中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)

中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行） 国家药典委员会2002年4月27日 说明：本实验研究规程指南为在原技术要求的基础上中药注射剂色谱指纹图谱试验研究而制订。本指南未能概括的内容，通过实践可自行补充调整，但申报资料或复核资料中须有相应的说明和申述。指南中的"色谱指纹图谱"指采用柱色谱及薄层色谱等各种色谱技术实验研究的指纹图谱。光谱指纹图谱将另行。一、 供试品收集供试品收集是研究指纹图谱最初也是最关键的步骤，由于不可能对一个药材的所有样本进行试验，而且生长环境条件对药材代谢产物有影响，所以要收集有代表性的供试品。收集不少于10批供试品的含义是指样本的数和量要有足够的代表性。(一) 原料药材：在药材的化学成分与中医临床疗效的之间的关联尚未能阐明的现阶段，基本上是在承认其传统的功能主治及临床验证的基础上进行指纹图谱的实验研究。原料药材的指纹图谱主要是反映其自然状态的内在质量情况，研究其指纹图谱是以此作为选择原药材投料或混批提取的依据，同时作为研究注射剂成品指纹图谱相关性的基础。由于自然条件的变化，药材个体之间指纹图谱的差异是正常的，在品种鉴定无误的基础上，力争药材有较为固定和稳定的来源，个体之间的指纹图谱主要特征大致相似即可，使成品指纹图谱特征的稳定有起码的保证。药材的"批" 不是工业生产的"批"，是指相互独立的供试品，即不能将同一地点或同一渠道同一时间获得的供试品分成若干份供试品，以保证试验结果的代表性。由于收集药材供试品受主观和客观的条件限制，供试验的供试品严格讲均没有统计学的意义，所以供试品数越多越好，10批是最低的要求。供试品应保证其真实性，应有完整采样原始记录，内容包括： ? 药材名称 ? 供试品来源（真实记录供试品来自何处：传统产地收集或是资源丰富的产地收集，或者来自GAP基地供应；还是产地购买、市场购买或委托购买，等，以便于生产原料的采购选择和测试数据的可追溯）。 ? 收集时间（购买时间）及收集人 ? 货源情况调查（货源是否充足和稳定） ? 基原鉴定及鉴定人：产地或GAP基地收集的药材结合植物形态鉴定品种。如缺原植物，由熟练的专业人员凭性状或显微特征鉴别。如近缘品种、难以区分的野生品种（如白花蛇舌草、蒲公英），应在指纹图谱研究中仔细比较，如获得的指纹图谱相似度很高，也可应用，但须明确记录。并在今后实施GAP时确定一个品种，如指纹图谱相似度很低，则须确定品种，改为栽培品使用。商品混乱的品种（如陈皮）产区的选择应缩小范围，并结合资源选用药典收载品种中的一种。复方制剂中的君药及处方量大的药材必需重点注意品种的鉴定，以避免今后执行指纹图谱过程中出现难以预料的困难。 ? 质量评估：为了便于对色谱的正确分析，减少试验结果的判断误差，首先药材需符合药典或部颁规定，并详细记录。所有药材均须编号，必要时附药材外形照片。 ? 供试品的留样、贮藏和标签：由于指纹图谱研究周期较长，供试品必须在干燥、低温、避光处贮藏，标签必须有编号，收集供试品的编号应与贮藏样品、试验样品的编号一致。留样数量应不少于试验实际用量的3倍。以保证试验结果有异议时的可追溯。 ? 如以中药饮片或炮制品为起始原料，应采用符合中国药典或饮片炮制规范的供试品。 申报资料可将关键内容扼要填写于表一中： 表一（推荐） 药材名称 供试品编号 供试品来源 收集时间（购买时间）及收集人 货源情况调查 基原鉴定及鉴定人 学名： 鉴定人： 质量评估 供试品留样 数量：　容器： 贮藏地点及条件： 标签 原始记录保存处     附一：药材外形照片。 附二：药材的色谱图（试验完毕后）。  (二) 半成品(提取物)：药材所含成分的个体差异是难以避免的，指纹图谱研究用的半成品应来自生产车间通过药材混批调整及规范的生产工艺生产的实际样品。关键技术及相应参数填写于表二，并附试验完毕后指纹图谱。  表二（推荐） 半成品（提取物）名称 混批前批号 日期 提取方法（关键技术） 混批后批号 混批比例 原始记录保存处 供试品留样 数量： 容器： 贮藏地点及条件：     附：混批前后的指纹图谱。 (三) 成品(注射剂)：产品批号、生产单位、成品批号与半成品（提取物）批号的相关性均须有明确的记录，以保证试验数据的可追溯。成品的“对照用指纹图谱”是建立在标准化提取物或10批以上产品指纹图谱的基础上。各批供试样品须有留样。主要内容填写于表三，并附试验完毕后的指纹图谱。  表三（推荐） 供试品批号 生产单位 供试品数量 供试品留样 数量： 容器： 贮藏地点及条件：     指纹图谱研究用的原药材、半成品及注射剂成品均应有10批以上的样品供实验，以保证指纹图谱的可重复性。  二、供试品溶液的制备 (一) 药材供试品溶液的制备 ? 取样：供试品取样应注意代表性，以保持实验室取样与实际生产应用药材一致，例如地上部分的药材，取样约0.5～1Kg，分别称量茎、叶、花、果的大致比例并做记录。例如果实类药材，生产时去除种子的，供试品也应除去种子，并做记录。如果药材表观质量不均匀（如大小不一、肥瘦不等、粗细不匀等），应注意供试品的取样有代表性，其后的试验中，必要时应做比较试验，以考察所含成分有无显著差异，供生产参考。  ? 称样：应按照常规要求，将选取的供试品适当粉碎后混合均匀，再从中称取试验所需的数量，一般称取供试品与选取样品的比例为1：10，即如称取1g供试品，应在混合均匀的10g 选取的样品中称取。因为指纹图谱需要提供量化的信息，称取供试品的精度一般要求取3位有效数字。 ? 制备：药材指纹图谱的主要目的，一是考察药材本身的质量情况，二是以药材的指纹图谱为参比，提取物及制剂的指纹图谱与之比较，以考察制剂与原药材的相关性。药材供试品溶液的制备，可选用适宜的溶剂和提取方法，定量操作进行，尽量使药材中的成分较多地在色谱图中反映出来，并达到较好的分离。最终制备的供试品溶液还应能适应色谱试验的需要，如液相色谱的供试品溶液宜用色谱流动相或色谱洗脱强度较弱的溶剂；薄层色谱用的供试品溶液可采用液液萃取或固液萃取，选用适宜的溶剂制备供试品溶液。气相色谱的供试品可采用水蒸气蒸馏法、顶空进样法或固相微萃取法，供试品如需使用溶剂，应用低极性低沸点的溶剂。 ? 定容：供试品溶液最终应用适宜的溶剂溶于标定容量的容器中，制成标示浓度的供试品溶液（g/mL或mg/mL）。 ? 放置：一般要求供试品溶液尽量新鲜配制，如连续试验需要，供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下短期放置，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。 ? 标签：须注明编号或批号，应与取样的药材编号一致，或有明确的关联，以保证数据的可追溯。 主要操作过程及数据应详细记录。 (二)半成品(提取物)供试品溶液的制备： 称取不同批次的半成品（提取物），参照"供试品溶液"的制备方法中相应的内容制备成一定量的溶液，备用。标签须注明编号或批号，应与取样的药材编号一致，或有明确的关联，以保证数据的可追溯。主要操作过程及数据应详细记录。  (三)成品(注射剂)供试品溶液制备： 液体注射剂一般可直接或稀释后作为供试品溶液，必要时也可用适宜的溶剂提取并制备成一定量的溶液。固体形式的注射剂（冻干粉针）须注意注射剂成品的附加剂有无对色谱试验干扰。如有干扰，须研究采取适宜的样品预处理方法以排除干扰（如含有氯化钠则液相色谱不可使用蒸发光散射检测器；如糖分太多，可能影响薄层色谱的清晰度和分离度；冻干粉针的骨架剂用量较大时也可能影响色谱的质量等）。此外，单方注射剂药材或复方注射剂中不同药材成分类别如果相差较大，色谱条件要求不同，需要进行样品的预处理时，应分别进行试验，便于制备2张以上的指纹图谱。主要步骤及数据应详细记录。 三、参照物 (一)参照物的选择：指纹图谱的参照物质一般选取容易获取的一个以上注射剂中的主要活性成分或指标成分，主要用于考察指纹图谱的稳定程度和重现性，并有助于色谱的辨认。在与临床药效未能取得确切关联的情形下，参照物（复方注射剂应首选君药的活性成分或指标成分）起着辨认和评价色谱指纹图谱特征的指引作用，它并不等同于含量测定的对照品。指纹图谱一般色谱比较复杂，内标物不易选择，也不易插入，指纹图谱不是含量测定，故内标物的作用也不等同于含量测定的内标物，因此应慎重考虑选用内标物质的必要性和可能性。参照物应说明名称、来源和纯度。如无参照物也可选指纹图谱中的稳定的色谱峰做为参照峰，说明其色谱行为和有关数据，并应尽可能阐明其化学结构及化学名称。如情况需要，又有可能也可考虑选择适当的内标物插入色谱中。  (二)参照物溶液的制备：精密称取，用适宜的溶剂制成标示浓度的溶液，备用。  四、实验 常用的色谱技术有薄层色谱、液相色谱、气相色谱及其他色谱技术。须注意各种色谱技术的特点和不足，结合实际选用。不论何种色谱技术，选用的原则是必需具有良好的专属性、重现性和可行性。  专属性：建立的指纹图谱必须能够表达该品种的特征，即唯一性。  重现性：同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹的各特征峰（斑点）作为整体（峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例）在不同实验室和不同操作者之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度，以表明方法的可行性。同一品种不同样品之间的相似度不属于此范围。  可行性：色谱方法和试验条件应易于推广和便于执行，即一旦由药品监督管理部门批准成为质量标准的内容后，生产企业、中等水平的分析实验室和省级以上的法定检验机构均可执行该标准。  (一) 实验室 ：承担色谱指纹图谱的实验室应符合以下6个条件：  1、 实验室具备承担指纹图谱的总体能力；  2、 实验室设备通过检验证明符合指纹图谱试验研究的需要；  3、 技术人员具备从事指纹图谱试验研究的能力；  4、 对实验室的技术能力评价应有定期的内部的独立检查；  5、 试验数据有可追溯，与其他实验室有可比性；  6、 实验室应有质量保证体系，以确保各种措施实施的透明和一致。  (二)仪器：所用的仪器性能应能满足指纹图谱试验的需要，并须经校验；如果同一台仪器有两个以上的项目共用，须有特别措施保证仪器的清洗和维护，仪器使用要有明确记录。液相色谱柱记录商品名称、生产厂家及相关参数（固定相、柱长度、内径、填料粒度等）；一般需用三根以上不同生产厂家的柱子进行比较，经比较试验后应固定色谱柱来源与规格。色谱系统的适应性试验可用该品种指纹图谱所用的参照物，参照常法进行，如柱效明显降低，在排除其它因素后，说明该色谱柱不能继续使用。另一方法是用制作"对照用指纹图谱"的提取物留样样品定期重复试验，将前后得到的指纹图谱垂直叠加，直观比较，各指纹特征峰是否能重合及整个色谱的形状是否有变异，如有变异致使指纹特征已难以辨认，或选择难分离的一对或一组峰，其分离度如明显降低，在排除其他可能的影响因素后，可认作该色谱柱不能使用。仪器使用人、使用时间及周期应有记录。  薄层色谱系离线操作，薄层板为一次性器材，不存在重复使用问题，但不同厂家的商品预制薄层板质量可能不一致，手工自制的薄层板只能供筛选试验条件使用，用确定的条件制作指纹图谱（图像）时必须用有质量保证的商品预制薄层板（如Silicagel 60，Merck等）。图谱摄像时如用数码摄像机，解像度应在20,00,000象素以上，荧光色谱须在薄层色谱专用的紫外光灯箱下加滤光片拍摄。如有相应的积分软件，可立即生成轮廓扫描图以及积分数据；也可用常规的薄层色谱扫描仪进行积分和绘制轮廓图谱。薄层扫描仪的机械部分、电子部分及光源需定期校验。  气相色谱如色谱柱类型、长度、内径、老化条件、载气、流速、柱温、柱头压力、进样方式、进样口温度、检测器等均需考察；仪器除定期检查校验外，填充柱或毛细管柱的柱效也应参照液相色谱柱定期校验柱效。其他种类的色谱仪参照上述原则校验和记录。  各种仪器均须按照仪器操作手册以及SOP进行。  (三)试验方法和试验条件： 色谱指纹图谱试验方法和试验条件的优选：试验条件应能满足指纹图谱的需要，不宜简单套用含量测定用的试验条件，并需根据指纹图谱的特点进行试验条件的优选。  试验方法和试验条件选择的目的是通过比较实验，从中选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的要求。方法和条件须经过严格的方法学验证。由于色谱指纹图谱具有量化的概念，所以从样品的称取、供试液的制备和进行色谱分析时均须定量操作。在指纹图谱研究中，"量化"的含义是指在定量操作的条件下所得到的指纹图谱在整体特征上可以作半定量的比较，以表达供试品个体之间指纹图谱在"量"方面的总体差异程度，以及半成品（提取物）和成品之间及成品批间指纹图谱在"量"方面的相似程度。  选择试验方法及试验条件须根据供试品的特点和需要设计合适的试验，在保证专属性、重现性的前提下，宜选择简单、实用、便于实施的方法和试验条件，并需要进行方法学验证。  (四)试验中应注意的事项：  (1)液相色谱的色谱柱需做比较试验加以选择，流动相至少用三种不同组成进行比较，并从中选取最合适的色谱条件。目前，高效液相色谱一般为反相色谱，采用十八烷基硅烷键合相柱，特殊情况下可选择其他类型的化学键合相柱。不同生产厂家不同牌号的色谱柱因选用的硅胶原料、键合条件、封尾情况等的差异，致使在性能上互有差异，故通过试验比较，选择合适的色谱柱很重要，选用的色谱柱最好是多数实验室常用的。如需梯度洗脱时，应尽量采用线性梯度。并应仪器梯度滞后时间。测定梯度滞后时间，可用一零死体积连接器代替色谱柱，以甲醇为溶剂A，含0.1%丙酮的甲醇为溶剂B，检测波长为260nm，运行0－100% B的线性梯度，梯度时间20分钟，流速1.0ml/min，记录梯度图形，测定梯度曲线中间点的时间，减去10分钟，即得。不同的仪器，由于梯度滞后时间的不同，可能影响方法的重现性，通常可通过调整进样和梯度起始时间减少这种影响。检测器最常见的是紫外-可见光检测器，文献报道的检测波长常常是为含量测定某一特定成分，不一定完全适合指纹图谱的需要，为了获取多层次的信息，常常需要选择数个不同的检测波长，条件许可的可使用二极管阵列检测器，获取不同波长得到的色谱图，从中汲取更多的信息。对在紫外区无吸收的化合物，也可选择其它类型的检测器，如差示折光检测器或蒸发光散射检测器等。  (2) 薄层色谱一般采用常规硅胶预制板或高效硅胶预制板，必要时也可选用聚酰胺薄膜板或纤维素薄层板等，选用时主要是保证色谱图像的质量，劣质的预制板不能使用。展开用溶剂系统的选择至少需做三种不同展开系统的比较，另外，需注意观察温度和相对湿度对色谱行为的影响。杂质的干扰对柱色谱，常常是"隐性"的；薄层色谱则由于样品供试液中所有成分均可在薄层板上观察，所以杂质成分对色谱的干扰是"显性"的，可直观地反映在薄层色谱上，甚至直接影响指纹图谱的观察，因此样品供试液的预处理常常是需要考虑的步骤之一。薄层色谱指纹图谱宜在同板将"对照用提取物"与供试品平行比较，即每一薄层板必须有"随行对照用提取物"或相应的参照物。显色剂分通用显色剂和专属显色剂，结合使用可在一个色谱条件下得到的指纹图谱获取成分类别或化学成分功能团的信息，如生物碱、黄酮类、三萜类、甾体类、香豆素类等，专用的显色剂可以直观地显示各自的特征。  (3) 气相色谱通常使用毛细管柱，如填充柱得到的色谱虽然简单，但如确能表达该品种的指纹特征，也可采用。一般极性与非极性固定相均须比较，以确定选用合适的固定相。色谱运行时间能保证供试品中的成分均能流出色谱柱。如需要将相对保留时间作为固定的常数（"保留指数"），也可根据实际需要和可能选取1,2个内标物质计算。如需程序升温宜采用线性升温，尽量避免复杂的多阶程序。  其它色谱技术可参照上述基本要求设计试验。  色谱中的参照峰由于作用不同于含量测定，提高其分离度应以不牺牲色谱的整体特征为前提，所以不应孤立地苛求其分离度必需达到含量测定的要求。  试验研究中一般需要实验室模拟生产工艺制备供试品溶液，作为实验室模拟样品，以考察试验条件，并与实际生产的供试品的指纹图谱作参考比较。由于实验室制备条件不可能与大生产工艺制备的产品完全一致，在其后的相关性比较时，有关数据仅供参考用，如大生产样品与实验室模拟样品指纹图谱相差十分明显，则提示有必要从生产工艺和实验室模拟样品两方面检查原因。  五、色谱指纹图谱的建立和辨认 试验条件确立后，将获得的所有样品的指纹图谱逐一研究比较，首先试验人员应将原药材、半成品（提取物）、成品的指纹图谱分别直观比较。一张指纹图谱，特别是分辨率较高的图谱，必须制备有足够代表性的样品的图谱，仔细观察，首先找出药材色谱具有指纹意义的各个峰，给以编号，药材、半成品和成品之间的图谱比较，如有缺峰，则缺号，以保持峰的编号不变，便于清楚地考察相互之间的相关性。半成品（提取物）的指纹图谱与原药材的指纹图谱应有一定的相关性，即半成品（提取物）指纹图谱的特征应在原药材的指纹图谱中可以追溯，而原药材中的某些特征在提取物指纹图谱中允许因生产工艺关系而有规律的丢失。半成品（提取物）指纹图谱与成品（注射剂）的指纹图谱应有较高的相关性。中药复方注射剂如处方药味较多，药量各异，成分复杂，难以要求在指纹图谱中全部体现，但作为原料的各味药材，必须研究各自的指纹图谱。有的品种某一种成分含量很高（如黄芩中的黄芩苷），在色谱图中占绝对优势，其它特征很弱，虽然这本身就是特征，但有时为了区别用药材作起始原料和单一成分直接投料（如用黄芩苷代替黄芩药材），可试用不同的检测波长或不同色谱方法，突出其它特征，相互参照辨认。有的复方注射剂数种药材均含同一类别的成分，而且成分又较多时（如人参、三七、黄芪并存），建立指纹图谱的难度很大，除尽量改进试验条件，提高色谱的分辨率外，可用阴性对照，考察相关峰的叠加关系，此时，各指纹峰之间比例的稳定成为重要特征。因此更说明用药材的标准提取物投料将是必然的发展趋势。  指纹图谱的辨认应注意指纹特征的整体性。一个品种的指纹图谱是由各个具有指纹意义的峰组成的完整图谱构成，各个有指纹意义的峰（或薄层色谱的斑点）其位置（保留时间或比移值）、大小或高低（积分面积或峰高）、各峰之间相对的比例是指纹图谱的综合参数，辨认和比较时从整体的角度综合考虑，注意各有指纹意义的峰相互的依存关系。液相色谱不同仪器可能因滞留体积不同等原因导致保留时间的漂移。薄层色谱的比移值不同实验室漂移现象更较常见，所以比较色谱的整体特征很重要，不宜纠缠细枝末节。指纹图谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱（共有模式）及供试品之间指纹图谱的相似性。指纹图谱的相似性从两个方面考虑，一是色谱的整体"面貌"，即有指纹意义的峰的数目、峰的位置和顺序、各峰之间的大致比例（薄层色谱还有斑点的颜色）等是否相似，以判断样品的真实性。二是供试品与对照样品或"对照用指纹图谱"之间及不同批次样品指纹图谱之间总积分值作量化比较。如总积分面积相差较大（如±20%），则说明同样量的样品含有的内在物质有较明显的"量"的差异，这种差异是否允许，应视具体品种，具体工艺的实际情况，并结合含量测定项目综合判断。这种比较应在同一台仪器平行进行测定。为了减轻日常检验的烦琐计算，积分数据可以简化为3位有效数字，或者直接读取图谱纵坐标的刻度值。因为积分值本身由于不同成分响应不同，而且量的多少与真值不一定呈线性关系；指纹图谱的功能不同于含量测定，它只需要数量的大概信息。相似性比较可以用"相似度"表达，相似度可以借助药典会推荐的"中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件"计算，除个别品种视具体情况而定外，一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9～1.0（或以90～100表示）之间作为符合要求。自行开发的软件必需公开算法。申报资料中除相似度计算结果外，需附指纹图谱。相似度小于0.9 ，但直观比较难以否定的供试品，可进一步采用模式识别方法（如主成分分析）检查原因。 六、色谱指纹图谱的校验和复核  生产企业申报的色谱指纹图谱须经独立于生产企业以外的实验室进行校验，以确认其专属性和重现性。国家药品监督管理局指定的省级药品检验所负责研制单位申报资料的技术审核与实验复核，除另有规定外，已上市品种的指纹图谱复核，如同品种经统一研究确定方法的指纹图谱标准复核由省级药品检验所进行；厂家自己研制的指纹图谱标准复核由省级药品检验所进行，并由国家药典会组织另一药品检验所对其进行二次复核。半成品（提取物）不做复核试验，只做文字资料的技术审核，以判断成品与原料及半成品（提取物）的相关性以及申报资料内容是否合理。  进行资料审核时注意申报的资料是否进行系统的方法学考察和验证，书面审核内容包括提取方法、提取溶剂、色谱柱或薄层板、色谱系统、检测波长等的选择；精密度、方法稳定性、重现性及成品储放后指纹图谱的稳定性等考察，结果可通过相似度软件检查，结果相似度均应在0.9以上。所申报的上述资料应书写规范，数据齐全。除情况确实需要外，一般复核单位不再进行方法学复核试验，但复核单位本身对注射剂成品的复核试验仍须进行自身的方法学验证。  复核申报的指纹图谱试验，应与原申报资料提供的试验条件相同。如复核结果难以与申报资料的指纹图谱吻合，应结合申报资料的有关内容和数据以及复核单位的全部图谱及数据，客观地公正地分析原因。必要时，由第三方再复核。也可以随行对照用提取物为参照，与供试品由申报单位和复核单位分别在各自实验室进行核对试验，双方供试品与对照用提取物的指纹图谱平行比较。如各自均能重复自身的结果，而色谱的指纹特征又可以相互印证，虽与标准所附对照用指纹图谱有所差异，但相似度检查均能通过，也可考虑予以认可。但同一实验室在完全相同的条件下获得的指纹图谱不应发生上述情况。故每次检验时均应用随行对照提取物同时试验，并进行相似度检查。  (一)送样程序  已上市品种的指纹图谱，如同品种经统一研究确定方法的指纹图谱，其研究资料与制剂由生产厂家送所在地的省级药品检验所复核，再转报国家药典会。如生产厂家自己研究的指纹图谱，其研究资料及药材与制剂送所在地省级药品检验所复核，再由国家药典会委托另一药品检验所对其制剂进行二次复核。  (二)实验复核  1. 按研制单位申报资料提供的指纹图谱测定方法对成品进行测定，绘制图谱，记录有关数据。首先将试验获得的指纹图谱与申报资料的文字叙述及所附的对照用指纹图谱　进行比较，检查图谱整体特征的相似性。薄层色谱指纹图谱除比较轮廓扫描图外，还须比较斑点颜色（包括荧光颜色）。