神经生长因子对脑梗死大鼠神经元凋亡与脑梗死体积的影响

神经生长因子对脑梗死大鼠神经元凋亡与脑梗死体积的影响 神经生长因子对脑梗死大鼠神经元凋亡与 脑梗死体积的影响 2009年9月第3卷第l8期ChinJMod 神经生长因子对脑梗死大鼠神经元凋亡与 脑梗死体积的影响 张燕平 【摘要】目的本研究拟观察鼠神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)对脑梗死大鼠脑部神经 元凋亡与脑梗死体积的影响.方法建立MCAO大鼠模型,腹腔注射NGF,TUNEL染色检测神 经元的凋 亡,T’rC染色检测脑梗死体积.结果脑梗死后,神经元的凋亡比较明显.腹腔注射NCF能显着 抑制神 经元的凋亡与降低脑梗死体积.结论NGF可以抑制神经细胞的凋亡,其对脑梗死大鼠具有明 显的神 经保护作用. 【关键词】脑梗死;神经生长因子;TUNEL;脑梗死体积 EffectsofNGFontheApoptosisofNeuronsandInfractVolumesinRatswithCerebralInfarction ZHANGYah-ping.TheDepartmemofNeurdogyofTheFirst~TdiatedChineseMedicineHosptital,ttenan450000, China 【Abstract】0bJective-I’IIisstudywasdesignedtoinvestigatetheinfluenceofNGFontheapoptosisof neuronsandinfraetvolumesinexpremientalcerebralinfarction.Me~odsNGFWaSinjectedintraperitoneally followingpermanentMCAOofratsonceaday.ApoptosisofneuronswasevaluatedbystainingofTUNELand infractvolumeswasdetectedbyTICstaining.ResultsInratstreatedwithNGF,thenumberoftheapoptosis ofneuronswasreducedsignificantlyincomparisonwithshamgroup.Inaddition,NGFalsoreducedinfractvol- umes.ConclusionNGFinhibitstheapoptosisofneuron~afterstrokeandmitigatestheseverityofbraindam- age. 【Keywords】CerebralInfarction;NGF;TUNEL;Infraetvolumes NGF是神经生长因子家族成员,对神经系统的 生长发育有重要作用,对神经系统损伤具有保护作 用.大量研究证实脑组织缺氧,缺血时可见其高表 达,应用外源性NGF对神经组织有保护作用…. 本研究拟观察NGF对脑梗死大鼠脑部神经元凋亡 与脑梗死体积的影响,以进一步明确NGF神经保护 作用的可能机制. 1资料方法 1.1实验动物与分组成年雄性s—D大鼠72只, 体重200—250g,由郑州大学实验动物中心提供,以 饲料喂养.按随机化原则分为3组,即假手术 组,模型组和NGF腹腔注射组.每组均设4个时间 点:12h,1d,3d,5d.每个时间点设6只大鼠. 1.2大鼠MCAO模型建立及给药途径参照文献 采用线栓法制备大脑中动脉局灶性脑缺血模型日]: 大鼠腹腔注10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后,仰 卧固定,颈部正中切口,分离并暴露右侧颈总及颈 内,外动脉,并在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉, 右侧颈总动脉剪口,插人头端烧成圆钝形直径为 0.28mm的尼龙鱼线,进线长度约l8,19mill,在 大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉,然后将颈总动 脉连同尼龙鱼线一起结扎,缝合皮肤,放回笼内,单 笼喂养.假手术组只分离,暴露血管,不结扎颈总 动脉及颈外动脉,不插入尼龙鱼线.选择苏醒后左 作者单位:450000河南省中医一附院神经内科 ? 5? 上肢屈曲,行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大 鼠为栓堵成功者进行实验,否则视为栓堵失败,弃 之不用.NGF治疗组于术后腹腔注射NGFIOIU/体 质量一次,以后1次/d;溶剂治疗组给予等体积的环 糊精溶液治疗. 1.3TUNEL检测3组大鼠在分别于术后12h,1 d,3d,5d用过量的水合氯醛麻醉,迅速打开胸腔, 由左心室灌注生理盐水,直至由剪开的右心耳流出 的液体变为清亮为止,然后断头取脑,脑组织标本 浸于10%福尔马林中固定72h,石蜡包埋,然后在 切片机上连续切片,片厚2m,行caspase3免疫组 织化学和神经元凋亡检测.TUNEL染色严格按凯 基凋亡检测试剂盒所示步骤进行,光学显微镜下细 胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL染色阳性的凋亡 细胞,所用抗体稀释液浓度为1:100. 1.4Trc染色检测脑梗死体积不同时间点断头 取脑,冷冻后等分切成2mm厚脑片,浸入37?生理 盐水溶液中染色30min.染色后将脑片浸入4%中 性多聚甲醛固定保存,拍照后用UleadPhotoEx. press2.0图象分析软件进行脑梗死轮廓勾画,法医 损伤测量软件测量脑缺血面积,算出每个大脑梗死 体积. 1.5统计学方法所有数据均用均数?标准(4- )差表示,采用SPSS10.0软件对数据进行统计分 析,各指标组间比较用方差分析重复测量进行检 验,检验水准仅=0.05. ? 6?2009年9月第3卷第18期ChinJM0d 2结果 2.1各组大鼠术后不同时间点TUNEL阳性细胞的 比较假手术组皮层内有散在TUNEL阳性细胞;模 型组与溶剂治疗组造模后,TUNEL阳性细胞明显增 多,主要是梗死灶周围的神经元.NGF治疗组则明 显减少,见表2. 2.2鼠神经生长因子对脑梗死体积的影响TYC 染色结果表明鼠神经生长因子能显着减小脑梗死 体积.经治疗后,脑梗死体积明显缩小;与溶剂治 疗组比较,结果差异有统计学意义(P<0.05),(表 2). 表1各组大鼠术后不同时间点TUNEL阳性细胞的比较 注:与模型组,溶剂治疗组比较,结果有统计学意义,P<0.05 3讨论 神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是神 经系统最主要的神经营养因子之一,也是最早被发 现,目前唯一被阐明其结构的一种神经细胞生长调 节因子,兼有神经元营养和促突起生长双重作 用….NGF的作用十分广泛,它的效应细胞具有十 几种,它能够控制神经细胞的存活数量及分化,促 进损伤神经细胞的修复.对中枢和周围神经系统 神经元的生长,发育,分化及再生和功能性的表达 均具有重要的调控作用. 近年来的研究发现,在生理情况下,NGF在脑 内含量极微,但对神经细胞的发育,成熟,存活起着 极为重要的作用.神经元在发育过程中对微量神 经营养因子的有限供应存在着相互竞争,能成功获 取NGF的细胞存活,反之则死亡.在病理情况下, NGF可保护神经元避免损伤,促进损伤细胞存 活J.不同原因的脑损伤均可引起脑源性NGF表 达增加,但是,缺血性脑损伤所引起的脑源性NGF 表达增加时程很短,表达水平有限,难以对受损的 神经元起到全面而持久的保护作用.只有在给予 大剂量的外源性NGF或植入某些能持续高水平分 泌NGF的转基因细胞或其他成分时,NGF的保护作 用才能得以充分体现』.部分国外学者通过细胞 培养的实验观察到:NGF可提高培养神经元的存活 率,当除去培养液中的NGF时,可引起30%,50 %的细胞死亡_5].1991年,Shigeno等报道沙土 鼠大脑中动脉闭塞后CA1区的NGF含量减少,从 而引起该区的迟发性神经元死亡.在侧脑室注射 NGF后,迟发性神经元坏死明显减轻,表明NGF对 脑缺血的神经元变性,坏死具有保护和修复作 用].由此可知,要想有效的保护受损神经元,就 必须给予大剂量的外源性NGF进行治疗. 本研究观察了NGF对脑梗死大鼠脑部神经元 凋亡与脑梗死体积的影响,以进一步明确NGF神经 保护作用的可能机制.结果表明模型组的缺血半 暗带内有有少量TUNEL阳性细胞,TUNEL阳性细 胞数3d达高峰,且5d仍有表达.对照组缺血半暗 带内也有TUNEL阳性细胞,但各时间点的差异不大 且数量很少.TUNEL阳性细胞数在NGF治疗组中 的明显低于模型组.研究还发现经NGF治疗后,脑 梗死体积明显缩小.NGF可能通过减少神经元的 凋亡发挥神经保护作用. 参考文献 [1]吴兴富,刘金生,王召安,等.神经生长因子治疗新生儿缺氧 缺血性脑病效果观察.齐鲁医学杂志,2000,15(3):181?182. [2]TakabaH,FukudaK,YaoH.Substraindifferences,gender,and ageofspontaneouslyhypertensiveratscriticallydetermineinfarct sizeproducedbydistalmiddlecerebralarteryocclusion.CellMol Neurobiol,2004,24(5):589-598. [3]BowesLM,TuszynskiMH,ConnerJ.Continuousintrathecalflu? idinfusionselevatenervegrowthfactorlevelsandpreventfunction- aldeficits8fterspinalcordischemia.BrainRes,2000,883(2): 178—183. [4]韩鸿宾,谢敬霞.兔大脑中动脉阻塞模型局灶性脑缺血区超早 期水分子扩散异常的病理基础研究.中华放射学杂志,1999, 33(1O):655.657. [5]ChiarettiA,Genovese0,RiccardiR,DirroccoC,eta1.Intravent— rieularnervegrowthfactorinfusion:apossibletreatmentforneuro— l0gicaldeficitsfollowinghypoxic—ischemiebraininjuryinfants. NeurolRes,2oo5,27(7):741-746. [6]ShigenoT,MimaT,TakakuraK,eta1.Aneicliorationofdelayed neuronaldeath:inthehippocampalbynervegrowthfactor.JNeu— rosci,1991,11(9):2914-2919. [7]Influenceofischemicpreconditioningonlevelsofnervegrowthfac- tor,brain.derivedneurotrophicfactorandtheirhiSh—affinityrecep— totsinhippocampusfollowingforebrainischemia.BrainRes,2008, 187:l一11.