去掉卵丘细胞或切开卵透明带对小鼠体外受精的影响

去掉卵丘细胞或切开卵透明带对小鼠体外受精的影响 1 2 1 1 1 1 3 4安铁洙, 谭建华, 高 丰, 朴善花, 岳占碰, 柳巨雄, 解月芬, 葛西孙三郎 (1 . 解放军军需大学动物科技系 , 吉林 长春 130062 ; 2 . 解放军军需大学兽医研究所 , 吉林 长春 130062 ; ) 3 . 河北省蒿城市畜牧局 , 河北 蒿城 052160 ; 4 . 高知大学农学部 , 日本 高知 7838502 摘要 : 探讨了去掉小鼠卵子的卵丘细胞和人工切开透明带对小鼠体外受精的影响 。结果明 ,与卵丘卵母细胞复合 () 体相比 ,用透明质酸酶去掉卵子的卵丘细胞后的体外受精率显著降低 分别为 56 %和 12 % —23 %;当人工切开部分透明 ( ) 带后 ,卵子的体外受精率增至 56 % —87 % P < 0 . 01;与细胞质均质的卵子相比 ,细胞质不均卵子即使切开透明带也仅有 19 % —22 %的卵子受精 。结果表明 ,用透明质酸酶去掉小鼠卵子的卵丘细胞后 ,选择细胞均质的卵子并人工切开透明带 , 可提高小鼠的体外受精率 。 关键词 : 小鼠 ; 卵丘细胞 ; 透明带 ; 体外受精 () 文章编号 : 1000 - 6419 200105 - 0010 - 04 中图分类号 : Q 954 . 44 文献标识码 : A 2 ,精子进入卵细胞需要透过 3 层在哺乳动物的受精过程中 Co hen 等的机械透明带切开法等 ,但是 ,由于其操作复杂和需 结构 ,即卵丘细胞层 、透明带及细胞膜 ,其中透过透明带是精子 要昂贵的显微操作仪等 ,实际应用受到很大限制 。为了建立提 最难越过的“屏障”。若精子的活力下降或动物患少精症时 ,精 高弱精子或少精子动物体外受精的简便方法 ,我们探讨了去掉 子就很难透过这 3 层结构 。以往对少精或弱精症动物精子进行 卵丘细胞 、卵细胞质的均质度及手工切开卵透明带对小鼠体外1 体外受 精 时 , 通 常 采 用 Gorden 等的 酸 液 透 明 带 穿 孔 法 和 受精的影响 。 1 材料与方法 收稿日期 : 2001 - 01 - 08 ( 基金项目 : 国 家 教 委 归 国 人 员 科 研 启 动 基 金 资 助 项 目 1999 - 1 . 1 试验动物 )L u - 747 雌性小鼠选用性成熟的 ICR 系小鼠 ,雄性小鼠选用性成熟 ) ( 的 ICR 系和 BD F1 C57B1/ 6 雌 X DBA/ 2 雄小鼠 。 ( ) 作者简介 : 安铁洙 1958 —,男 ,吉林省汪清县人 ,副教授 ,博士 。 5 萨 姆 布 鲁 克 , 弗 里 奇 , 曼 尼 阿 蒂 斯 . 分 子 克 隆 实 验 指viurs diversity and evolutio n J . J Gen Virol , 1996 , 77 : 南 M .第 2 版 . 北京 :科学出版社 . 1995 .1211 —1221 . 6 Lowings P , Ibata G , Pato n D , et al . Classical swine fever Analysis of E2 coding nucleotide sequence of f our prevalent virulent stra ins of Hog cholera virus 1 ,2 1 1 2 L I Ming2hui, L IU Xiang2t ao, HAN Xue2qing, HO U Wen2to ng, 1 1 2 1 ZHAO Qi2zu, MA J un2w u, L IU Bai2hua, L IU Zai2xing, 2 1 1 L I J ian2qiang, L I Zho ng2run, XI E Qing2ge ( 1 . L anz hou V eteri n a ry Resea rch I nst i t ute , CA A S , L anz hou , Gans u , 730046 , Chi n a ; )2 . N ort hest sei2tech u ni versi t y of ag ricul t u re an d f orest ry , S han n x i , Y an gl i ng , 712100 , Chi n a ( ) Abstract : The E2 gene of four p revalent virulent st rains of Hog Cholera Virus HCVf ro m Gansu China were amplified by reverse ( ) ( ) t ranscrip tio n R Tand t he nested Polymerase Chain Reactio n n PCR. The amplified f ragment s were clo ned and sequenced. Co mparsio n and analysis of nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of four p revalent virulent st rains of HCV were also carried out . The nucleotide ho mology amo ng t hem were f ro m 89 . 2 % to 99 . 7 % ; and t hat of amino acid were f ro m 93 . 8 % to 99 . 0 %. The nucleotide iden2 tit y of C2st rain f ro m spleen tissue of rabbit wit h t hat of four Chinese p revalent virulent st rains were f ro m 82 . 2 % to 84 . 3 % , and t hat of amino acid were f ro m 87 . 9 % to 90 . 2 %. There revealed so me differences in gp55 of C2st rain and t he 4 p revalent virulent st rains. Key words : Hog cholera virus ; E2 gene ; Sequence analyssis μ400L 含 0 . 5 mol/ L 蔗糖的 PB1 液 ,用液体石蜡封盖 ,在实体显 1 . 2 体外受精 3 以 mM16 液为体外受精液 。将雄性小鼠宰杀后取 附 睾 微镜下 ,手持显微刀在液体底部制成格子状的划痕 ;在划痕的上 尾 ,用经二氧化碳培养箱预培养 12 h 以上的 mM16 培养液配制 部放臵要处理的卵子 ,在实体显微镜下 ,手持显微刀在透明带上 ((( )) ) 精子悬浮液 精子浓度约 90 万个/ mL ,并进行 1 . 0 —1 . 5 h 预培 做一小切口 见图 1,然后将卵子移到 PB1 液中洗涤 3 次 。4 ( ) 养 。与此同时 ,对雌性小鼠用孕马血清促性腺激素 PMS G和在实体显微镜下将去掉卵丘细胞的卵分为两类 ,一类为细胞质 ( ) 人绒毛膜促性腺激素 hC G进行超数排卵处理 。在给雌性小鼠 均匀且颗粒物少的卵子 ,另一类为细胞质透明度低且颗粒物多 (() ) 注射 hC G 后 14 —16 h 采取其卵子 ,分别进行下列处理 : 1不作 的卵子 见图 2,并在透明带上切一小口后进行体外受精 。经 ( ) 任何处理的卵丘卵母细胞复合体 。2用含 0 . 05 mg/ mL 透明 过上述处理后 ,分别导入预培养的精子液中进行体外受精 。对 4 ( ( ) ) 质酸酶 H23506 ,Sigma的 PB1 液去掉卵丘细胞 。3在去掉 特别异常的卵弃之不用 。上述各处理组经 24 h 体外受精后 ,将 卵丘细胞的透明带上做人工切口 。首先在培养皿的底部注入均等地分裂为 2 细胞者判定为受精卵 。 a . 切开前的卵 ; b. 切开后的卵 图 1 在小鼠卵细胞透明带上做切口 a . 细胞质均质卵 ; b. 细胞质不均质卵 图 2 卵细胞质的均质度 1 . 3 胚胎的体外培养 2 结果 对体外受精中获得的 2 细胞胚 ,用不含葡萄糖的 mM16 液 进行体外培养 , 观察其发育至 4 细胞期 、桑椹期及扩张囊胚的 2 . 1 去掉颗粒细胞后对小鼠体外受精的影响 能力 。 用卵丘卵母细胞复 合 体 进 行 体 外 受 精 时 , ICR 系 和 BD F1 ( ) 1 . 4 统计分析雄性小鼠精子的受精率均为 56 % 见表 1。用透明质酸酶 去 2 用 x检验法对资料进行显著性检验 。掉卵丘细胞的卵 , ICR 系和 BD F1 精子的受精率分别为 12 %和 4 透明带切开卵经体外受精获得的 表 表 1 去掉颗粒细胞后对小鼠体外受精的影响 2 细胞胚的体外培养( )细胞期胚数 个 处理卵子数 2 雄性小鼠 处理方式 ( ) 各发育阶段胚数 个及百分比 ( ) 培养胚数 个及百分比雄性小鼠 处理方式 ( ) 个4 细胞期 桑椹期 扩张囊胚 ( )117 66 56 不处理 去 ICR ( )85 10 12 掉卵丘细胞 ( )( )( )未切开透明带 39 39 100 38 97 37 95 ICR ( )( )( )切开透明带 71 70 99 68 96 64 90 ( )不处理 去149 84 56 BD F1 ( )掉卵丘细胞 90 21 23 ( )( )( )未切开透明带 37 36 97 36 97 36 97 BD F1 ( )( )( )切开透明带 39 39 100 37 95 33 85 ( ) 23 % P < 0 . 01。 6 ,去掉卵 丘 细 胞 , 可 导 致 体 外 受 精 率 下 降 。Germo nd 等推 明 2 . 2 透明带做人工切口对小鼠体外受精的影响 用透明质酸酶去掉卵丘细胞后 ,进一步切开透明带的卵与 测 ,经过透明质酸酶处理的卵 ,其透明带的结构发生改变 ,从而 ICR 系和 BD F1 小鼠的精子进行体外受精 ,受精率分别为 56 % 导致其体外受精率下降 。本试验用透明质酸酶去掉卵周围的卵 ( 和 82 % ,均 高 于 未 切 开 的 透 明 带 卵 的 受 精 率 12 % 和 23 % , 丘细胞后 ,虽然获得了受精卵 ,但与使用卵丘卵母细胞复合体组 ) P < 0 . 01,见表 2 。相比 ,受精率显著下降 。在人工切开透明带时可以感触到 ,与由 精子本身去掉卵丘细胞的透明带相比 ,用透明质酸酶处理的卵 子透明带弹性明显下降而变脆 ,而且这种变化随透明质酸酶处 表 2 透明带做人工切口对小鼠体外受精的影响 理时间的延长而更加明显 , 但切开透明带后均获得了受精卵 。 ( )细胞期胚数 个 处理卵子数 2 雄性小鼠 处理方式 由此可以认为 ,用透明质酸酶处理的卵 ,虽然透明带的结构发生 ( ) 个及百分比7 了变化 ,但对卵细胞结构不产生显著影响 。森泽正昭等认为 , ( )未切开透明带 85 10 12 ICR 当精子获能后 ,依靠其本身的机械动力和化学溶解的合力可透 ( )84 47 56 切开透明带 过透明带 。由本试验结果可以推测 ,透明带经透明质酸酶处理 ( )未切开透明带 90 21 23 后 ,不仅使精子无法以其本身的机械力穿透透明带 ,同时精子附BD F1 ( )切开透明带 90 74 82 着和溶解透明带变得更加困难 。 近年来 ,在处理严重精子缺乏症或少精症时采用化学或机 1 2 . 3 卵细胞质均质度对小鼠体外受精的影响 械方法 。Gordo n 等研究了用酸性溶液溶解部分透明带的化 2 当用细胞质均匀且颗粒物少 、切开透明带的卵时 , ICR 系和学透明带穿孔技术 ; Co hen 等发明了使用显微操作仪的机械 BD F1 精子 的 体 外 受 精 率 分 别 为 72 % 和 78 % , 显 著 高 于 细 透明带切开法 。本试验中所使用的是后一种方法的改良法 ,与 8 ( ) 胞质不均 、切开 透 明 带 卵 的 受 精 率 12 %和 23 % , P < 0 . 01 , Nakagata 等的方法有相似之处 , Nakagata 等所使用的处理液 见表 3 。为不含 BSA 的蔗糖溶液 ,因此卵子的透明带紧密地粘着在培养 皿的底壁 ,虽然容易切开透明带 , 但卵细胞极易从透明带内脱 表 3 卵细胞质均质度对小鼠体外受精的影响 出 ,难以回收 ,本试验使用的透明带切开法 ,是在实体显微镜下 ( )用显微刀手工切开 , 同 Co hen 的方法相比 设 备 要 求 低 , 操 作 简 细胞期胚数 个 处理卵子数 2 雄性小鼠 细胞质均质度 便 ,卵细胞不易从透明带中脱出 。本试验结果表明 ,用此方法切 ( ) 个及百分比 开透明带的卵子 ,经体外受精能够获得很高的受精率 ,因此可以 ( )82 59 72 高 ICR 认为手工切开透明带的方法适用于弱精子的体外受精 。 ( )110 47 19 低 与卵丘卵母细胞复合体的体外受精不同 ,当用透明质酸酶 ( )高 50 39 78 去掉卵丘细胞后 ,在实体显微镜下可以清楚的观察到卵细胞质 BD F1 ( )低 32 74 22 的均质度 。本试验中根据卵细胞质的均质度 ,将卵子分为卵细 胞质均质的和不均质的两类 ,分别切开透明带后进行体外受精 ,2 . 4 透明带切开卵经体外受精获得的 2 细胞胚的体外培养 结果表明 ,前者的受精率显著高于后者 ,细胞质不均且带颗粒的 在上 述 体 外 受 精 中 获 得 的 2 细 胞 胚 , 经 体 外 培 养 获 得卵子 ,体外受精后的异常分裂率和变性死亡率非常高 。由此可 ( ) 85 % —97 %的扩张囊胚率 P > 0 . 05,未发现雄性小鼠品系间 以推测 ,这些卵子可能处于退化阶段 。 及卵子透明带切开对其发育的影响 ,见表 4 。 上述体外受精中获得的 2 细胞胚经体外培养 ,获得了非常 高的扩张囊胚率 ,表明切开卵子透明带对胚胎的体外发育未产 讨论3 生显著影响 。 哺乳动物在受精过程中 ,精子进入卵子质内 ,必须透过卵丘 总之 ,小鼠卵子的手工透明带切开术 ,对提高弱精子的体外 5 细胞层 、透明带及卵细胞膜等 3 层结构 。Pavlo k 等的研究表 受精率具有促进作用 。 水牛肝片吸虫病间接 EL ISA 诊断方法的建立及应用 1 2 3 3 3 3 王丙云, I. Ferre, 陈 龙, 顾有方, 江善祥, 毛为华, 3 3 2谢晋, 毛鑫智, J . Ganzalez2Gallego (1 . 佛山科学技术学院动物医学系 , 广东 南海 528231 ; 2 . 西班牙莱昂大学生理学系 , ) 西班牙 莱昂 24071 ; 3 . 南京农业大学动物医学院 , 江苏 南京 210095 ( ) 摘要 : 以肝片吸虫的分泌2排泄物作为抗原 ES 抗原,建立水牛肝片吸虫病间接 EL ISA 诊断方法 ,并用此方法与粪便 () 检查法检测江苏和安徽 2 省 10 县 市302 户的 307 头水牛的血清和粪便 ;间接 EL ISA 诊断法的最佳工作条件 ,每孔包被 μ0 . 2g 抗原 ,血清稀释度为 1?960 ,二抗稀释度为 1?600 。结果 :粪便检查出虫卵的阳性水牛 43 头 ,阳性率为 14 . 01 % ,其中 () ( ) 安徽省为 11 . 61 % 18/ 155,江苏省为 16 . 45 % 25/ 152; 用 间 接 EL ISA 法 检 测 299 头 水 牛 血 清 , 阳 性 87 头 , 阳 性 率 为 29 . 19 % ,其中安徽省为 23 . 53 % ,江苏省为 34 . 92 % ,两种方法的符合率为 86 . 05 % 。 关键词 : 水牛 ; 肝片吸虫 ; 间接酶联免疫吸附试验 () 文章编号 : 1000 - 6419 200105 - 0013 - 03 中图分类号 : S 855 . 91 . 735 文献标识码 : B () 肝片吸虫病是一种世界性的寄生虫病 ,危害多种家畜 ,尤其县 市水牛肝片吸虫病进行流行病学调查 。 是牛 、羊等反刍动物 。肝片吸虫的童虫在肝实质移行 ,诱发坏死 1 材料与方法 性肝炎 ; 成虫则寄生在肝胆管 ,引起急性和慢性肝炎和胆管炎 , 1 ,2 并伴发全身中毒和营养障碍。肝片吸虫病是水牛的主要疾 1 . 1 EL ISA 诊断法的建立 3 1 . 1 . 1 抗原的制备 从新鲜宰杀的水牛肝收集肝片吸虫 , 用病之一 ,严重影响水牛养殖业。早期主要采用粪便检查法诊 () 断肝片吸虫病 ,但其检出率低 、准确性差 、且无法据此进行早期 37 ? PBS p H 7 . 2冲洗 4 —5 次 ,去掉血迹和胆汁 。然后将肝 () (诊断 。以后建立的 EL ISA 诊断法 ,其抗原多采用虫体抗原 ,由 片吸虫 5 个虫/ 10 mL放入 PBS 含链霉素 100 mg/ mL 、青霉素 4 ) 于虫体抗原成分复杂 ,易出现假阳性和假阴性。本试验采用100 IU/ mL 和 0 . 5 mmol/ L PMSF中 ,37 ?培养 3 h ,收集的培 肝片吸虫分泌2排泄物作为抗原 养液经 ,建立水牛肝片吸虫间接 EL ISA4 ? 20 000 r/ min 高速离心 ,将收集的上清液用900 g/ L ( ) 诊断方法 ,并 应 用 此 方 法 与 粪 便 检 查 法 对 江 苏 和 安 徽 2 省 10饱和硫酸铵沉淀 2 次 ,沉淀透析过夜 换 PBS 2 —3 次,最后装 ( ) 入 Sep haex G225 柱 Pharmacia 公司产品过滤 ,收集滤液 ,此滤 5 收稿日期 : 2000 - 10 - 08 液中含 ES 抗原。紫外分光光度比色法测定其蛋白质含量为 基金项目 : 欧盟资助国际合作项目 1 . 68 mg/ mL ,分装 , - 30 ?保存备用 。 ( ) 作者简介 : 王丙云 1963 —,男 ,江西省彭泽县人 ,副教授 ,博士 ,主 1 . 1 . 2 标准阳性和阴性血清 人工感染肝片吸虫囊蚴 10 周 要从事免疫生理学研究 。 () 后 ,粪便检查和斑点酶联免疫吸附试验 Dot2EL ISA检测为阳 zo na pellucida in fertilizatio n of mouse eggs in vit ro J . 参考文献 : Journal Rep roductio n Fertility ,1972 ,29 :91 —97 . Germo nd M , Nocera D , Senn A , et al . Imp roved fertiliza2 1 Gorden J W , Talansk B E. Assisted fertilizatio n by zo na 6 tio n and implantatio n rates af ter no ntouch zo na pellucida mi2 drilling : a mouse model for correctio n of oligosper2mia J . μcrodrilling of mouse oocytes wit h a 1 . 48m Diode laser beam Journal Experiment Zoology ,1986 ,239 :347 —354 . J . Human Re p roductio n ,1996 ,11 :1043 —1048 .Co hen J , Malter M , Fehilly C , et al . Implantatio n of em2 2 森泽正昭 ,星元纪 ,森泽幸子 . 精子学 M . 东京大学出版 bryos af ter partial opening of oocyte zo na pellucida to facilitate 7 社 ,1992 . 105 —120 . sperm penet ratio n J . L ancet ,1988 ,2 :162 . Nakagata N , Okamoto M , Ueda O , et al . Positive effect of An T Z , Wada S , Edashige K T , et al . Viable spermatozoa 3 8 partial zo napellucida dissectio n o n t he in vit ro fertilizing ca2 can be recovered f ro m ref rigerated mice up to 7 days af ter pacit y of cryop reserved C57BL / 6J t ransgenic mouse sperma2 deat h J . Cr yobiology ,1999 ,38 :27 —34 . tozoa of low motility J . Biolo gy Rep roductio n , 1997 , 57 : 4 Whit tingham D G. Survival of mouse embryos af ter f reezing 1050 —1055 . and t hawing J . Nat ure ,1971 ,233 :125 —126 . 5 Pavlo k A , McL aren A. The role of cumulus cells and t he