括;内膜对物质的通透性很低,它含有许多蛋白包括对底 物,离子和大分子物质的特异性转运蛋白,以及大部分的电子传递链组分:位于 内外膜之间封闭的腔隙被称为膜间隙;被内膜所包围的基外空问称为基质,含有 . 三羧酸循环和氨基酸代谢的酶类。和可以自由通过外膜 ,但足不能穿过内膜 。因此位于基质和与细胞质相通的膜’白隙中的库和库在功能上足不同的。 .交替型脱氢酶 植物线粒体内膜中的电子传递链与动物线粒体有着相同的基本特点。电子传 递链上的复合体,也就是鱼滕酮敏感性脱氢酶的作用是将电子传递给电 子传递链一卜的泛醌库,泛醌又接着被复合体和复合体氧化。电子经过质子 泵复合体,,导致一个跨内膜的质子电化学梯度的形成。然而在植物线粒 体中还存在一种独特的交替型脱氢途径。这种交管型脱氢途径由一类 交替型脱氢酶催化,这种交替型脱氧酶的催化特性类似于复合体, 能够催化电子沿电子传递链向下游传递最终交给氰,但是彳伴随质子的跨膜 转 运,因此不产生质子跨膜梯度和,是一个非磷酸化催化过程。同时这类交替 型脱氧酶不能被复合体的特片性抑制剂鱼滕酮所抑制,凶此又被称为鱼藤荆 非 敏感性脱氢酶。 ◎蔺哪虫孥 刿人学博:学何论文 交替型脱氢酶町以分为两类,以线粒体内膜为界限,分为催化内 膜屏障以外的 脱氢酶和催化内膜以内的 脱氧酶 。 早期的研究发现与哺乳动物线粒体不同,植物线粒体能够氧化外部添加 的; ; .。对从绿豆下胚轴 中分离出来的完整线粒体氧化外源的研究表明在线粒体内膜以外有两种 脱氢酶 .。其中之一定位在外膜上,能够特异性的利用 的一氢,但是不能氧化。光谱学分析表明这种活性与外膜紧密结合,并且包含 有一种黄素蛋白和型细胞色素 .; 。同时还观察剑在线粒体裂解中有一种可溶性的脱氢酶活性 .,定位于内膜外表面,这种活性对的.氢有特异性。 推测这种交替型脱氢酶介导了外源的氧化。对它的光谱学分析证 明它同样含有一种黄素蛋白。 对植物线粒体氧化外源性的研究说明氧化反应的最适在左右, 能够被抑制,同时还能被复合体和复合体的抑制荆抗霉素和氰 . ; 和 化物所抑制 。这与 脱氢酶把电子传递给泛醌足一致的。后来有研究表明依赖于外 . 源性的氧的摄取能够被二价阳离子 ; 特别是钙离子激发。 脱氢酶活性对钙有很高的亲和力 。 外源性的氧化在红甜菜根中得到了广泛的研究。新鲜组织中的线粒 体不能氧化外源添加的 .。然而当把根切片并且与稀释的 硫酸钙溶液孵育时,氧化外源的活性就会受到诱导 .;。已经证明了这种诱导 系统能够很好的表现外源氧化的 特征。此外,在低温下储存得到的红甜菜根也能诱导外源氧化 .。 .◎蔺嘲虫孥 到人学博:学何沦文 外源的氧化与外源的氧化有诸多相似性。在玉米黄化苗的 线粒体中,外源的氧化能够被钙激发。同时利用电子传递链的抑制剂证明了电子从传到了泛醌 ;; 。但是在马铃薯块茎的线粒体中发现,的 氧化在一些重要方面不同于的氧化。外源的氧化需要较高的 环境,而氧化需要的较低一些。并且的氧化对的抑制作用更为敏感,还能被一些毓基试剂特异性的抑制 。 这些结果说明外源的和被不同的蛋白酶氧化。这种马铃薯中的差异同样出现在其他的物种和组织中 .; .;; 。对最适的比较也说明不止 一种蛋白质参与了外源性的氧化,这些蛋角酶包括最适为中性的 氧化的特异性酶和最适值在附近的既可以氧化又可以氧化 脱氧酶比 脱氢 的蛋自酶。值得注意的是 . : 酶更易受到的抑制,并且对钙有更多的依赖件 .。 对业线粒体颗粒中氧化的动力学分析证明在植物线粒体中除了复合 体还存在一类面向基质的鱼滕酮非敏感性的脱氧酶,但是这类酶对的亲和力 要比复合体低十倍 。现在认为植物线 粒体中除了复合体还存在两种非质子泉型的 脱氧酶。根据抑 ?特征,发现交替型 脱氢酶能 制剂敏感度,钙激发和值的/ 够被钙激发 并且被普通的黄素蛋白抑制剂抑 . . 脱氢酶的活性不 ; 。而交替型 制 受钙和的影响。这些结果证明,两种交替型 脱氡酶中,一 种是特异性的,另一种是特异性的,但也可能对有作用。 ◎掬咐虫害 型人学博卜学僦仑文 .交替型脱氧酶纯化进展 早先的研究证明外部的交替型 脱氢酶松散的结合在线粒 体内膜的外表面上,当线粒体破裂时释放出来 .,这就为从裂 解线粒体的可溶型蛋白组分中纯化脱氢酶蛋白奠定了基础。已经从不同种类 的植 物线粒体可溶部分中纯化出一些脱氢酶。 随着快速蛋白液相层析技术的发展,许多研究小组致力于纯化有着交替型 脱氧酶活性的蛋白。在甜菜和玉米中,一个定位于内膜外表面或者膜 间隙的的能够氧化的蛋白质得到纯化 .; . 这个蛋白可以高速地还原醌类,其活性不能被钙激发,能够被双香 豆素,巯基试剂对氯汞苯甲酸和汞撒利严格抑制。从红甜菜根中纯化出一 个.: 的蛋 ,这蛋白同时具有和 脱氢酶两种活性,能够高速还原醌类,对双豆香素比划‘氯汞苯甲酸更 为敏感。这个蛋白定位在内膜内表面,因此,它可能是一种鱼藤刚非敏感型的 脱氢酶。同样,在马铃薯的线粒体巾也发现了一种类似的 的蛋白 。从红甜菜根和玉米巾分离到一个的潜在的 脱氢酶。在红甜菜根巾,这个蛋白以二聚体形式出现,对有特异性,它们的活 性被对氯汞苯甲酸和汞撒利抑制 .;玉 .; 米中,这个蛋白质既可以氧化又可以氧化,并具有相似的抑制特 性。这种蛋白酶可能是 脱氢酶的候选者。另外,还从红甜菜根线 粒体中分离到一种的蛋白 .,具有潜在的 脱氢酶活性,它能够氧化和,并且其活性状态可能是三聚体或 者,聚体形式。比较玉米黄化幼苗茎,小麦黄化幼苗根和老化的甜菜根之后发 现, 可溶性的脱氢酶在一的种类中数量有变化 .,表现 出一种种特异性的表达水平。 在细菌和真菌的线粒体中有一种 脱氢酶,它们执行鱼滕酮非敏感型泛醌还 原酶的作用 ; ; 脱氢酶包括和复合体同时作用 。真菌线粒体中的 ◎两嘶虫害 兰州人学博:学位论文 或者单独作用的 脱氢酶 .和.. ; 脱氢酶 这些 脱 氢酶的特征是分子量在左右,含有黄素腺嘌呤二核苷酸 ,作为辅基。经过数据库筛查,发现拟南芥中含有七个核编码 脱氢酶以及蕃茄的, 阅读框与酵母和大肠杆菌的哆 有很高的相似度。这七个基因分属于三个基因家族:两个基凶,四 个基因,一个基因 .。拟南芥和 的氨摹酸序列与蕃茄的相似度达%,拟南芥和.的氨基 酸序列与蕃茄的序列有着相当高的相似度,分别达到%和.%。而 拟南芥的氨基酸序列与蕃茄和的氨基酸序列的千似度只有 . %,这说明拟南芥与和分属不同的家族 。对插入突变的拟南芥进行研究发现,从突变体提出的线粒 体在复合体的活性和与线粒体外膜相连的氧化同野生型比较没有差 . 别,但是 氧化降低了%,而 氧化却提高了.% .。体外的输入实验也表明拟 南芥穿过了线粒体内膜进入朝向基质的一面,分子量为。蛋白酶水 解实验则证明,定位于线粒体内膜内表面 .。这 些证据证明拟南芥是 脱氢酶。拟南芥的四种蛋白 . 是潜在的 脱氢酶,定位于线粒体内膜外表面 ,分子量为.,但是其中之一有可能是 脱氧酶, 它在钙的存在下氧化基质中的。拟南芥基因很有可能是通过叶绿 体基因组进入真核细胞,然后在转移进入细胞核 .。它和 ,一样,定位于线粒体内膜内表面 .,但是其功 能尚不清楚。细菌,真茼和植物的脱氢酶具有相同的功能域:端区 域很可能参与了线粒体定位和线粒体内的存储;两个核苷酸结合域可能参与 了黄 素腺嘌呤二核苷酸和的结合;端参与了线粒体膜的结合 . 。除了这些砸常的区域,植物的家族还含有一个 手性区 .,说明这个结构域可结合钙。目前还不知道为什 么在拟南芥中会存在如此之多的这些基凶的同系物,它们可能是最为一种组 彩特◎蔺嘶虫害 型队学博十学衔仑文 异性或者发育模式的亚型来表达,或者代表了一种基冈组的冗余水平。 .交替型脱氢酶的生理功能 尽管早已发现外源氧化的现象,但其生理作用仍然不是很清楚。 脱氧酶很可能调节细胞质中和库的还原水平 来作为对钙浓度变化的响应,继而影响初级碳代谢作用,氮同化过程, 依赖型的病原反应,生物合成途径以及胞内氧化还原穿梭 .; 。但是,体内是否存在这种调挖作用还不清楚,需要通过转基因或 者突变系统来验证。例如,拟南芥突变体中,基质氧化水平降 低,而 脱氢酶活性显著升高 .,这可能是一 种补偿机制,将基质未能氧化的部分通过节果酸/革酰乙酸穿梭机制输出 。在复合体突变体中, 脱氢酶活性也有相 似的提高 .,这些都说明这类脱氧酶在保持细胞内氧化还原 平衡的作用。一些与交将氧化酶作用相关的假说 ; 同样适用于交替型脱氢酶,例如产热 作用,氧化多余的碳水化合物,氧化多余的还原荆,抗寒,抵抗磷酸缺乏和避免 活性氧的牛成。然而这些假设都需要经过试验的进一步验证。植物经历的剧烈而 快速的环境变化会影响代谢作用,通过这些简单的交替型酶类表达模式的调节作 用对电子传递途径卜调或调可以有效的适应短期需求 。特异的 交粹型脱氧酶可以在不同的生理条件下表达并且同交替型氧化酶偶 联。 总之,植物交棒型脱氢酶各不相同的表达和活性能够极富弹性的 凋节胞质和线粒体綦质中库的氧化还原状态,而植物也的确需要氰化 多余的,同时又不伴随的生成。 ?蔺哪虫雾 纠从学博:学位沦文 .植物线粒体硫辛酰胺脱氢酶 . /.酮酸脱氢酶复合体 植物细胞的重要特征之一就是它们含有四种.酮酸脱氢酶复合体,分别是 质体丙酮酸脱氢酶复合体,,线 粒体丙酮酸脱氢酶复合体, ,一酮戊二酸脱氢酶复合体【 , 和支链【一酮酸脱氧酶复合体. ? , .。这四类多酶复合体由不同拷贝数的三 . 种蛋白构成, 是.酮酸脱氢酶/脱羧酶 /,是二氢硫辛酸酰基转移酶 ,是硫辛酰胺脱氢酶 ,,也叫做 二氢硫辛酸脱氢酶 。这四类【一酮酸脱氢酶复合体在 中问代谢中有着关键地位。 丙酮酸脱氧酶复合体和.酮戊二酸脱氢酶复合体 控 制着三羧酸循环中的碳流通。在拟南芥叶片衰老和胁迫诱导的糖饥饿中,支 链氨 基酸发牛降解,这时支链仅.酮酸脱氢酶复合体成为一种重要的交替犁碳源 .。 .线粒体丙酮酸脱氢酶复合体的活性调:青 产物抑制和代谢物效应对线粒体丙酮酸脱氢酶复合体活性的调了已有报 道.; .; .。豌豆线粒体内删酸脱 . 线粒体 氢酶复合体的活性还丁以通过控制发育表达米实现 丙刚酸脱氢酶复合体在白化植物中以及光照生长植物的幼叶中的活性最高,随 着叶片的成熟活性逐渐降低,在衰老的叶片中几乎完全消失。这种活性变化与 .酬酸脱氢酶/脱羧酶和二氢硫辛酸酰基转移酶的和蛋白质的量有关 . 。但足硫辛酰胺脱氢酶的表达模式却小随着.酮酸脱氢酶/ 脱羧酶和二氢硫辛酸酰基转移酶的表达模式的变化而变化 .。 大量的植物种类存发育的早期阶段表现出最高的线粒体丙酬酸脱氢酶复合体活 ◎ 蔺婀虫害 型人学博十学位论文 . . 性 ; ; ; .,这可能反应了在膜的扩张中发生了结构和生化方面的变 化。 丙酮酸脱氢酶复合体的结构 已有研究报道了丙酮酸脱氢酶复合体的结构组成。在哺乳动物中,丙酮酸脱 氢酶复合体足一个十二面体结构,六十个二氢硫辛酸酰基转移酶作为核心单位, 和 和六个硫辛酰胺脱氧酶同源 被三十个.酬酸脱氢酶异源二聚体 二聚体包围 。酵母 .、哺乳动物 .;. . 和线虫 的丙酮 ; 酸脱氧酶复合体还含有一个结合蛋白,这个蛋白足一个多结构域蛋白,从氮 端到碳端依次是硫辛酰结构域,硫辛酰胺脱氢酶结合结构域以及一个内核结 构域. .,对丙酬酸脱氢酶复合体的稳定性有重要作用 ; .。尚无重要证据表明植物丙酮酸脱氧酶复合体也含有一个 结合蛋白,而且在基冈组测序中也没有克隆到或者鉴定出结合蛋白。许多 植物巾都含有两种类型的二氯硫辛酸酰基转移酶,一类有一个硫辛酰结构域, 而. .和马铃薯 另一类含有两个硫辛酰结构域。豌豆 的线粒体丙酮酸脱氢酶复合体同时含有这两干叶类型的二氢硫辛酸酰基转 . 移酶,拟南芥含有一种双硫辛酸结构域的二氧硫辛酸酰基转移酶 ,但是在完整基因组测序中还发现了译硫辛酸结构域的二氢硫辛酸酰基转 移酶 .。当出现两种类型的时,~种能够作为结合蛋白起作 用。通过对比拟南芥和玉米二氢硫辛酸酰基转移酶的两种类型后发现巾硫辛 酸结 构域和双硫辛酸结构域的二氢硫辛酸酰基转移酶在亚基结合部位存在差异 .,这种差异可能反应了两种二氢硫辛酸酰基转移酶的不同功 能:一种用来结合.酮酸脱氧酶,而另一种则作为结合蛋白起作用。?蔺孵虫 害 型人学博十学位论文 .植物线粒体硫辛酰胺脱氧酶的特性 硫辛酰胺脱氢酶不仅是丙酮酸脱氢酶复合体,一酮戊二酸脱氢晦复合体和支 链一酮酸脱氧酶复合体的成分之一,还参与了甘氨酸脱氢酶复合体的构成 。在这些复合体中,硫辛酰胺脱氧酶氧化或者甘氨酸脱氢酶复合 体中蛋白上共价结合的硫辛酰胺辅酶。作为一类黄素蛋白二硫化物氧化还原 酶,硫辛酰胺脱氢酶同型二聚体利用作为辅酶,以作为最终的电子 受体。所有这些多酶复合体都存在于线粒体中丙酮酸脱氢酶还存在于质体 中, 硫辛酰胺脱氢酶在这些复合体中执同的功能。 在碗豆括 线粒体中只有一种硫辛酰胺脱氧酶,由单拷贝基因.; 编码 .。最近通过质潜证明相同的硫辛 酰胺脱氢酶同时参与了甘氨酸脱氢酶复合体和丙酮酸脱氢酶复合体 .。拟南芥有两个基因编码两种线粒体硫辛酰胺脱氢酶,长 初 ., 长一,分别位于号染色体和号染色体。它们都 含有一个的编码区,相似度达%,在’非翻区的相似度只有%,这 两个分别含有两个内含子,第一一个内含子的槲似度足%,第二个内含 子的相似度为%。 蛋白质含有个氨基酸,理论分子量为, ,蛋白 质也同样含有个氨基酸,理论分子量为, ,这两个蛋门的氨基酸序这两个蛋 白质的氨基酸序列 列相似度为% 同豌豆,人类,酵母和大肠杆菌的硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的相似度分别为%, %,%,%。拟南芥的两种线粒体硫辛酰胺脱氧酶含有这类蛋白所有的标 志性保守结构域,它们的第?位氨基酸是结合结构域,用来结合烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸,第?位氨基酸是结合结构域,第? 位氨基酸形成界面区,用来构成二聚体。豌豆线粒体内酬酸脱氢酶有个氨基 酸长度的线粒体靶向序列,和两个拟南芥的靶向序列相似度达到%。蔺晰虫害 型人学博十学位论文 这蕊种拟南芥线粒体硫辛酰股脱氧酶和有着不同的在叶片中 表达模式 。与相比, 的表达更为强烈,而聊圮肋 在根中的表达则比强烈。在其他的 器官中,比如茎,花蕾,花,果荚中,这两种所儿基因有着相同的表 达水平。当把拟南芥置于完全黑暗或连续光照条件下培养一周,然后再置于 连续 光照或完全黑暗的条件下培养后发现,当把植物转移到黑暗环境下时, 的水平迅速下降,当把植物转移到光照条件下时,的水 平迅速上升,相比较而言,的水平随着光照条件的不同只发生了 轻微的变化,这说明的水平受光的诱导,具有光依赖性。 的表达类似于.酮酸复合体中的其他亚基的表达。的 在根中比叶中的表达水平高,这种表达模式在线粒体丙酮酸脱氧酶复合体 的.。在叶中呈现高水平 中也可以见剑 .; 表达,并且光对基冈转录有很强的诱导作用,这种表达模式与甘氨酸脱羧酶 复合 体中的蛋白和蛋白的表达模式非常相似 ; . . . . . ; ; ; ; 。这可能暗示主要与甘氨酸脱羧酶相关,而主要构成【. 酮酸脱氢酶复合体的组分。但是敲除的突变体仍然表现出正 常的生长发育,不同器官的重量和发育时并没有明显的不同 。但是硫辛酰胺脱氢酶的活性在幼根中只有野生型的%,在较成 熟的根中是野生型的%。这些说明,在不同的发育阶段,这两种酶的哑型对硫 辛酰胺脱氢酶活性的贡献可能不同,在较成熟的根中,的活性要高于在 幼根中的活性,但是具有高相似度的两种线粒体硫辛酰胺脱氧酶并没有严格 的区 别,表达水平更高的可以补偿的缺乏,参与线粒体中酶的反应。 .蛋白质复合体的纯化及相互作用的鉴定?蔺婀虫害 兰州人学博,学位论文 .蛋白质复合体 人类基因组测序的完成标志着一个新的生物学研究时代??后基因组时代 ? 的来临。在后基因组时代,对蛋白质的研究又成为焦点。科学 家已经意识到仅仅全基因组序列信息还不足以解释和预测细胞内的现象,因为足 蛋白质才是绝大多数细胞活性的执行者和控制者。在特定的细胞中,选择性剪接 和翻译后修饰产生了大量不同的蛋自质。这就可以解释在基因总数上没有较大差 别的进化关系较远的种类之间的诸多不同。生物体内各种生命信息由不同的基因 经转录、翻译传递到相应的蛋白质上并使其具有各自的生化特性及生物学活性: 但每个蛋白质并不是独立的在细胞中完成被赋予的功能,它们通常是在特定的时 间和空间内彼此相互作用形成一个较大的复合体,这些多蛋白复合体提供了一个 重要的组织水平 。一方面,在一个蛋白质复合体中,任一个单个 的蛋白质都有特定的功能参与到蛋白质复合体的整体功能中。另一方面,这 种特 定的功能可能来自于与周围蛋白质的相互作用,而这种相互作用可能通过构象改 变或者翻译后修饰米调节蛋白质活性。蛋白质复合体的显著例子就是核糖体 ,剪接体和核孔复合体 。蛋 白质复合体研究的优势是将功能未知蛋白置于一个功能性环境中,这个环境由其 它的已知功能的柏瓦作用蛋白构成。甚至在分析功能已知蛋白质时,通过对 的分子环境研究,可以揭示这些蛋白质的新功能。蛋白质通常参与到多个蛋白质 复合体中,或者参与不同的业细胞结构中复合体的形成,这就可以理解看起来无 关的胞内活动之’只的交叉联系。通过大规模功能性蛋白组工程为蛋白质和蛋白质 复合体建立全面相互作用关系网络能够很好的揭示细胞内进行的功能性连结。在 中进行的大舰模基因组范嘲的蛋白质复合体分 酵母 析,揭示了数干种蛋白质相互作用,拙述了一个综合的例状系统,为蛋白质在细胞内的功能性组织提供了深入的理解 .; .; .。 .; ? 蔺卿虫害 兰州人学博十学衔仑文 .蛋白质复合体串联亲和纯化方法 通常在源材料中,目的蛋白只占总蛋白的极小部分,在某个细胞或者某种组 织中,有,多种不同的基因同时表达,因此蛋白水平的多样性很高。除了 蛋白质初级序列的多样性和各种水平的修饰以外,单个蛋白表达水平的动态范围 更会增加蛋白质一蛋白质相互作用和蛋白质复合体分析的复杂性。一部分蛋白在 每个细胞中呈现数千个拷贝,而另一部分蛋白只有少数几个拷贝。在蛋白质组范 围研究蛋白质复合体时,蛋白质复合体的纯化方法要满足一系列重要的条件:首 先,最重要的是纯化方法必须在辨别非特异性蛋白背景的同时仍然保留蛋白质复 合体的主要成分。其次,这种方法必须是通用的。当所有的诱饵蛋白都足在相同 的条件下被处理时,才能产生具有重复性和可比性的结果。如果能够达到一个理 想的重复性水平,通过这种方法建立的大型数据库就可以用来查找信息,而这些 信息不一定是由单个实验来提供,因此提高了对研究对象的整体洞察力。 ..串联亲和纯化方法的特点 最近发展出一种串联亲和纯化方法 ,.; .,该方法可以满足以上提到的。串联亲和纯化 方法的基础理念同 方法相似,主要的区别就是串联亲和纯化方法 相继利用了两个亲和标签图, .。该方法包括将标签融合 到目的蛋白上,然后将这个结构转化到宿主细胞或生物体中。带有标签的 融合蚩白在绌胞内表达并和内源相互作用蛋白构成蛋白质复合体。细胞裂解 后, 部分和固 这个蛋白质复合体从细胞中释放出来,借助标签中 定在琼脂糖上的免疫球蛋白之’的相互作用得到初步纯化。为了除去与 非特异性结合的蛋白,利用烟草蚀刻病毒 ,蛋白 酶切除 上释放出来。 标签,使含有融合蛋白的蛋白质复合体从 随后蛋白质复合体利用标签中的钙调素结合多肽部分 ,通过钙调素偶联的亲和层析往进行第二次纯化。这步纯化移除了 蛋白酶和可能出现的污染物。加入螫合剂后,钙调素结合多肽与层 析柱分离,使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化图, .。纯化 的复合体经一聚人烯酰胺凝胶电泳后,复合体中的各个组分被分不,随后切 囝两一大掌 ’?州人学甫十学位论文 胶.胰酶消化,通过质谱咎定复合物中各个蛋白质组份,确定他们之间的相互作 用关系。 这种方法的显著优点是。能够高效的减少非特芹性蛋白引起的背景,从而大 幅度降低了样品的复杂度,这个特减少了对蛋白质相瓦作用伙伴的验证需求: 蚩白质复台体的纯化在接近生理条件下完成.避免了高枯和高去垢剂等剧烈条 什导致的结台蚩白的丢失:因为串联亲和纯化方法的逝用忡,对十小同的诱饵 蛋白沫说,山它得到的结果具有?叮重复性和可比性,因此这个方法既可以辟术进 行小规模的研究样也可以进行大舰模研究。墨墨墨卫墨?亡耍臣互 \ ’罔 , 端和端串联亲平纯化标毓, ??胡坩虫掌 ’?州凡’?博十学付论文 ?? ? ?参??一参 幽半联亲和纯化方法分离纯化蛋白质复合体的过程示意罔 ,。 第一步,结合有融合目的蛋白的蛋质复合体通过标签中的部分与 上洗脱下米。 紧密结合。然后通过’蛋白酶的酶切作用从 第一步,第步纯化步骤中得到的沈脱部分,在钙的存在下与崮定的钙渊素孵 阿。 通过 上踪残余的蛋白酶和其他杂质。最后通过加入,得 到纯化的蛋自质复合体。 , ,, ,串联亲和纯化浊的麻用 串联亲和纯化方法在各种细胞和组织中都得到了泛的心用。首先在酵母中 取得了长足的发展,等采用结合质谱技术.对酵母中的蚩白质复合体 进行了人规模的研究,分析了】个牡因,纯化出个蛋白质,鉴定出个小刚的蛋 山质::台体,为个蛋白质揭 新的功能 。就◎ 蔺嘲虫害 刭’人学博十学位论文 他的研究小组也利用串联亲和纯化对酵母进行大规模的蛋白质复合体分 析.; .。这些研究结果勾勒出了真核生物中二元以上的蛋 . 白质相互作用网络。串联亲和纯化在果蝇中也得到了很好的应用 ; .。等人成功的将技术和串联亲和纯化联用,在 果蝇细胞中研究蛋白质相互作用 .。该方法利用抑制了相 应的内源蛋白的表达,从而避免了在蛋白质复合体形成中内源蛋白的竞争, 提高 了标记蛋白组装进入蛋白质复合体的机会。实验证明蛋白质复合体纯化的效率和 产量得到了有效的提高。串联亲和纯化技术不光在许多植物瞬时表达系统中发挥 作用 .; .; .,也同样在稳定表达的拟 南芥中进行蛋白质相互作用的研究,等用该方法研究了蛋白质复合 体 .。这项研究将同的基冈置于强启动子下,使融合蛋白 超量表达,从而使标记蛋白在内源性蛋白无法消除的情况下提高同其他相互作用 蛋白的结合效率。除了对整个植物体的研究之外,此方法还适于愈伤组织和悬浮细胞的细胞周期柏关蛋白质复合体的研究 .。串联亲和纯化. 方法还被用来研究大肠杆菌蛋白质相互作用 .;; .; .。此外,该方法 .; 还被广泛应用于哺乳动物细胞,揭示了许多蛋白质复合体和蛋白质的新功能 . .; .; .;. ; .; ; .;.; ; .。 .立题依据 线粒体的主要功能就足进行氧化磷酸化,合成,为细胞牛命活动提供直 接能量。电子在线粒体内膜电子传递链上逐级向下传递,先后经过质子传递 体, ,,形成一个跨膜的质.了梯度。这个质子梯度驱动了跨膜的传递过程,通过 线粒体合成酶生成。这种电子传递和合成偶联的过程在植物线粒 体和动物线粒体中有着共同的特点。对植物线粒体的生化研究指出除了电子 传递 链以外,植物还含有不同的交粹型脱氢酶,这种交皆型脱 氢酶催化交替脱氢途径,其催化特性类似于线粒体电了传递链复合体,即鱼 藤◎掬哪虫雾 兰州人学博:学位论文 酮敏感性脱氧酶,能够将电子传递给下游传递体最终传递给氧,但是这 种电子传递并不伴随跨膜质子梯度的形成和合成,其活性也不受鱼藤酮的 抑制,是一种鱼藤酮非敏感性脱氢酶。对植物线粒体交替型 脱氢酶的大量研究发现,根据催化对象的不同定位,将这类交替型 脱氢酶分为两类: 脱氢 脱氢酶和 酶。外源性的和被不同的 脱氢酶氧化,与 脱氢酶相比, 脱氢酶的最适值较低,其活性 对钙的依赖性更强,同时也更容易受到的抑制。 脱氢酶 脱氢酶活性不受钙和黄素蛋白抑制剂 根据其特异性也分为两种, 的影响,而 脱氧酶却相反。 交替型脱氢 酶能够响应钙的浓度变化,调节细胞质中的还原水平,进而影响初级 碳代谢作用和氮同化过程。 交替型脱氧酶凋节线粒体基质中的 氧化还原水平。这种交脊型途径介导了的氧化,但是不伴随 的产生,能量以热量形式释放,这些特点可能与植物的产热作用,抵抗逆境, 减少活性氧生成,调节细胞内氧化还原状念的平衡密切相关。 蛋白质在细胞中通常足与相互作用蛋白形成复合体来执行特定的功能,某些 蛋白质还参与了多个蛋白质复合体的形成,行使多种功能。凶此在蛋白质复 合体 层匝的研究,对于未知功能蛋白可以揭示其特定的功能或?叮能的,而对于功 能已知蛋白,复合体水平的研究可能会为阐明新的功能,以及理解相互作用 关系 对蛋白质功能的调节作用提供机会。 本研究以模式植物拟南芥为研究对象,利用活性电泳为技术手段,从拟南芥 线粒体可溶性部分中分离到一种具有交替型脱氢酶活性的复合体,并 从蛋白质复合体的层面进行研究,利用免疫共沉淀技术分析复合体各亚基之 问的 相互作用关系,同时利用串联亲和纯化方法在体内分离纯化了这种复合体, 并鉴 定复合体中相互作用蛋白。以期在蛋白质复合体水平上对复合体中各蛋白质 的功 能研究做出补充,为交替型脱氢酶在植物的产热作用,抵抗逆境,减 少活性氧生成,调节细胞内氧化还原状念平衡中的作用提供重要线索。 ◎蔫婀虫害 兰:.队学博学僦仑文 第二章材料与方法 .实验材料 .材料类型 拟南芥即野生型生念型被用作悬浮细胞培养 和转基因的背景材料。 .实验材料培养 固体培养基培养拟南芥野生型植株: 拟南芥野生型成熟种子用%次氯酸钠处理.灭菌。灭菌 处理后的种子在?下春化处理?后,点播于含%蔗糖,.%琼脂的固 体培养基上,于土?的光照条件培养光照强度:。~,光照周期: 光照/黑暗。 固体培养基培养转基因拟南芥植株: 拟南芥转基因型成熟种子用%乙醇和.%升汞处理. 灭菌。灭菌处理后的种子在下春化处理.后,点播于含%蔗糖,.%琼 直体培养基上,于士?的光照条件下培养光照 脂,肛/庆大霉素的 强度:‘~,光照周期:光照/黑暗。培养约两周的材料用于蛋白 质相互作用分析。 土壤培养拟南芥植株: 土壤培养拟南芥植株参考陈敏等的方法陈敏,白书农。 拟南芥野生型细胞培养: 拟南芥野生型愈伤组织诱导和悬浮培养参考方法 ?蔺哪虫害 兰州人学博十学何论文。 .实验方法 .蛋白质复合体的分离 ..线粒体纯化 线粒体纯化参考等人的方法 .,采用差速离心和 密度梯度离心。 ..活性胶分离复合体 活性胶分离复合体主要依赖其四哗催化反应活性 .终浓度 。纯化线粒体:悬浮于少量呼吸缓冲液,加入 为.%置于冰上 ,间歇轻柔震荡。,下离心,一卜清即为线 粒体裂解液,用作活性分离 。电泳之后将凝胶浸泡在活性染色液中显色 , 特异性染色条带位置切胶回收, 置于截流分子量的透析袋中,施加电流,进行电沈脱,沈脱液 即为分离复合体。 .免疫芡沉淀检测,和之的相互作用 将纯化兔抗,和的与溴化氢活化的 ., , 凝胶颗粒偶联。纯化线粒体在样品裂解液.%一/, / , / , ,收集上清液,加入 下裂解,、歇轻柔震荡,然后,下离心 兔即空白兔血清标记的 孵育下离心,取上清, 孵育,,,然后 分别与,和抗体标记的 , 将 装柱,用倍体积的裂解液洗涤,然后用甘。氨酸 .沈脱,沈脱液用 .,然后用作.检测。 中和至◎蔺哪虫雾 兰州人学博十学位论文 .目的基因区全长克隆 ..目的基因全长扩增 目的基因全长通过反应获得。用拟南芥野生型愈 伤组织提取总反转录后得到的,聚合酶采用高保真,,所用引物如下表所示, 反应程序采用 程序,每个循环退火温度降低.度,共降低.个循环,然后诈 常扩增个循环。 表.目的基因伞长扩增引物序列 程序结束后,每管产物加入. , ?, ,完成加尾步骤。所有目的基因的引物序列均为 ,. 各个目的皋囚的原序列。 .. 回收产物与载体连接 分别将包含有同的基冈,,的全长的回收片段与 ,连接,反应体系为: .“, ./. /,匣收产物“, , .。反应条件:。,过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞, ?蔺婀虫害 兰州人学博十学位论文 。过夜培养,经蓝白斑筛选后挑选单个白斑菌落,。液体摇培小时,经菌 液鉴定后送出测序。测序结果与已知序列吻合,保存甘油管,分别命名为 ?,’,并用 ?提质粒备用,具体步骤按说明 书操作。 . ,原核表达与抗体纯化 .. ,基因全长克隆 目的基因全长通过反应获得。以稀释倍的.,.为模板, 聚合酶采用 ,,所用引物如下表所示: 粗体代表保护碱基,工划线表示酶切位点,正常字体代表基冈特异序列。 反应程序采用 程序,每个循环退火温度降低.度,共降低个循 坏,然后『常扩增个循环。 表.引物序列 :’ ’ :’’ :’’ : ’、 ’ ..回收产物免隆构建并转化大肠卡菌◎麓婀虫害 当人学博十学位论文 分别将目的基因和的全长的回收片段与. ,连接,反应体系为:× .,一 . . /“,回收产物 ., , .?。反应条件:。,过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,。 过夜培养,经蓝白斑筛选后挑选单个白斑菌落,液体摇培小时,经菌液 鉴定后送出测序。测序结果与己知序列吻合,保存甘油管,分别命名为 .,,并用 ?提质粒备用。 .. 原核表达载体构建 分别提取.’.以及.质粒,根据设计的酶切位点进 行酶切。酶切分两步进行,先用 酶切?过夜。次同再加入 酶切? 。回收酶切产物与酶切过的.连接构建原核表达载体。连接产物转 化大肠杆菌感受态细胞,?过夜培养,经氨苄肯霉素钠筛选后挑选芮斑, 经菌液和酶切鉴定后送出测序。测序结果与已知序列吻合,保存甘油管, 提质粒备用。 分别命名为?,?,并用 .. 融合蛋白大量诱导及柱蛋白纯化 将测序结果币确的..转化进入火肠杆菌感受态细胞, 。过夜培养,挑取单克隆液体摇培,经检测表明重组表达载体., .合适,保存甘油管。 用诱导目的基因和蛋白表达。先进行预诱导实验。取 过夜活化的.,.菌液以%的接菌量接入 叫 培养基,。,振荡培养,大约培养~小时候,值达到诱导合适 范围,加入,继续。震荡培养四小时后,收集菌体,加入,重悬菌体,沸水浴。室 温,,离心,耿上清?进 行.。每组诱导挑选~个不同的阳性克隆菌斑做平行实验。 用诱导目的基因和融合蛋白的大量表达。取过夜活化 的.,?菌液以%的接菌量接入 吲培养 基,。,振荡培养,至约为.时加入,使其终浓度达到 两嘲虫害 兰:’’人学博十学衔仑文 /,,振荡培养约小时,收集菌体,加入 重悬荫体,用一型超卢波超声破碎。,离心,弃去沉淀, 共重复离心三次,然后用孔径为. 的微孔滤膜过滤上清液两次。参照核酸 纯化系统.操作手册,将超声过滤后的菌液以. /的速率过 柱纯化目的蛋白。 .. 的纯化 .,. 采用免疫亲和层析的原理纯化抗体。抗原和抗体之间存在特异性的相互作 用,能够专一而可逆的结合。我们选择溴化氢活化的.做为基质, 将抗原作为配体共价结合在基质上。当抗血清通过亲和层析柱时,抗体与抗 原蛋 白发生特异性结合,从而留在固定相上,其他杂质不能与配体结合,仍在流动 相 中,并随洗脱液流出。然后通过非特异性洗脱,如低,将其沈脱下来,就得 到了纯化抗体。具体操作方法参考公司. 说明 书。 的构建 .串联亲和纯化 和 ..串联亲和纯化 的构建 ... .引物设计 利用公司的专利技术进行载体构建。这项技术以入噬 菌体的位点特异性重组系统为基础。位点特异性重组系统可以使入噬菌体基 冈组 整合到大肠杆菌的染色体中,并目.可以在细胞溶解和溶源途径中转变, 之问:大肠杆 。入重组反应保守,只发生在特异性的接合位点 菌染色体的位点和噬菌体染色体上的位点。位点是重组蛋白的结 合位点。发生在位点和位点之间的重组反应能够产生位点和 位点。在技术中,入重组系统的元件经过改良,提高了系统的特异性和 。 和 效率。?技术有两种重组反应组成它的基础: 使一个含有位点的序焉?产物或线性化表达克隆 发生重组从而产生一个含有 和一个含有位点的序列蔺嘲虫雾 型人学博十学位论文图。这个反应由 催化。 位点的 和一个含有位点的序列 使一个含有位点的序列 图 发生重组从而产生一个含有位点的。这个反应由 催化。 ?口 曩 口回日. .巳一回?口 ,口回?呲矿.,口固‘ ’ 十 矗旧.峨 旧 煳 \竺/?一\竺/ ?‘ ?宣 ??一?? .. 雪重组反应示意图。,含有位点的序列和含有位 点的序列发生垂组反应,从而产生一个含有位点的 。,含有位点的序列和含 有 。 位点的序列发生重组从而产生一个含有位点的 发生 ,就要求给目的序 因此为使目的基凶与 上的 列两端带上位点,通过目的序列上的位点与 。.引物 位点发生同源重组反应,将目的序列克隆进入 的设计要包括保护碱基,序列.,为保持阅滇框不被改变而增加的附加碱基等 等, ,基因特异性序列,这些结构使得 .或者 .引物必定是一种序列较长的引物,如表所示,粗体下划线表示保护碱 基,王划线表示序列,斜筋代表附加碱皋,黑体表示 ,小 写字母表示基囚特异序列。 ◎两婀虫害 ’缈人学博十学位论文 表..引物 ’’
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