多酚类化合物与牛血清蛋白相互作用的研究（可编辑）

多酚类化合物与牛血清蛋白相互作用的研究（可编辑） : :.,. 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下,独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外,本论文不包 含其他个人或集体已经发或撰写过的研究成果,也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名:王婧 日期珈侈年月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 、保密口,在年解密后适用本授权书。 、不保密口。 请在以上相应方框内打“?” 作者签名:工靖 日期:?了年 月为日 日期:必,;年 ‘月, 日 导师签名:毛麦屯岳浙江工业大学硕士论文 多酚类化合物与牛血清蛋白相互作用的研究 摘要 本论文采用光谱技术包括荧光光谱法、同步荧光法、圆二色谱法和紫外.可 见光谱法和分子模拟技术相结合的方法,研究了多酚类化合物与牛血清白蛋白 的相互作用。 实验结果表明,矢车菊素..葡萄糖苷..及异甘草素对 的猝灭类型均为静态猝灭。.及与的结合位点数约为,形成: 结合物。时,与..和的结合常数分别为.×和.×。 由与.和结合过程中热力学参数测定结果表明,与、 的结合过程是一个自发过程。而且,焓变?和熵变均 为负值,表明了与.及结合过程中的主要作用力是氢键和范德华 力。 从圆二色谱及同步荧光结果可知,..与结合后,对的二级结 构影响较小。而与结合后,二级结构及色氨酸和酪氨酸附近的微环 境可能发生了改 变。 分子模拟结果表明,一结合在的 ’位上,且.与上 的,,,残基形成了氢键。而结合在的 位上,与上的,,,残基形成了 氢键。并且,结合前后客体分子一和的构象发生明显变化。 关键词: 矢车菊素一一葡萄糖苷,异甘草素,牛血清白蛋白,光谱法,分子对接浙江工业大学硕士论文 ,,. ?一 .一一 , :. . .. . ’. ,,...... 浙江工业大学硕士论文 .? 。 , 一一 ,. ,, , . ,, , ,. :一,,, ,浙江大学硕士论文 目录 摘要.... 第一章绪论?。 .血清白蛋白 ..血清白蛋白的结构?. ..血清白蛋白的功能?. .多酚类化合物..多酚类化合物的分类. ..多酚类化合物的生物学作用. .研究方法?. ..荧光光谱法?. ..同步荧光法?. ..紫外.可见吸收光谱法 ..圆二色谱法?. .分子对接技术心.. ..分子对接原理. ..分子对接方法分类及常用软件??. ..蛋白质序列和结构数据库?. ..能量优化算法 ..本论文中使用的对接方法介绍.本课的研究意义??.. ..国内外研究现状..研究意义 第二章光谱法研究矢车菊素..葡萄糖苷及异甘草素与牛血清蛋 白相互作用?。 .前言?一 .实验部分.. ..试剂和仪器? ..荧光测定 ..同步荧光测定 ..距离测定 ..竞争实验..圆二色谱的测定.结果与讨论??.. ..荧光猝灭及其机理? ..结合常数、结合位点数及热力学常数的确定..结合过程中牛血 清蛋白结构的变化 ..结合位点的确定..距离的确定? 。本章小结?浙江工业大学硕士论文 第三章分子模拟法研究.及与相互作用?. .前言?.. .分子模拟? ..分子模拟过程中用到的数据库与软件..药物与蛋白结构的下 载与优化..分子对接.结果与讨论??.. .. 方法模拟矢车菊素..葡萄糖苷与牛血清白蛋白作用过程.. 方法 对异甘草素与牛血清白蛋白作用过程的模拟.本章小结~ 第四章结论与展望. .结沧. .展望. 参考文献? 攻读硕士学位期间已发表的论文:??。 【谢?..??.??.. 浙江工业大学硕士论文 第一章绪论 .血清白蛋白 ..血清白蛋白的结构 入血清白蛋白 ,简称是由个氨基酸组成 的单链蛋白质,分子量为 。在血浆中其浓度为 /,约占血浆总蛋白 的%。成熟的人血清白蛋白是一个心形分子,由个结构相似的伐. 螺旋结构 域组成见图。 牛血清白蛋白 ,简称包含个氨基酸残基 ,结构与类似,分为个结构域,见图。的个结构域分别为: 结构域.、结构域 、结构域.。其中每个 结构域又分为、两个亚结构域,药物经典结合位点 位于亚结构 域, 位于亚结构域。 图人血清白蛋白结构 扛 . 浙江工业大学硕士论文 图牛血清白蛋白结构 . 由于牛血清白蛋白具有与人血清白蛋白相似的序列和构型, 且有内源性荧光,因此成为研究药物与蛋白相互作用的首选底 物。 ..血清白蛋白的功能 蛋白质是药物发挥药效的重要载体和靶分子,血清白蛋白是人和 动物血浆中 含量最丰富的蛋白质【】,它在生物体内有维持胶体渗透压,运输激素、脂肪酸、 药物、酶、代谢产物,结合金属离子,防止叶酸的光降解等多种功能。 许多药物能够与血清白蛋白可逆性的结合。结合后的药物不易穿透毛细血管 壁、血脑屏障及肾小球等多种生物膜,从而对药物在体内的分布与代谢产生重要 影响【】。同时,药物与白蛋白的结合率和结合能力的不同决定了药物储留于血浆 中含量的不同,从而影响到药物的药效发挥。药物与血清白蛋白结合能力强,血 液中的游离药物少,因此其生理活性较低。当游离药物通过各种途径消除时,循 环系统中的药物.血清白蛋白结合物发生解离,补充游离药物,从而延长药物作 用时间。因此,血清白蛋白结合水平可以影响药物的半衰期,在临床上具有重要 意义。浙江工业大学硕士论文 考察具有药理活性的小分子与血清白蛋白的相互作用及作用机理,对于了解 药物的转运和代谢过程、阐明药物小分子与生物大分子相互作用的本质、蛋白质 结构与其功能间的关系具有重要意义 .多酚类化合物 ..多酚类化合物的分类 多酚类化合物是分子结构中有若干个酚羟基的成分的总称,它广泛存在 于植物体内【】如茶、豆类、蔬菜、水果和中药材,常见的多酚有葡萄多酚 【、茶多酚【、苹果多酚【 、花卉多酚【】。 多酚类化合物种类繁多,其中按照化学结构中碳原子骨架进行分类【】,较 为容易掌握。多酚主要类别见表。 表多酚类化合物主要类别 浙江工业大学硕士论文 续表多酚类化合物主要类别..多酚类化合物的生物学作用 多酚类化合物具有良好的清除自由基能力:生物体内自由基主要包括 超氧阴离子自由基‘?、羟自由基?、分子氧、单线态氧、 过氧化氢以及脂质过氧化物、、等【】,是导致衰老和许 多疾病发生的直接原因。多酚类物质都有一定量的?基,可形成有抗氧化作 用的氢自由基?,能够清除体内的有害自由基,从而保护机体组 织。 多酚类化合物具有抗肿瘤侵袭与转移能力:肿瘤的侵袭与转移是恶性 肿瘤的基本特征,是临床肿瘤患者%以上死亡的最主要原因。近年来研究发 浙江工业大学硕士论文 现,许多天然多酚衍生物具有良好的抗肿瘤侵袭与转移活性【。如:姜黄素能 抑制黑色素瘤细胞.诱导的肺小瘤的形成;紫檀芪能显著抑制十四烷酰佛 波醇乙酯诱导的人肝癌细胞的侵袭、迁移和转移;刺槐素通过灭活 促分裂原活化蛋白激酶的信号通路,可抑制人前列腺癌细 胞的转移。 多酚类化合物具有抗衰老能力:自由基学说认为【】,人衰老时体内清 除自由基的防御机制下降,导致体内自由基调控失衡;自由基过量引起不饱和脂 肪酸的过氧化,造成磷脂膜破坏,使细胞衰老至瓦解,直到组织坏死,从而出现 各种病症。多酚类化合物能够形成氢自由基,清除体内有害的自由基,从而延缓 衰老。 多酚类化合物具有抗菌能力: 多酚类化合物具有广谱杀菌作用。刘开 华等四研究了茶多酚、葡萄籽提取物、 苹果多酚的抑菌效果,结果显示,三种 植物多酚对供试菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酿酒酵母、青霉菌 都有一定的抑菌作用,抑菌活性范围较宽,且经。、?、?水浴处 理 后仍能保持原有的抗菌效力。 多酚类化合物具有保护心脑血管能力:多酚类物质对心脑血管的保护 作用是通过多种途径和多种机制实现的,其中最主要的是抗氧化作用和对血脂和 血管功能的影响【】。焦淑萍【等人在大鼠心肌线粒体自由基损伤的体外实验中 观察到,山葡萄多酚对心肌线粒体氧化损伤具有保护作用; 【 】等人研究表明,长期摄入富含儿茶酚的饮料对预防动脉粥样硬 和 化有积极的作用;红酒多酚类被证实对小鼠和兔的主动脉和人的冠状动脉有扩血 管活性,而其他来源的植物多酚类体现了相似的活性。 .研究方法 ..荧光光谱法 荧光猝灭过程可分为静态猝灭和动态猝灭【。荧光物质的激发态分子 与猝灭剂之间发生相互作用引起的猝灭过程称为动态猝灭。动态猝灭过程中,处 于激发态的荧光物质通过与猝灭剂分子的碰撞作用,以能量转移的机制或电荷转浙江工业大学硕士论文 移的机制丧失其激发能而返回基态。荧光物质的基态分子与猝灭剂之间发生 相互作用引起的猝灭过程称为静态猝灭。荧光物质分子与猝灭剂在基态时发生配 合反应,形成不发光的基态配合物,配合物即使在激发态时解离而产生发光的型 体,一般也是经由非辐射能量转移的途径衰变到基态。 实验过程中,随着溶液浓度的进一步增大,将会出现荧光强度不仅不随溶液 浓度线性增大,有时随着浓度的增大荧光强度反而下降的现象,导致这种现象的 原因为浓度效应。浓度效应产生的原因有【】:内滤效应。当测定溶液浓度 过高时,溶液中杂质对入射光的吸收作用增大,相当于降低了激 发光的强度。 溶液浓度过高时,入射光大部分被液池前部的荧光物质吸收,处于液池中、后部 的荧光物质受到的入射光减弱,由于仪器的探测窗口是对准液池中部的,从而导 致到的荧光强度下降。因此,为了除去浓度效应的影响,荧光测得的数据均 应进行校正。 ..同步荧光法 同步荧光法与常用的荧光光谱法最大的区别是激发和发射波长同时扫描,光 谱图由测得的荧光强度信号与对应的激发波长或发射波长构成,称为同步荧 光光谱。根据激发和发射两种波长在同时扫描过程中彼此间所保持的关系,可将 同步荧光法分为如下四种类型【】: 第一种类型称为恒固定波长同步荧光分析法. ,,该方法激发和发射两个单色器 波长同时扫描,扫描过程中使激发波长和发射波长间的波长间隔 九踯,懿常数保持固定,这种方法习惯上简称同步荧光法,是最早提出的一 种同步扫描技术; 第二种类型称为恒能量同步荧光分析法 ,,是以能量关系代替波长关系,同时扫描激发 和发射两个单色器波长,扫描过程中使激发波长与发射波长之间的能量差保持固 定; 第三种类型称为可变角或可变波长同步荧光法. ,,该方法在测绘同步荧光光谱时,激发和发射浙江工业大学硕士论文 两个单色器同时进行扫描,但扫描的速率不同; 第四种类型称为恒基体同步荧光法,,其扫描路径表现为基体将干扰物视为基体 的等荧光强度线。 本论文中使用的同步荧光分析法为第一种类型,即固定波长同步荧光分析 法。 ..紫外.可见吸收光谱法 紫外.可见吸收光谱法是利用某些物质的分子吸收 /光谱区 为可见光区的辐射来进行分析的方 为近紫外光区,~ 法【。这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级问的跃 迁,广泛用于有机和无机物质的定性和定量测定。 ..圆二色谱法 圆二色谱法测量生物大分子,可得到其二级结构信息,一般用于蛋白质折叠、 蛋白构象、/反应、酶动力学、光学活性物质纯度测量等相关的科学研 究。 光谱一般分为两个波长范围,~ 为远紫外区光谱, 为近紫外区光谱‘。不同的蛋白质具有不同的二级结构,因此所产生 谱带的位置、吸收的强弱都不相同。.螺旋结构有一正的谱带在靠近 处和两个负的特征肩峰谱带在和 处;折叠的谱有一负谱 带在 处和一正谱带在~ 处;转角有一正谱带在 附近】。因此,蛋白质或多肽链的二级结构信息,可根据所测得蛋白 质或多肽的远紫外谱反映出。 .分子对接技术 ..分子对接原理【】 分子对接是指两个或多个分子按照能量互补、几何互补以及化学环境互补的浙江工业大学硕士论文 原则进行相互识别的过程。分子对接考虑了受体结构信息以及受体和配体分子之 间发生的相互作用信息,找出受体与配体的最佳结合方式。因此,与仅仅从配体 结构出发的药物设计方法相比,分子对接更加合理。 分子对接过程常用的化合物库【】: 化学品目录数据库 ,剑桥晶体结构数据库 , 世界药物索引 , 综合药物化学数据库 , 药物数据报道数据库 , 近年来,随着计算机技术的发展及商用小分子数据库的不断更新,分子对接 已经成为基于结构药物分子设计中最为重要的方法。 ..分子对接方法分类及常用软件 分子对接方法一般分为三类代表性分子对接方法见表: 表代表性的分子对接方法‘】浙江工业大学硕士论文 柔性对接:在对接过程中,体系中所有分子的构象基本上都可以自由 变化。一般用于精确考虑分子间的识别情况。由于计算过程中分子的构象可以变 化,所以计算耗费最大。 半柔性对接:指在对接过程中,允许研究体系尤其是配体的构象 在一定的范围内变化。常用来处理大分子和小分子间的对接,对 接过程中,一般 . 是小分子的构象可以变化,但大分子是刚性的。 刚性对接:是最初的分子对接方法,在对接过程中,研究体系的构 象 不发生变化。适合考察比较大的体系,如蛋白质和蛋白质问以及 蛋白质和核酸之 间的对接。 ..蛋白质序列和结构数据库‘】 .蛋白序列数据库和,.是经过注释的蛋 白质序列数据库,由瑞士生物信息学研究所维护。.: ://...// 国际蛋白质序列数据库是由蛋白质信息资源 ,、慕尼黑蛋白质序列信息中心和日本国际蛋白质序列数 : 据库共同维护的最大的公共蛋白质序列数据库。 ://... 蛋白质三维结构数据库 ,是美国 国家实验室建立的国际上重要的生物大分子结构数据库。: ://.., 蛋白质结构分类数据库 详细描述了已知的蛋白质结构之间的关系。将蛋白质分为根、类、 折叠、超家族、家族、蛋白、 种个层次。:://....// 数据库收集了对生物学有显著意义的蛋白质位点和序列模式 信息,并能根据这些位点和模式快速、可靠地鉴别一个未知功能的蛋白质序列应 该属于哪一个蛋白质家族。:://..//浙江工业大学硕士论文 ..能量优化算法【】最速下降法 最速下降法历史悠久,其基本思想是,从任意起始点开始,沿着目标函数在 该点的负梯度方向,也即目标函数的最速下降方向,多次迭代即可找到局域的极 小值。这种方法算法简单、计算量小但是收敛性不够好,其收敛速度正比于目标 函数的条件数最大本征值与最小本征值的比,因此如果条件数太大的话,其 收敛将会变得很慢。 共轭梯度法 共轭梯度法对最速下降法的优化方向做了改进,优化方向不再是仅仅依赖于 目标函数的负梯度方向,而是取决于本次迭代时的负梯度方向与 上次迭代的负梯 度方向的线性组合。这样共轭梯度法就能更准确地确定优化方向减小计算量。共 轭梯度法在复杂问题的表现上优于最速下降法。两者经常结合起来使用,先用最 速下降法处理,然后用共轭梯度法做进一步的优化。 牛顿.拉夫逊方法. 牛顿.拉夫逊方法又称为牛顿法’ ,它是一种利用二级导数 求解极值的方法。对于具有二次型的函数均可用这种方法求解极值,例如能量函 数。但是当能量函数远离二次时,这种方法很容易失稳,并且在能量最优化过程 中,牛顿法每次都要对矩阵求逆计算代价相当高。因此,这种方法一般 用于最速下降法优化之后使之收敛的手段。 模拟退火 模拟退火的原理与金属退火的原理近似,它以解空间里任意一点为起始搜索 新的解,如果新解优于原有解则肯定会被接受,否则只有很小的概率被接受,当 新解被接受时则用新解代替原有解开始下一轮的搜索,如果新解被拒绝时则在原 有解的基础上继续搜索。 模拟退火算法与初始值无关,并且具有固有的并行性和渐进收敛性是一种不 错的求全局最优解的方法。 遗传算法 遗传算法是借鉴了生物进化现象而发展起来的一种算法。在遗传算法中,优 化问题的解被称为“个体”,它由一系列“染色体”组成,“染色体”一般是简单的字浙江工业大学硕士论文 符串或者数字串。一开始,算法随机产生一定数量的“个体”或者人为确定生成, 就是“种群”。然后“种群”中的每个“个体”都被评价,通过适应度函数也叫目标 函数获得一个适应度数值,再根据适应度排序。接下来是产生下一代种群的过 程。算法会根据“种群”中“个体”按照一定的概率进行“交配”,“交配”的过程就是 将“父母”、“染色体”中某部分随即交换产生两个新的“个体”代替原来的“个体”, 这个过程中的某个字节由变为,或者由变为。这样就得到了一个新的“种 群”,然后进入下一轮的评价.选择.“繁殖”。整个过程与自然界 的进化类似,最好 的“个体”总是最多地被选择产生下一代,而适应度低的“个体”则逐渐被淘汰。 遗传算法最擅长的就是求解全局最优化问题,如果参数设置得恰当它能够跳 出局部最优而找到全局最优点,因此在许多领域得到了广泛的应用。 最速下降法、共轭梯度法和牛顿.拉夫逊方法在寻找局域极小值中表现很好, 但是在解决全局最优问题时却很难实现。因此,解决全局最优问题时常用模拟退 火和遗传算法两种方法。 ..本论文中使用的对接方法介绍 本论文中使用的对接软件为 .,是的科研小组开 发的分子对接软件包【,采用模拟退火和遗传算法来寻找受体和配体的最佳结 合位置,用半经验的自由能计算方法来评价受体和配体之间的匹配情况。 软件对接过程【】: 准备蛋白质和配体:在蛋白质结构格式的基础上,去水,加 氢,加电荷。在配体分子格式的基础上,去水,加氢,加电荷。将蛋 白 质和配体分子转换成格式。 计算格点能量:创建 和 文件,计算格点空间的能量图。 对接计算:最早的版本中寻找结合方式的方法为模拟退火,.以后的 版本中加入了拉马克遗传算法,将遗传算法和局部搜索相结合,遗传算 法用于全局搜索,局部搜索优化能量。浙江工业大学硕士论文 .本课题的研究意义 ..国内外研究现状 近几年,国内外研究药物与血清蛋白、等生物大分子相互作用的主要 方法有:紫外.可见光谱法、荧光光谱法、圆二色谱法等。 等年采用荧光与紫外联用的方法,研究了聚酯型儿茶素 与人血清白蛋白间的相互作用,得出聚酯型儿茶素与人血清白蛋白之间的结合位 点数为,并计算了热力学常数的变化。 等 年采用荧光光谱法和紫外.可见光谱法研究了柚皮素 与牛血清白蛋白之间的作用,两者之间的作用力主要为静电引力,结合位点为 。 ,柚皮素与之间的结合距离为. 丁成荣等年通过紫外和圆二色性光谱,研究了三环唑与牛血清 白蛋白的相互作用,表明三环唑与之间主要为疏水作用,且疏水作用 使的肽链发生收缩、重排。 .等年【采用圆二色谱法研究了多酚类化合物与人血清白蛋 白间的相互作用,结果表明,结构差异能够显著影响化合物与人血清白蛋白的结 厶 : .等年采用荧光法研究了儿茶素、表儿茶素、锦葵色素.. 葡萄糖苷、原花青素低聚物等与人血清白蛋白之间的相互作用,并计算出了各化 合物与人血清白蛋白之间的结合常数。 近两年,开始有文献将分子对接技术应用到药物与蛋白相互作用的研究中。 等 年【使用分子对接软件研究了黄酮类化 合物黄豆苷元、黄豆苷元衍生物、金雀异黄酮、柚皮素、槲皮黄酮与人血清 白蛋白之间的相互作用。 等年】采用分子对接软件研究了四种黄酮类化合物 黄岑素、黄岑苷、汉黄芩素、灯盏乙素与牛血清白蛋白之间的相 互作用。结 果显示,黄芩素中的氧原子与的之间形成氢键;黄芩苷.和.上 的氧原子与的之间形成氢键,位糖取代基中两个上的氧原子分别 与谷氨酸中的形成氢键,一个上的氢原子与赖氨酸的之浙江工业 大学硕士论文 间形成氢键;汉黄芩素的.氧原子与的之间形成氢键,的氧原 子与的之间形成氢键;灯盏乙素的位氧原子与之间形成氢键, 的氧原子与之间形成氢键,的氧原子与之间形成氢键,位糖取 代基中的氧原子与,,形成氢键。 等年用分子对接软件研究了茜素红与牛血清白蛋 白之间的相互作用,结果显示,茜素红通过与残基、、 、、形成氢键的方式,结合在亚结构域。 等年采用分子对接软件研究了哈尔满 与牛血清白蛋白之间的作用,结果显示,哈尔满中的与中的 羰基氧形成氢键。 等年】使用分子对接软件研究了.氨基安替比林 与牛血清白蛋白之间的作用,结果显示通过静电引力作用结合在 的?亚结构域,具体发生作用的残基为和。 ..研究意义 本论文采用光谱技术包括荧光光谱法、紫外.可见光谱法和圆二 色谱法 和分子模拟技术相结合的方法,研究多酚类化合物与牛血清白蛋 白的相 互作用。根据.方程判断猝灭类型,再利用静态猝灭公式得到结合常 数、结合位点数,,并利用’ 肪程判断出多酚与之间的作用力类型, 探讨多酚与牛血清白蛋白的作用方式。并采用软件研究多酚 与之间的分子对接,将光谱实验和分子对接理论研究结果进行比较,两者相 互补充,从实验和理论两方面来研究多酚类化合物与之间的相互作用。这有 助于了解具有药理活性的多酚类化合物在体内的运输和分布情况,为多酚类化合 物在体内的作用机理、动力学和毒理学研究奠定理论基础,对于联合给药有指导 意义。浙江工业大学硕士论文 第二章光谱法研究矢车菊素..葡萄糖苷及异甘草素与牛血 清蛋白相互作用 .前言 矢车菊素一葡萄糖苷一,结构见图属于花青素类,是天然存在的 多酚类物质。花青素类广泛分布于紫甘薯,樱桃?,彩色水稻,黑莓和 蓝莓‘,黑加仑子【舢】,紫色和红色的葡刹等植物中,是具有保 健功能的活 性成分,研究表明:花青素类物质具有清除体内自由基、抗氧化、预防心脑血管 疾病、降低血清胆固醇、抗变异及抗肿瘤等作用】。 图矢车菊素葡萄糖苷..结构. 一 异甘草素,结构见图为异黄酮类化合物,存在于甘草【】,黄芪【,, 构树例,降香檀‘硎,小叶云实【】,串果斛,香花崖豆藤‘,云南豆腐柴【删等 植物中。异甘草素具有抗癌,抗炎,抗氧化,美白,保护心脑血管,保肝等多种 作用【,药理活性较为广泛。 图异甘草素结构. 浙江工业大学硕士论文 本章采用光谱方法对矢车菊素..葡萄糖苷及异甘草素与牛血清白蛋白之间 的相互作用进行研究,以期获取有关矢车菊素..葡萄糖苷及异甘草素与牛血清 白蛋白相互作用信息。 .实验部分 ..试剂和仪器 荧光分光光度计上海棱光技术有限公司;荧光分光光度计 公司;圆二色谱仪公司;紫外.可见分光光 度计公司;.电热恒温水浴锅海精宏实验设备有限公司: 雷磁.型数显计上海精密科学仪器有限公司。 .缓冲液:称取. 三羟基甲基氨基甲烷上海博伯生物科技有 容量瓶中定容。 限公司溶于水中,用调节为.,再于 醋酸缓冲液:称取. 醋酸钠温州润华化工实业公司溶于水中,用 容量瓶中定容。 冰醋酸调节为.,再于 矢车菊素..葡萄糖苷溶液:准确称量. 矢车菊素..葡萄糖苷浙江 容量瓶中定容, 工业大学药学院溶于水中,用调节为.,并于 配制成. /的矢车菊素..葡萄糖苷母液。将溶液保存于以下,使用时 根据所需进行稀释。 牛血清白蛋白溶液:称取. 牛血清蛋白上 氯化钠和. 海神航生物科技有限公司,置于 容量瓶中,用.缓冲液定容, 配制成 /.储备液。将溶液保存于。以下,使用时根据所需进 行稀释。 异甘草素溶液:称取. 异甘草素阿拉丁试剂有限公司,置于 容量瓶中,用无水乙醇定容,配制成?/的异甘草素储备液。将溶 液保 存于?以下,使用时根据所需进行稀释。 牛血清白蛋白溶液:称取. 氯化钠和. 牛血清蛋白上 海伯奥生物科技有限公司,置于 容量瓶中,用.缓冲液定容, 配制成. /的.储备液。将溶液保存于。以下,使用时根据浙江工业大学硕 士论文 所需进行稀释。 保泰松溶液:称取. 保泰松湖北恒硕化工有限公司,置于 容量瓶中,用无水乙醇定容,配制成. /的保泰松储备液。 布洛芬溶液:称取. 容 布洛芬浙江工业大学实验室,置于 量瓶中,用无水乙醇定容,配制成. /的布洛芬储备液。 实验所用其它试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。 ..荧光测定 于 容量瓶中依次加入一定量的溶液及..溶液,用醋酸缓 冲液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。然后置恒温 水浴在一定 温度下恒温 后测定其荧光强度。 于 容量瓶中依次加入一定量的溶液及溶液,用. 缓冲液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。然后置恒 温水浴在一 定温度下恒温 后测定其荧光强度。 测定时,选用 激发光源,在~ 范围进行扫描。比色皿厚 。 度 ,狭缝宽度为 表荧光实验中.溶液浓度浙江工业大学硕士论文 表荧光实验中溶液浓度 ..同步荧光测定 于 容量瓶中依次加入一定量的溶液及一溶液,用醋酸缓 冲液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。在室温下放 置 后测 定其荧光强度。 于 容量瓶中依次加入一定量的溶液及溶液,用. 缓冲液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。在室温下 放置 后 测定其荧光强度。 测定时,采用九 ,在? 范围进行扫描。采用?柠 , 。 在~范围进行扫描。比色皿厚度 ,狭缝宽度为 ..距离测定 于 容量瓶中加入溶液,用醋酸缓冲液稀释至刻度并摇匀,配制 后测定其荧光强度。 成.“/的溶液。在室温下放置 于 容量瓶中加入及.溶液,用醋酸缓冲液稀释至刻度并 /的溶液。在室温下放置 后测 摇匀,配制成含及一均为. 定其荧光强度。浙江工业大学硕士论文 于 容量瓶中加入.溶液,用醋酸缓冲液稀释至刻度并摇匀,配 后测定其吸光度。 制成.肛/的.溶液。在室温下放置 于 容量瓶中加入溶液,用.缓冲液稀释至刻度并摇匀, 配制成 /的溶液。在室温下放置后测定其荧光强度。 于 容量瓶中加入及溶液,用.缓冲液稀释至刻度并 摇匀,配制成含及均为 /的溶液。在室温下放置 后测定其 荧光强度。 于 容量瓶中加入溶液,用.缓冲液稀释至刻度并摇匀, 配制成 后测定其吸光度。 /的溶液。在室温下放置 ..竞争实验 于 容量瓶中依次加入溶液、一溶液,用醋酸缓冲液稀释至 刻度并摇匀,配置成空白对照液,其浓度见表。然后置恒温水浴在 恒温 后测定其荧光强度。 表 一体系空白对照液浓度 于 容量瓶中依次加入溶液、.溶液及探针溶液,用醋酸缓 冲液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。然后置恒温 水浴在 恒温 后测定其荧光强度。浙江工业大学硕士论文 表 体系竞争实验溶液浓度 于 容量瓶中依次加入溶液、溶液及探针溶液,用醋酸缓冲 液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。然后置恒温水 浴在 恒温 后测定其荧光强度。 表 .体系竞争实验溶液浓度? 测定时选用 激发光源,在~ 范围进行扫描。比色皿厚度为 。 ,狭缝宽度为浙江工业大学硕士论文 ..圆二色谱的测定 于 容量瓶中依次加入、溶液,用醋酸缓冲液稀释至刻度 并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。室温放置 后进行测定。 表 体系圆二色谱待测液浓度 于 容量瓶中依次加入一定量的溶液及溶液,用.缓 冲液稀释至刻度并摇匀,配置成待测液,其浓度见表。室温放置 后进行测 定。 表 .体系色谱待测液浓度 。 测定时,在 范围进行扫描。实验中使用的比色皿厚度为 .结果与讨论 ..荧光猝灭及其机理 蛋白质在. 有吸收,这种吸收主要是来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨 酸,所以蛋白质具有天然荧光。含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的蛋白质,最大 荧光发射约在~ 范围内。三种氨基酸中,色氨酸的荧光强度最强,对微 环境的变化最为敏感,所以研究溶液中蛋白质的构象变化时,常将其作为蛋白质 的内源荧光探针‘。浙江工业大学硕士论文 》??小们?一 / 图醋酸缓冲液条件下, 时,存在下荧光发射光谱? .. ./ /,至:,.,.,.,.,. 》一册粤???巴一上 图 时,存在下荧光发射光谱 缓冲液.条件下, .. . /,至:,,,,,, / 图为 ,醋酸缓冲液条件下,矢车菊素一葡萄糖菅存在时 的荧光发射光谱。图为 ,?缓冲液.条件下,异甘 草素存在下的荧光荧光发射光谱。从图和可知,随着矢车菊素..葡萄 糖苷及异甘草素浓度的增加,的荧光强度逐渐降低。这说明矢车菊素..葡 萄糖苷和异甘草素均与发生了相互作用,引起了荧光猝灭。 浙江工业大学硕士论文 假设猝灭过程为动态猝灭,则蛋白质等荧光体与荧光猝灭剂分子间的相互作 用可以用动态猝灭常数凰.猝灭常数来描述【。 /.】魅,【】 式中,凡是未加入药物前,溶液的荧光发射强度;为加入药物后,溶 液的荧光发射强度;为药物总浓度;岛为生物分子猝灭速率常数,/, 各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大猝灭速率常数约为.?/?;为 无猝灭剂时测得的荧光寿命,生物大分子的平均寿命约为~。 动态猝灭由于与扩散有关,温度升高时溶液黏度下降,同时分子的运动加速, 其结果将使分子的扩散系数增大,从而增大双分子猝灭常数。若 是静态猝灭,温 度升高可能引起配合物稳定度下降,则温度的升高将降低配合物 的稳定性,使猝 灭常数减小。因此,依据不同温度条件下的结果可以区别动态和 静态猝灭。 表醋酸缓冲液.条件下, 一的荧光强度 一 . 注:九庐眦浙:大学硕士论文 表 体系的荧光强度 .缓冲液.条件下, . 注:几。 . . . . ?? . . . . . . . . . 【】/ 图不同温度下猝灭的图./ /,.,.,.,.,.,.浙江工业大学硕士论文 . . . 弋. . . . . 【】?/ 图不同温度下猝灭的.图 . . / /,,,,,,, 根据表和中荧光校正后的数据,以凡肛对翻作图图和,由直线 的斜率求得猝灭常数愿,见表和。生物大分子的平均荧光寿命大 约为‘ 【】,可以求得双分子猝灭速率常数见表和。对于生物大分子, 各类 猝灭剂由扩散碰撞产生的最大猝灭常数为× /?。显然,.和对 的荧光猝灭速率均比扩散控制的凰大。由此推断,.和均是与 形成配合物,荧光猝灭过程属静态猝灭,而不是由分子碰撞所引 起的动态猝灭。 表 .?体系在醋酸缓冲液.条件下,不同温度时的猝灭常数 .浙江工业大学硕士论文 表 .体系在缓冲液.条件下,不同温度时的猝灭常数 . ..结合常数、结合位点数及热力学常数的确定 对于静态猝灭,假设蛋白分子对天然产物分子有个等同且独立的 结合部位,可采用以下公式进行计算结合常数和结合位点数【】: 。,伊 式中,和凡分别表示有和无猝灭剂时荧光体的荧光强度;为结合 常数;为 结合位点数;】为猝灭剂的浓度。 图不同温度下对荧光猝灭的双对数曲线 . / . .浙江工业大学硕士论文 旬 ? ,止】西。一 ?.. ?. . . . . 图不同温度下对荧光猝灭的双对数曲线 . / 】 . . 以隅.伊对作图,所得直线的斜率为结合位点数,由截距可求得 结合常数。与..和的结合常数和结合位点数的计算结果见表 和。在、、时,.与的结合位点数分别为.、.、 .,结合常数分别为.、.、.×;与的结合位 点数分别为.、.、.,结合常数分别为.、.、.。 这表明了与.和形成了:结合物,且结合能力较强。 药物与蛋白之间的结合力主要有氢键、范德华力、疏水作用及静 电作用四种, 可根据热力学参数来判断药物与蛋白之间的作用力类型。当温度 变化不大时,蛋 白与药物结合过程中的焓变脚、熵变?可由’ 方程确定。 .埘/心/ /?。 式中,为温度丁下的结合常数,为气体常数,取. 以对作图图、图,由直线的斜率和截距可计算反应的焓变 钟和熵变心。. . . . 厂 图不同温度下.与作用的’ 曲线 ’ . .一 . . . . . . ”. . . . . . 厂 图不同温度下与作用的’曲线 ’ . . . 蛋白与药物结合反应的自由能变?可由以下公式计算‘】: 一 式中,为温度下的结合常数,为气体常数。 根据结合反应前后热力学焓变?日和熵变?妒,可对药物与蛋白之间 的作用力类型进行判断‘】:钟、时为典型的疏水作用;//、 时,分子间作用力为氢键作用和范德华力;脚?或较小、?,时为静电作用。浙:..大学硕士论文 表不同温度下.一与相互作用的热力学参数 从表可见,.与作用过程中的脚,?.,证明了. 与之间的主要作用为氢键和范德华力。而?,则表明.与 的结合为自发过程。同样, 与作用过程中的脚,?.表。 表明了与之间的主要作用力也为氢键和范德华力。而?,则表明 与的结合为自发过程。 表不同温度下与相互作用的热力学参数..结合过程中牛血清蛋白结构的变化 从图可以看出,加入..后,的光谱的负峰峰高振幅基本 无变化。说明.与结合后,二级结构并未发生明显改变。 从图可以看出,加入后,的光谱的负峰峰高振幅减弱。说 明矢车菊素..葡萄糖苷与结合后,使二级结构发生改变,肽链舒张, 【.螺旋结构减少。浙江大学硕士论文 之一西。呈 击 击 旧/ 图 ..体系的圆二色谱. .斗/, ./ :..,. ? 】 ? . ?/ 图 体系的圆二色谱 . . /, :.. / 从图可以看到,随着..浓度的增大,酪氨酸残基时和色 氨酸残基?持时的特征荧光吸收峰产生猝灭。但是,与九时的 峰位置均无明显变化,这进一步说明了.与蛋白质结合后,蛋白质 二级结 构未发生明显变化。 从图可以看到,随着浓度的增大,酪氨酸残基?持时和色氨 酸残基?柠时的特征荧光吸收峰产生猝灭,和?时的峰位置稍 有蓝移,表明加入后,色氨酸和酪氨酸附近的微环境有所改变,疏 水性增加。浙江工业大学硕士论文 这意味着蛋白质二级结构发生一定的变化。 言 兰 墨 葛 自 。 言 / , 图 一体系的同步荧光光谱?扣丽 ?九 . 一 ?护 址 . 罂 岳 。 墨 宝 苎?一亡一??一 正 图 .体系的同步荧光光谱九?桶?九 .?扣 沁 . ..结合位点的确定 血清白蛋白的经典结合位置位于亚结构域 和 。本实验 选用保泰松和布洛芬作为探针,其中保泰松为 探针,布洛芬为 探针。 由于与结构极为类似序列比对结果相似性%,以 与保泰松、布洛芬结合方式作为探针位置的参考图。 浙江工业大学硕士论文 图保泰松探针在上的结合位点;布洛芬探针在上的结合位点【; . 浙江工业大学硕士论文 湖 八 瑚 抽 惯 伽 一协旦??。??一 豇 雹/ ??粤??巴一. / 图 探针存在下,.体系的荧光发射光谱 . ?. /,保张 /,至:.,.,.,.,.,.?/ .“/,布洛芬 /,至:.,.,.,.,.,. ./