编制说明-粮食中中黄曲霉毒素B1测定方胶体金快速定量法（20141028）

编制说明-粮食中中黄曲霉毒素B1测定方胶体金快速定量法（20141028） 《粮油检验 粮食中黄曲霉毒素B检测 胶体金快速定量法》 1 编制说明 黄曲霉毒素B(Aflatoxin B简写为AFB)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个111 双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素B是已知的化学物质中致癌性最强的1 一种。在天然食物中以黄曲霉毒素B最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉1 毒素B是大部分食品的必检项目之一。黄曲霉毒素B对包括人和若干动物具有强烈的毒性，11 其毒性作用主要是对肝脏的损害。 黄曲霉毒素B污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油食品，且以南1 方高温、高湿地区受污染最为严重。目前，GB 2761-2011《食品安全国家 食品中真菌毒素限量》中对谷物及其制品中黄曲霉毒素B的最高限量为20μg/kg。黄曲霉毒素B的检测11方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫法、胶体金免疫层析法等，以往利用胶体金免疫快速检测法可对黄曲霉毒素B样品进行定性分析，适用于阳性样品的初筛，不能准确定量。本标1 准项目是通过化学合成法制备黄曲霉毒素B人工抗原，利用此抗原免疫实验动物制备黄曲霉1 毒素B单克隆抗体，基于此原料基础上开发黄曲霉毒素B快速检测试纸条，再通过胶体金读11 数仪进行大米、玉米、小麦样品中黄曲霉毒素B的定量分析。本标准有助于提高粮食样品检1 测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。 1工作简况 1.1任务来源及起草单位 本行业标准是在2012年12月国家粮食局标准质量中心组织对美国Charm公司开发的ROSA真菌毒素快速定量测试系统进行测试验证，并对验证结果进行专家评审通过的基础上提出并立项。根据国家粮食局标准质量管理办公室质检办便函[2014]15号文件《关于下达2014年粮油行业标准制定的》的要求，由湖北省粮油食品质量监测站牵头负责《粮油检验 粮食中黄曲霉毒素B检测 胶体金快速定量法》的起草工作。起草单位成立了标准1 起草组负责进行本标准的各项工作。 1.2标准研制主要工作过程 (1)根据该标准的特点，2014年5月，查询了国内外资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并在湖北省武汉市召开了第一次专家研讨会，与会专家针对标准文本草案和编制说明等提出了修改意见和建议。 (2)2014年7月，采用不同厂家的胶体金定量方法上进行验证，并编写了《粮油检验 粮食中黄曲霉毒素B检测 胶体金快速定量法》，并在山西太原召开了第二次起草小组讨论1 会，标准起草单位对所拟标准草案和编制说明作编写介绍，并对其说明进行了详细审校和充分讨论。 (3)2014年 9月，形成标准的送审讨论稿。 2标准的编制原则和标准的主要内容 2.1标准编制原则 本标准是根据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写规则》和GB/T20001.4-2009《标准编写规则第4部分:化学分析方法》的规定进行编制的。 2.2确定标准主要内容 鉴于目前能够形成商业化胶体金快速定量技术，且经过国家粮食局标准质量中心组织通过验证测试的公司只有北京博欧实德生物技术有限公司，因此本标准的具体操作方法参照该公司的Charm ROSA真菌毒素快速检测仪的具体操作方法作为模版，按照国际标准的惯例，标注“美国Charm公司生产的ROSA胶体金快速定量检测卡室通过粮食行业验证的产品，提供此信息仅为了方便本标准的使用者，而并不是对ROSA真菌毒素快速定量检测系统的认可。任何可以得到与其方法结果相同的产品均可使用”的说明，确保对其它厂家胶体金快速定量产品也能同样适用于此标准。 2.2.1测定原理 胶体金快速定量法以免疫层析法为原理，以70%甲醇溶液提取样品中的黄曲霉毒素B，1在恒温条件下，提取液中的黄曲霉毒素B与检测条中有颜色微粒反应。反应完成后，使用1 读数仪读取检测区域的颜色强度，根据颜色深浅计算出样品中黄曲霉毒素B的含量。 12.2.2适用范围 本标准规定了胶体金法测定谷物及其制品中黄曲霉毒素B的条件和详细分析步骤。 1 本方法适用于小麦、大米和玉米等谷物中黄曲霉毒素B快速定量筛查的测定，检测限1 为2μg/kg。 2.2.3关于样品制备的要求 理论上讲样品颗粒的大小与样品的均匀性以及毒素的提取效率有关，当样品细度不足20目时，真菌毒素的提取效率较低，因此国家标准方法中真菌毒素检测的制样一般都要求制备至少500g，全部通过20目筛，本行业标准直接采用，从测试数据看，能够满足方法需求。 2.2.4方法线性范围与检出限 以高效液相色谱法检测结果为横坐标，ROSA快速测试条法的检测结果为纵坐标，计 算线性范围:5 ppb,100ppb(5点); 回归方程: y=x-0.64;相关系数r为0.9993(见图1)。 图1:黄曲霉毒素BHPLC和胶体金(ROSA)两种方法检测值线性关系 1 取24个无污染(阴性)样品的测定结果进行计算，检测限(LOD)为测定平均值加3倍标准偏差，定量限(LOQ)为测定平均值加10倍标准偏差。测试结果明，AFB的LOD为12ppb，LOQ为5ppb(见表1)，因此，本标准规定检出限为2μg/kg。 2.2.5方法精密度 6个参与测试人员在相同实验室，按照同一方法，采用不同设备，检测相同样品，重复测定的变异系数在15.7%,26.4%，平均变异系数为21.9%(见表1)。 表1:黄曲霉毒素B检测数据分析表 浓度单位:ppb 1 胶体金检测结果 序样品样品参考标准偏变异系正确度平均值 号 名称 来源 浓度 差 数(%) (%) 北京 山西 河南 安徽 湖北 陕西 1 阴性 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0.2 0.42 / / 2 阴性 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 3 2.17 1 1 1 1 2 2 1 2 3 2 1 1 1.5 0.67 / / 4 5.24 3 4 3 4 5 5 4 6 5 6 7 5 4.75 1.22 25.6 90.6 玉米 CHARM 5 10.1 8 10 12 9 12 7 9 10 8 7 7 7.5 1.84 24.5 74.3 19 6 20.6 22 20 21 28 20 20 24 15 17 21 19 19 20.5 3.29 99.5 20.7 7 20.6 24 28 27 30 20 16 26 21 19 20 14 15 21.7 5.31 105.2 8 93.2 80 91 91 125 102 99 95 99 90 85 61 93 92.6 14.93 16.1 99.3 10 小麦 CHARM 5 6 7 5 7 5 7 6 4 5 5 3 4 5.3 1.30 24.4 106.7 12 CHARM 10 12 18 17 12 14 12 13 15 14 12 13.9 2.18 15.7 139.0 2 2 大米 13 北京 5.7 4 4 4 4 6 7 5 4 5 4 3 3 4.4 1.16 26.4 77.5 平均值 21.9 99.0 备注:1采用玉米的阴性样品24个测定值计算LOD为2ppb，LOQ为5ppb;2、经Grubb检验，斜体数据为异常值,剔除。 2.2.6 方法准确性 2.2.6.1与标准方法参考值比较 胶体金胶体金快速定量法与高效液相色谱标准方法分别对9组阳性样品进行检测，采用 配对t检验法比较两种方法的检测结果是否存在显著性差异。经计算，t=0.41，查t分布D 表，t=2.31，t=0.41< t=2.31，说明液相色谱参考值与胶体金快速定量法测定值之0.05,8D0.05,8 间无显著差异(见表2)。 表2:黄曲霉毒素B:配对t-检验表 浓度单位:ppb 1 ROSA检测结果 参考浓平均序号 D i度 值 北京 山西 河南 安徽 湖北 陕西 1 2.17 1 1 1 1 2 2 1 2 3 2 1 1 1.5 -0.7 2 5.24 3 4 3 4 5 5 4 6 5 6 7 5 4.75 -0.5 3 10.1 8 10 12 9 12 19 7 9 10 8 7 7 9.8 -0.3 4 20.6 22 20 21 28 20 20 24 15 17 21 19 19 20.5 -0.1 5 20.6 24 28 27 30 20 16 26 21 19 20 14 15 21.7 1.1 6 93.2 80 91 91 125 102 99 95 99 90 85 61 93 92.6 -0.6 7 5 6 7 5 7 5 7 6 4 5 5 3 4 5.3 0.3 8 10 12 18 17 12 14 12 13 15 14 12 \ \ 13.9 3.9 9 5.7 4 4 4 4 6 7 5 4 5 4 3 3 4.4 -1.3 D均值 0.2 s 1.54 D t 0.41 D t 2.31 0.05,8 2.2.6.2正确度 将高效液相色谱法的测定结果作为认定值，胶体金快速定量测试条的测定结果与之比 较，按正确度(%)=检测值/认定值×100计算。正确度范围在74.3%,139%之间，平均为99% (见表1)。 2.2.7 方法特异性 选取阴性玉米样品，加入黄曲霉毒素B标准溶液(添加浓度50μg/kg)、呕吐毒素标准1 溶液(添加浓度10μg/kg)、伏马毒素标准溶液(20μg/kg)、赭曲霉毒素标准溶液(添加 浓度μg/kg)、玉米赤霉烯酮标准溶液(添加浓度20μg/kg)。除添加黄曲霉毒素B样品读1 值为55ppb以外，其余样品测定结果均为阴性。 实验结果表明，黄曲霉毒素B胶体金试剂条对伏马毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素、玉米1 赤霉烯酮并无交叉反应，其方法特异性可以满足检测要求。 2.2.8应用验证 2.2.8.1加标回收实验 为了验证胶体金快速定量法在实际工作中对天然样品黄曲霉毒素B的测定准确性，起草1 小组对不同粮种限量限进行了加标回收试验，由于小麦未找到天然阳性样品，同时做了低浓 度加标回收试验，测定结果见表3。 表3 不同粮种加标回收实验 加标量 测定结果 平均值 回收率 粮 种 (μg/kg) (μg/kg) (μg/kg) (%) 大 米 10 7 8 7.5 75 2.5 3 2 2.5 100 小 麦 5 3 6 4.5 90 玉 米 20 18 18 18 90 2.2.8.2准确性验证 同时，起草小组选取参考物质和以高效液相法测定结果定值的天然阳性玉米和稻谷及不 同粮种天然阴性样品进行测定，考察胶体金快速定量法的测量准确性，测定结果见表4。 表4 胶体金快速定量法与高效液相色谱法测定粮食中黄曲霉毒素B配对t检验表 1 参考浓度 检测结果 平均值 标准 序号 品种 样品类型 t 差值 均值d td0.05,11(μg/kg) (μg/kg) (μg/kg) 偏差Sd 1 天然阳性 39 28 43 35.5 3.5 2 天然阳性 94 87 90 88.5 5.5 3 天然阳性 85 73 79 76 9 玉米 4 天然阳性 26 28 29 28.5 -2.5 5 天然阴性 0 0 0 0 0 6 参考物质 10.1 9 10 9.5 0.6 1.55 3.38 0.45 2.2 7 小麦 天然阴性 0 0 1 0.5 -0.5 8 天然阴性 0 0 1 0.5 -0.5 9 天然阳性 3 4 3 3.5 -0.5 10 稻谷 天然阳性 12 14 14 14 -2 11 天然阳性 34 34 30 32 2 12 天然阳性 70 65 67 66 4 结 论 胶体金快速定量法测定粮食中黄曲霉毒素B测试结果与高效液相色谱法测定结果无显著性差异 1 2.2.8.3重复性验证 使用同一批次的胶体金快速定量检测条分别对不同粮种同一样品进行重复测试，考察胶 体金快速定量法对不同粮种中黄曲霉毒素B测定的重复性，测试结果见表5。 1 表5 胶体金快速定量法对不同粮种中黄曲霉毒素B重复性测定结果 1 变异检测结果(μg/kg) 平均值 粮 种 标准偏差 系数(μg/kg) 1 2 3 4 5 6 (%) 11 11 14 11 14 10 11.8 1.7 14.6 稻 谷 *5 4 6 4 5 5 4.8 0.8 15.6 小 麦 28 29 27 29 24 22 26.5 2.9 10.9 玉 米 注:由于未收集到小麦天然阳性样品，对加标样品进行测试。 3采用国际标准和国外先进标准的情况～以及与国际、国外同类标准水平的对比～或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况 本方法的检出限为2ng/g，定量下限为5 ng/g，具有较高的精密度、准确性和特异性;通过简单的样品前处理，测试条点样、孵育器孵育、读数仪读数这几个步骤，15min之内就能完成一个样品的测定，方法要求条件低，操作简单。实验结果表明，均能满足粮食中黄曲霉毒素B测定的要求，易于推广应用。 1 4 与有关的现行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系 本标准颁布实施后，针对粮食中黄曲霉毒素B的测定，符合现行的法律法规和强制性1 (国家、行业、地方)标准要求。 5 重大分歧意见的处理经过和依据 无。 6 按照标准化法的有关规定～提出强制性标准或推荐性标准的建议 建议将本标准列为推荐性行业标准。 7 废止现行有关标准的建议 无 8 其他应予说明的事项 无 9 参考文献 [1] 叶雪珠,王小骊,赵燕申,等.黄曲霉毒素B检测方法分析[J].食品与发酵工1 业,2003,(3):26-29. 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